CN104531693A - 水稻不育基因pms3的特异性功能标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，提供了水稻不育基因pms3的特异性功能标记及其应用。本发明根据引起水稻不育的pms3功能变化的单碱基突变，G-C差异位置的序列设计能特异扩增野生型C及突变型G的引物pms3-C和pms3-G，在3‘端位置引入一个错配以加强特异性，在其上游和下游分别设计一条正向引物pms3F、下游设计一条反向引物pms3R，通过验证，得到了水稻不育基因pms3的特异性功能标记的引物序列，利用该标记进行PCR扩增，电泳即能快速检测水稻模版中pms3的等位基因关系，可以应用与某些水稻两系不育系的提纯、两系杂交稻的纯度鉴定和两系不育系的选育，加快两系法育种进程。

Description

水稻不育基因pms3的特异性功能标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及水稻不育基因pms3的特异性功能标记及其应用。

背景技术

水稻是我国主要粮食作物，过半以上的人口以水稻为主要口粮。杂交水稻是水稻增产的主要方式，为我国粮食安全起到举足轻重的作用。其中，两系杂交稻与三系杂交稻相比，种子的生产程序简化了，而且充分利用籼粳杂种优势，就更有高产的潜力。但两系不育系的育性受温度和光照影响，在制种孕穗期遇到低温会自交结实，造成杂交种子纯度超标。因此，两系不育系的提纯、纯度鉴定以及两系杂交的纯度快速鉴定就十分重要。

华中农业大学张启发研究团队指出控制农垦58S不育的是一个长的非编码RNA，LOC_12g36030的转录本1即pms3，研究表明它一个长度为1236bp，且与长光照下特异的雄性不育相关的RNA分子LDMAR(long-day–specific male-fertility–associated RNA，非编码RNA为研究对象,此基因调控水稻中的光敏感雄性核不育,简称为LDMAR)，在长日照条件下，足够的LDMAR转录量是维持正常花粉发育所必需的，但由于一个单碱基突变造成LDMAR二级结构改变，导致了LDMAR在特异的长日照下转录量降低，造成正处于发育的花药提前程序化死亡，即产生PSMS(photoperiod-sensitive male sterility，温敏雄性不育)。

发明内容

本发明为了实现快速检测两系不育基因pms3的等位基因的目的，提供了水稻不育基因pms3的特异性功能标记及其应用。

水稻不育基因pms3的特异性功能标记，所述水稻不育基因pms3的特异性功能标记的引物序列为：

pms3F：ACCCGAAAACTTGCTACCAC

58S：TTTACTCTTGATGGATGGAACA

58：TTTACTCTTGATGGATGGTTGA

pms3R：GTACCTCGTCAAGCGACACA

在NCBI上下载了农垦58和农垦58S在pms3位点的序列，如下所示：

其中，全序列仅以下序列中存在一个单碱基差异G/C：

nongken 58s 768 AGCAAAGAAGTGCATTGTTTGTGTACCATCCATCAAGAGTAAAATTTTTATCAACACGC 826

nongken 58 768 AGCAAAGAAGTGCATTGTTTGTCTACCATCCATCAAGAGTAAAATTTTTATCAACACGC 826

根据引起pms3功能变化的单碱基突变，G-C差异位置的序列设计能特异扩增野生型C及突变型G的引物pms3-C和pms3-G，并在3‘端位置引入一个错配以加强特异性。

作为本发明的进一步改进，用pms3F、pms3R和58S引物扩增出529bp和322bp两条带，标志水稻品种pms3为突变型或杂合型。如果用pms3F、pms3R和58S引物能够扩增出529bp和322bp两条带，如图1所示，则标志着该水稻品种pms3为突变型或杂合型，图1采用的是遗传稳定的品种，所以桂科-2S为含有与农垦58S相同的不育等位基因。

作为本发明的进一步改进，用pms3F、pms3R和58引物扩增出529bp和322bp两条带，标志水稻品种pms3为野生型或杂合型；用pms3F、pms3R和58引物扩增出529bp一条带，标志水稻品种为含有与农垦58S相同的不育等位基因。如果用pms3F、pms3R和58引物能够扩增出529bp和322bp两条带，则标志着水稻品种pms3为野生型或杂合型，如图3所示。如果只能扩增出529bp，则标志着水稻品种为含有与农垦58S相同的不育等位基因。

采用以上两种技术方案，可根据不同的目的选用一种来应用。

作为本发明的进一步改进，所示水稻不育基因pms3的特异性功能标记采用以下步骤实施：

步骤1)：水稻基因组DNA提取；

步骤2)：PCR扩增：

PCR反应体系为10μL的体系：含1.0ul 10×Buffer，0.2ul dNTP，三种浓度为4mol/L的引物pms3F、pms3R和58S各0.5ul，0.1ul Taq酶，1.0ul模板DNA，ddH₂O补足10ul；

PCR反应程序为94℃预变性5min；然后94℃变性30s、55℃变性30s、72℃变性45s，循环35次；最后72℃延伸10min后得到扩增产物；

步骤3)：将扩增产物在质量比浓度为1.2％的琼脂糖凝胶中电泳，然后用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察拍照得到电泳图；

步骤4)：对电泳图进行分析，如果能将扩增出529bp和322bp两条带，则该水稻品种的不育基因pms3为突变型或杂合型。

作为本发明的进一步改进，所示水稻不育基因pms3的特异性功能标记采用以下步骤实施：

步骤A：水稻基因组DNA提取；

步骤B：PCR扩增：

PCR反应体系为10μL的体系：含1.0ul 10×Buffer，0.2ul dNTP，三种浓度为4mol/L的引物pms3F、pms3R和58各0.5ul，0.1ul Taq酶，1.0ul模板DNA，ddH₂O补足10ul；

PCR反应程序为94℃预变性5min；然后94℃变性30s、55℃变性30s、72℃变性45s，循环35次；最后72℃延伸10min后得到扩增产物；

步骤C：将扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，然后用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察拍照得到电泳图；通常采用的琼脂糖凝胶的质量比浓度为1.2％；

步骤D：对电泳图进行分析，如果能将扩增出529bp和322bp两条带，则该水稻品种的不育基因pms3为野生型或杂合型。

本发明还提供了水稻不育基因pms3的特异性功能标记在快速检测水稻两系不育基因pms3的等位基因中的应用。

本发明还提供了水稻不育基因pms3的特异性功能标记在不育系标记辅助选育中的应用。

本发明还提供了水稻不育基因pms3的特异性功能标记在桂科-2S亲本繁殖提纯中的应用，以及在桂两优2号纯度鉴定中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明根据引起水稻不育的pms3功能变化的单碱基突变，G-C差异位置的序列设计能特异扩增野生型C及突变型G的引物pms3-C和pms3-G，在3‘端位置引入一个错配以加强特异性，在其上游和下游分别设计一条正向引物pms3F、下游设计一条反向引物pms3R，通过验证，得到了水稻不育基因pms3的特异性功能标记的引物序列，利用该标记进行PCR扩增，电泳即能快速检测水稻模版中pms3的等位基因关系，可以应用与某些水稻两系不育系的提纯、两系杂交稻的纯度鉴定和两系不育系的选育，加快两系法育种进程。

附图说明

图1是本发明实施例农垦58S等位基因pms3扩增示意图；

图2是本发明实施例农垦58S等位基因pms3扩增48个品种的电泳图；

图3是本发明实施例农垦58等位基因pms3扩增示意图；

图4是本发明实施例农垦58等位基因pms3扩增48个品种的电泳图；

图5是本发明实施例水稻不育基因pms3的特异性功能标记在桂科-2S亲本繁殖提纯中的应用的电泳图；

图6是本发明实施例水稻不育基因pms3的特异性功能标记在桂两优2号纯度鉴定中的应用的电泳图。

图中标记，M—Marker2000。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

农垦58S等位基因扩增，包含以下步骤：

(1)水稻基因组DNA提取

选择48个水稻品种的植株，通过CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取水稻基因组DNA，48个水稻品种详见表1所示；

(2)PCR扩增

PCR反应体系为10μL的体系：含1.0ul 10×Buffer，0.2ul dNTP，三种浓度为4mol/L的引物pms3F、pms3R和58S各0.5ul，0.1ul Taq酶，1.0ul模板DNA，ddH₂O补足10ul；

PCR反应程序为94℃预变性5min；然后94℃变性30s、55℃变性30s、72℃变性45s，循环35次；最后72℃延伸10min后得到扩增产物。

(3)将扩增产物在质量比浓度为1.2％的琼脂糖凝胶中电泳，然后用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察拍照得到电泳图。

(4)对电泳图进行分析，如果能将扩增出529bp和322bp两条带，则该水稻品种的不育基因pms3为突变型或杂合型，基因型为GG或GC；48个水稻品种及标记检测基因型如表1所示，48个水稻品种的电泳图如图2所示，图中样本号为35的样本，即白圈标注的，为桂科-2S品种，其电泳图中含有529bp和322bp两条带，说明桂科-2S品种含两系不育基因pms3；这48个品种中，只有桂科-2S含有农垦58S相同的等位基因(不育基因)。

该模式多用于水稻两系不育系的选育中。

表1 48个水稻品种及标记检测基因型

注：A为电泳图中仅有529bp一条带；H为电泳图中含有529bp和322bp两条带。

实施例2

农垦58等位基因扩增，包含以下步骤：

(1)水稻基因组DNA提取

选择48个水稻品种的植株，通过CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取水稻基因组DNA，48个水稻品种详见表1所示；

(2)PCR扩增

PCR反应体系为10μL的体系：含1.0ul 10×Buffer，0.2ul dNTP，三种浓度为4mol/L的引物pms3F、pms3R和58各0.5ul，0.1ul Taq酶，1.0ul模板DNA，ddH₂O补足10ul；

PCR反应程序为94℃预变性5min；然后94℃变性30s、55℃变性30s、72℃变性45s，循环35次；最后72℃延伸10min后得到扩增产物。

(3)将扩增产物在质量比浓度为1.2％的琼脂糖凝胶中电泳，然后用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察拍照得到电泳图。

(4)对电泳图进行分析，如果能将扩增出529bp和322bp两条带，则该水稻品种的不育基因pms3为野生型或杂合型，基因型为CC或GC；如只扩增出529bp带而无322bp带，则该水稻品种含有农垦58S相同的不育等位基因。48个水稻品种及标记检测基因型如表1所示，48个水稻品种的电泳图如图4所示，48个水稻品种中，只有样本号为35的样本，即白圈标注的，为桂科-2S品种，只含有529bp带，其它的47个品种都含有529bp和322bp两条带；所以，这48个品种中，只有桂科-2S含有农垦58S相同的不育等位基因。

实施例3

水稻不育基因pms3的特异性功能标记在桂科-2S亲本繁殖提纯中的应用。

我们采用如实施例2所述的农垦58等位基因扩增模式，对桂科-2S繁殖的亲本单株取样，样本数为48个，对48个样本分别提取DNA，进行PCR扩增后电泳检测，当仅有529bp条带时，为桂科-2S亲本，当有529bp和322bp两条带时，为异品种或变异单株。

该实施例中PCR扩增为：PCR反应体系为10ul的体系，含1.0ul 10×Buffer，0.2ul dNTP，三种引物pms3F、pms3R和58各0.5ul 4mol.L^-1，0.1ul Taq酶，1.0ul模板DNA，ddH₂O补足10ul。PCR反应程序94℃5min，然后35个循环94℃30s，55℃30s，72℃45s，最后72℃延伸10min。扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照，结果如图5所示，图5中白圈标注的样本号为17和38的样本有529bp和322bp两条带，这两个样本为异品种或变异单株，应去除掉。

实施例4

水稻不育基因pms3的特异性功能标记在桂两优2号纯度鉴定中的应用。

我们采用如实施例2所述的农垦58等位基因扩增模式，对桂两优2号杂交稻单株取样，样本数为48个，对48个样本分别提取DNA，进行PCR扩增后电泳检测，电泳图如图6所示，当仅有529bp和322bp两条带时，为桂两优2号杂种；当只有529bp条带时，为自交结实的两系不育系桂科-2S。该方法能快速检测出桂两优2号杂交种中混入的两系不育系桂科-2S。

该实施例中PCR扩增为：PCR反应体系为10ul的体系，含1.0ul 10×Buffer，0.2ul dNTP，三种引物pms3F、pms3R和58S各0.5ul 4mol.L^-1，0.1ul Taq酶，1.0ul模板DNA，ddH₂O补足10ul。PCR反应程序94℃5min，然后35个循环94℃30s，55℃30s，72℃45s，最后72℃延伸10min。扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照，结果如图6所示，图6中仅白圈标注的1号样本只有529bp条带时，为自交结实的两系不育系桂科-2S。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.水稻不育基因pms3的特异性功能标记，其特征在于：所述水稻不育基因pms3的特异性功能标记的引物序列为：

pms3F：ACCCGAAAACTTGCTACCAC；

58S：TTTACTCTTGATGGATGGAACA；

58：TTTACTCTTGATGGATGGTTGA；

pms3R：GTACCTCGTCAAGCGACACA。

2.根据权利要求1所述的特异性功能标记，其特征在于：用pms3F、pms3R和58S引物扩增出529bp和322bp两条带，标志水稻品种pms3为突变型或杂合型。

3.根据权利要求1所述的特异性功能标记，其特征在于：用pms3F、pms3R和58引物扩增出529bp和322bp两条带，标志水稻品种pms3为野生型或杂合型；用pms3F、pms3R和58引物扩增出529bp一条带，标志水稻品种为含有与农垦58S相同的不育等位基因。

4.根据权利要求2所述的水稻不育基因pms3的特异性功能标记，其特征在于，采用以下步骤实施：

步骤1）：水稻基因组DNA提取；

步骤2）：PCR扩增：PCR反应体系为10μL的体系：含1.0 ul 10×Buffer，0.2 ul dNTP，三种浓度为4mol/L的引物pms3F、pms3R和58S各0.5 ul，0.1 ul Taq酶，1.0 ul 模板DNA，ddH₂O补足10ul；

步骤3）：将扩增产物在质量比浓度为1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，然后用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察拍照得到电泳图；

步骤4）：对电泳图进行分析，如果能将扩增出529bp和322bp两条带，则该水稻品种的不育基因pms3为突变型或杂合型。

5.根据权利要求3所述的水稻不育基因pms3的特异性功能标记，其特征在于，采用以下步骤实施：

步骤A：水稻基因组DNA提取；

步骤B：PCR扩增：

PCR反应体系为10μL的体系：含1.0 ul 10×Buffer，0.2 ul dNTP，三种浓度为4mol/L的引物pms3F、pms3R和58各0.5 ul，0.1 ul Taq酶，1.0 ul 模板DNA，ddH₂O补足10ul；

步骤C：将扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，然后用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察拍照得到电泳图；

步骤D：对电泳图进行分析，如果能将扩增出529bp和322bp两条带，则该水稻品种的不育基因pms3为野生型或杂合型。

6.根据权利要求4或5所述的特异性功能标记，其特征在于：所述PCR扩增过程中，PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s、55 ℃变性30 s、72℃变性45s，循环35次；最后72 ℃延伸10 min后得到扩增产物。

7.权利要求1至6任意一项所述水稻不育基因pms3的特异性功能标记在快速检测水稻两系不育基因pms3的等位基因中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述水稻不育基因pms3的特异性功能标记在桂两优2号纯度鉴定中的应用。

9.权利要求1至6任意一项所述水稻不育基因pms3的特异性功能标记在快速检测不育系标记辅助选育中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述水稻不育基因pms3的特异性功能标记在桂科-2S亲本繁殖提纯中的应用。