CN100371343C - 鉴别叶用芥菜细胞质雄性不育基因的分子标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的鉴别叶用芥菜细胞质雄性不育基因的分子标记方法，包括以下步骤：提取叶用芥菜细胞质雄性不育系及其回交各世代基因组DNA，以其为模板，根据nap类型甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因orf222和pol型甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因orf224设计兼并引物，进行链式聚合酶反应，扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳在叶用芥菜细胞质雄性不育系及其回交各世代中检测不育分子标记的特征带。本发明首次在叶用芥菜细胞质雄性不育系回交各世代中检测叶用芥菜细胞质雄性不育的一个分子标记，为鉴别叶用芥菜细胞质雄性不育特异种质资源奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物分子标记技术，确切地说是一种鉴别叶用芥菜细胞质雄性不育特异种质资源的分子标记方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
随着分子生物学的发展，分子标记技术已成为辅助育种及鉴别特异种质资源的重要手段，利用分子标记辅助选择可以在育种早期如苗期进行鉴定；选择过程中不受环境等因素的影响。作物育种常用的分子标记有RFLP、RAPD、SSR以及SCAP标记等。该方法采用特异分子标记技术获得叶用芥菜细胞质雄性不育分子标记，并用于叶用芥菜细胞质雄性不育特异种质资源的筛选鉴定。
细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility)是植物中比较普遍的遗传现象，在作物杂种优势利用中有着重要应用价值。由于细胞质雄性不育不能产生正常的功能花粉，因此，利用雄性不育既可以省去人工去雄的手续，又可以保证杂交一代种子的纯度，同时它又是研究花粉发育、细胞质遗传和核质互作的良好的实验系统。十字花科作物存在着明显的杂种优势，目前杂种一代的生产主要是利用自交不亲和性和雄性不育性两种途径。细胞质雄性不育由于其理论上可以获得100％不育度和不育率的材料，因此，在十字花科作物优势育种利用中有着更广阔的前景，十字花科中许多重要的经济作物，如白菜、甘蓝、甘蓝型油菜等都选育出了综合性状良好的雄性不育系。
芥菜是中国的特产蔬菜，属于十字花科植物，在浙江和四川等地有着广泛的栽培，经济价值大，是重要的加工蔬菜，生产上存在病毒病严重和品质下降等问题，而杂种优势的利用可以改良现有芥菜品种的品质及提高抗性。由于芥菜类作物自交亲和指数非常高，生产上很难利用自交不亲和系进行杂种优势的利用。因此，芥菜类作物细胞质雄性不育的应用与理论研究有着重要意义，采用细胞质雄性不育获得杂种优势一直是育种研究的热点之一。迄今为止，在十字花科作物中，在生产上已经应用的细胞质雄性不育系主要有Ougra型的萝卜细胞质雄性不育系、Brassica nap型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系以及Brassica pol型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系。到目前为止，尚无叶用芥菜细胞质雄性不育基因的分子标记报道。
发明内容
本发明的目的是提供鉴别叶用芥菜细胞质雄性不育基因的分子标记方法。
鉴别叶用芥菜细胞质雄性不育基因的分子标记方法，包括以下步骤：
提取叶用芥菜细胞质雄性不育系及其回交各世代基因组DNA，以其为模板，根据nap类型甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因orf222和pol型甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因orf224设计兼并引物，进行链式聚合酶反应，扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳在叶用芥菜细胞质雄性不育系及其回交各世代中检测不育分子标记的特征带。
上述分子标记方法中所述的兼并引物，即人工合成的核苷酸分子是：
正向引物：5’-ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTT-3’
反向引物：5’-TCATCGAAATAGATCRAGKATYTC-3’，其中：R为G，A；K为G，T；Y为C，T
上述链式聚合酶反应(PCR)的具体步骤如下：
(1)首先将下列试剂混和在一起
10×Taq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)
模板DNA 1μl
正向引物(1.25μg/l) 0.4μl
反向引物(1.25μg/l) 0.4μl
脱氧核苷酸混合物(dNTP) 1μl
Taq DNA聚合酶 0.4μl
灭菌水 41.8μl
总体积 50μl
(2)将上述混和液94℃变性3分钟，然后进入下来循环：94℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，结果扩增到663的一条带。
(3)将扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测
本发明首次在叶用芥菜细胞质雄性不育系回交各世代中检测叶用芥菜细胞质雄性不育的一个分子标记，为鉴别叶用芥菜细胞质雄性不育特异种质资源奠定基础。
附图说明
图1叶用芥菜细胞质雄性不育分子标记在不育系及其回交各世代中的标记图；
图中1为叶用芥菜保持系；2为不育源；3为不育源与叶用芥菜F1代；4为回交一代(BC2)；5为回交三代(BC3)；箭头即为叶用芥菜细胞质雄性不育分子标记。
具体实施方式
实施例1
叶用芥菜细胞质雄性不育基因分子标记方法
叶用芥菜细胞质雄性不育系(Brassica juncea var.multiceps Tsen etLee)由本实验室提供，材料在浙江大学农业与生物技术学院园艺系蔬菜研究所种植。
(1)引物设计：根据Genebank数据库中Brassica nap型细胞质雄性不育相关基因orf222和Brassica pol型细胞质雄性不育相关基因orf224(orf222基因Genebank登录号：U10423，orf224基因Genebank登录号：S46795，均可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中查找到)设计兼并引物。人工合成的核苷酸分子：
正向引物：5’-ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTT-3’
反向引物：5’-TCATCGAAATAGATCRAGKATYTC-3’，其中：R为G，A；K为G，T；Y为C，T
(2)CTAB法提取植物总DNA
(a)取0.5g嫩叶于研钵中，液氮状态下研磨，加入600μl 65℃预热的2×CTAB，(30μl巯基乙醇混匀)，转移到离心管中，65℃保温1-2小时。
(b)加入等体积氯仿：异戊醇(24/1)轻轻摇匀，4℃，13000rpm离心，10分钟。
(c)取上清，重复(2)步骤一次。
(d)取上清于另一eppendorf管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，静置5分钟，13000rpm，离心10分钟。
(e)倒去上清，加入700μl Wash Buffer漂洗DNA沉淀，离心，重复一次。
(f)加15微升TE-Rnase，37℃保温1小时。
(g)加入2mol/L NaCl 100μl+100％乙醇250μl混匀，-20℃静置30min，13000rpm离心10分钟。
(h)倒去上清，加入500μl 70％乙醇，漂洗，倒去乙醇，重复一次，常温晾干。
(i)加入30-50μl ddH20或TE，回溶，-20℃保存备用。
注：2×CTAB配方，200μl：
CTAB： 4g
Tris(pH8.0)： 20ml
EDTA： 1.488g
NaCl： 16.352g
TE-RNase： 15μl TE加入1/100体积的RNase
Wash Buffer： 10mmol/L乙酸氨
76％乙醇
(3)链式聚合酶反应(PCR)的试剂
首先将下列试剂混和在一起
10×Taq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)
模板DNA 1μl
正向引物(1.25μg/l) 0.4μl
反向引物(1.25μg/l) 0.4μl
脱氧核苷酸混合物(dNTP) 1μl
Taq DNA聚合酶 0.4μl
灭菌水 41.8μl
总体积 50μl
(4)PCR反应条件：将上述混和液94℃变性3分钟，然后进入下来循环：94℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，。
(5)分子标记检测：扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(ethidiumbromide)中染色，紫外灯下观察，凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司产品)拍照记录，结果在叶用芥菜细胞质雄性不育系及其回交各世代中均能检测到该标记的存在，如图1箭头所示标记。
Claims (3)
1.一种人工合成的寡聚核苷酸引物对，其特征在于具有下列碱基组成的特定序列：
正向引物：5’-ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTT-3’
反向引物：5’-TCATCGAAATAGATCRAGKATYTC-3’，其中：R为G，A；K为G，
T；Y为C，T
2.一种鉴别叶用芥菜细胞质雄性不育基因的分子标记的方法，其特征是提取叶用芥菜细胞质雄性不育系及其回交各世代基因组DNA，以其为模板，根据nap类型甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因orf222和pol型甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因orf224设计权利要求1叙述的寡聚核苷酸引物对，进行链式聚合酶反应，扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳在叶用芥菜细胞质雄性不育系及其回交各世代中检测不育分子标记的特征带。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于链式聚合酶反应的具体步骤如下：
(1)首先将下列试剂混和在一起
10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5μl
模板DNA 1μl
正向引物(1.25μg/l) 0.4μl
反向引物(1.25μg/l) 0.4μl
脱氧核苷酸混合物(dNTP) 1μl
Taq DNA聚合酶 0.4μl
灭菌水 41.8μl
总体积 50μl
(2)将上述混和液94℃变性3分钟，然后进入以下循环：94℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，
(3)将扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
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| 胞质雄性不育性在叶用芥菜上的利用. Nikornpun，M.，N.Senapa.中国蔬菜，第1期. 2004 * |
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