CN107418956B - 水稻光敏感核不育基因pms1的分离克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻光敏感核不育基因pms1的分离克隆及应用。pms1基因仅有一个转录本PMS1T，它是一个非编码长链RNA。该基因的不同等位基因之间存在65bp的插入/缺失变异以及两个单核苷酸突变。其中pms1显性等位基因的序列如SEQ ID NO:4所示，隐性等位基因的序列如SEQ ID NO:3所示。利用该插入/缺失变异及一个单核苷酸突变得到了水稻光敏感核不育基因pms1的两个分子标记。pms1显性等位基因能降低长日照下NIL(MH)结实率。超量表达全长或者截短的PMS1T也会降低长日照下NIL(MH)的结实率。光敏感核不育系农垦58S中抑制PMS1T的表达可以恢复农垦58S的育性。该基因的分离克隆对新的水稻光敏感核不育系的选育和改良具有重要利用价值。

Description

水稻光敏感核不育基因pms1的分离克隆及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻光敏感核不育基因pms1的分离克隆、功能验证及其在水稻改良中的应用。

本发明分离的pms1基因仅有一个转录本PMS1T，它是一个非编码长链RNA，不编码蛋白质。该基因的不同等位基因之间存在65bp的插入/缺失变异以及两个单核苷酸突变。其中pms1显性等位基因的序列如SEQ ID NO:4所示，隐性等位基因的序列如SEQ ID NO:3所示。利用该插入/缺失变异及一个单核苷酸突变得到了水稻光敏感核不育基因pms1的两个分子标记。pms1显性等位基因能降低长日照下NIL(MH)结实率，短日照下NIL(MH)结实率无影响。超量表达全长或者截短的PMS1T也会降低长日照下NIL(MH)的结实率。光敏感核不育系农垦58S中抑制PMS1T的表达可以恢复农垦58S的育性。该基因的分离克隆对新的水稻光敏感核不育系的选育和改良具有重要利用价值。

背景技术

杂交水稻充分利用水稻亚种间的杂种优势，极大地提高了水稻产量，为我国粮食安全做出了巨大的贡献。目前杂交水稻育种主要采用“三系”和“两系”法。三系法杂交水稻以核质互作雄性不育(CMS)为利用基础，育成雄性不育系、保持系和恢复系。雄性不育系无法自交产生种子，以保持系为父本与雄性不育系杂交能结实，并且后代拥有雄性不育的特征；恢复系与雄性不育系杂交产生可育杂交种子供生产应用。如此三系配套选育强优组合，并进行杂交种的生产。三系杂交稻技术成熟，在我国种植面积广泛，但也存在着一些应用局限。由于三系杂交稻不育胞质单一，受恢保关系的限制，配组不够自由，因此选育新组合的周期比较长。在生产中，其育种程序和生产环节比较复杂，导致种子生产的成本较高。而两系法杂交稻的出现，将杂交水稻应用推向了一个新的高度。光敏两系法是利用光敏感雄性核不育水稻的育性随光照长度改变的特性。光敏感雄性核不育水稻是1973年石明松在晚粳品种农垦58大田中发现的典型自然雄性不育株，研究表明该雄性不育株的育性受光照长度的影响，具有长日照条件下不育和短日照下可育的特性，这种光敏核不育粳稻后被统一命名为“农垦58S”(石明松.对光照长度敏感的隐性雄性不育水稻的发现及初步研究.中国农业科学，1985，2：44-48)。在生产实践中，利用光敏核不育水稻育性随光照长度转换的特性，在长日照不育期内，用作母本与父本品种在大田隔离区内相间种植进行杂交，配制杂交种；短日照可育期内，自交结实，繁殖不育系种子。由此一系两用，不育系与保持系合二为一，将“三系”育种简化为“两系”。两系法杂交稻相较于三系法杂交稻极大地简化了种子生产程序；而且恢复谱广，绝大部分品种都能恢复农垦58S的育性，配组自由。并且将农垦58S进一步选育，得到了许多籼型光敏核不育系。同一亚种内几乎所有的品种与光敏核不育系杂交F1代育性正常恢复，可以广泛利用水稻品种间杂种优势；同时，跟广亲和品种杂交，可培育籼粳亚种间杂交稻。在我国杂交稻总推广面积中，两系法杂交稻所占的比例逐年上升(斯华敏等.我国两系杂交水稻发展的现状和建议.中国水稻科学，2011，25：544-552)。

早期通过大量杂交组合的遗传分析表明，农垦58与农垦58S之间的育性分离由单基因控制(石明松.对光照长度敏感的隐性雄性不育水稻的发现及初步研究.中国农业科学，1985，2：44-48)，而农垦58S与其他品种杂交，多数表现为两对基因的分离(张端品等.农垦58S光敏感雄性不育基因的染色体定位.华中农业大学学报，1990，9：407-419；靳德明.光敏核不育性的遗传基础.李泽炳主编，光敏和不育水稻育性转换机理与利用研究，湖北科学技术出版社，湖北武汉，1995，181-252.)。利用RFLP分子标记分析技术，Zhang等(1994)将这两个基因定位于水稻第7和第3染色体上，分别命名为pms1、pms2，其中pms1的效应约为pms2的2-3倍(Zhang Q et al.Using bulked extremes and recessive class to map genesfor photoperiod sensitive genic male sterility in rice.Proc Natl Acad SciUSA,1994,91:8675-8679)。进一步研究表明控制农垦58与农垦58S之间的光敏核不育性状的位点为pms3(Mei M et al.pms3is the locus causing the original photoperiod-sensitive male sterility mutation of‘Nongken 58S’.Science in China(series C)，1999，42：316-322)。并且双因子方差分析表明pms1和pms3之间存在极显著的互作效应，任何一个位点为纯合可育位点即表现为可育(Mei M et al.Mapping and genetic analysisof the genes for photoperiod-sensitive male sterility in rice using theoriginal mutant Nongken 58S.Crop Science，1999，19：1711-1715)。

分离克隆这些控制光敏核不育性状的基因，阐明其作用机理，将有助于更好地研究和利用光敏雄性不育特性，有目的性、针对性地改良和创造优良的光敏雄性不育系，提高两系杂交稻产量和品质，对生产应用具有巨大的指导意义。同时，也将为其他存在有光敏核不育现象的作物，如小麦和棉花等的生产利用提供线索和思路。

发明内容

本发明的目的是分离克隆一个pms1位点控制水稻光敏感核不育基因的DNA片段，分析该片段的序列特征，对该片段进行功能验证及作用机理阐述；该基因是一个长链非编码RNA，通过小RNA发挥作用；提出根据该基因序列产生的分子标记及其在水稻分子标记辅助选择育种中的应用。

本发明涉及分离和应用一个包含pms1位点的DNA片段，并对该片段的作用机理进行阐述。这一段序列如SEQ ID NO:1-2所示。本发明涉及分离和应用编码长链RNA的光敏感核不育基因pms1，这个基因具有如SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列，或者基本上相当于SEQ ID NO:3-4所示的高度同源基因序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因，或者其功能相当于SEQ ID NO:3-4所示序列的部分片段。本发明的pms1基因具有两种等位基因，序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，其中SEQ IDNO:3比SEQ ID NO:4少了65bp(见序列表SEQ ID NO:5)。

本发明在分离克隆光敏核不育基因pms1的过程中，通过多次回交，构建了以农垦58S为受体、明恢63为供体的近等基因系NIL(MH)。NIL(MH)植株外观与农垦58S相似，但是其育性在不同光照长度下均为完全可育。将来自农垦58S的包含pms1基因的DNA片段SEQ IDNO:2通过遗传转化的方法导入到NIL(MH)中，导致其育性在长日照条件下降低，短日照条件下无影响。结合另一光敏雄性不育位点pms3的应用，可用于培育新的两系不育系。同时，超量表达SEQ ID NO:4片段，也会降低NIL(MH)的育性。因此，在实际运用中，可在该段序列前面加上任何一段强启动子或者诱导型启动子。

可根据本发明pms1位点的两个等位基因之间的序列差异来设计分子标记。来自明恢63的pms1基因的DNA序列与农垦58S相比，除了两个单碱基突变外，还包括一处65bp长的序列缺失。利用其中一个单碱基突变和这段大片段缺失开发分子标记，可用于转基因单株及杂交后代基因型检测，也方便分子标记辅助选择育种。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的来自明恢63包含有pms1基因的DNA片段序列(全长5,682bp，包含启动子和5’及3’非转录调控区)。

序列表SEQ ID NO:2显示的是本发明分离克隆的来自农垦58S包含有pms1基因的DNA片段序列(全长5,695bp，包含启动子和5’及3’非转录调控区)。

序列表SEQ ID NO:3显示的是本发明分离克隆的来自明恢63的pms1基因的转录区的核苷酸序列(全长1,388bp，不含内含子即intron，不编码蛋白质)。

序列表SEQ ID NO:4显示的是本发明分离克隆的来自农垦58S的pms1基因的转录区的核苷酸序列(全长1,453bp，不含内含子即intron，不编码蛋白质)。

序列表SEQ ID NO:5是本发明制备的鉴定pms1基因的等位显性基因或等位隐性基因的分子标记2的核苷酸序列。序列长度为65bp。

图1：农垦58S/明恢63BC₅F₂群体长日照和短日照下的表型。附图标记说明：

图1中A图：大田长日照和短日照条件下，农垦58S和近等基因系水稻NIL(MH)的整株株型。

图1中B图：大田长日照和短日照条件下，开花期农垦58S和近等基因系水稻NIL(MH)的碘染花粉。

图1中C图：亲本及群体的三种基因型在长日照下的小穗形态。其中图1中的左图展示两个亲本明恢63(左)和农垦58S(右)的小穗育性；图1中的右边3张图分别为群体中58S纯合基因型、杂合基因型和明恢63纯合基因型单株的各种典型的小穗形态。

图1中D图：BC₅F₂群体中三种基因型单株的结实率分布图。

图2：pms1位点精细定位图。附图标记说明：

图2中A图：重组单株在各个分子标记处的重组交换情况。

图2中B图：分子标记P3和P9对应区间内的基因注释。基因结构示意图中的黑色方块代表外显子即exon，黑线代表内含子即intron，箭头指示基因的方向。

图2中C图：分子标记P4和P7对应区间内明恢63和农垦58S基因组序列比较。竖线代表单核苷酸碱基多态性，黑色三角块代表片段插入。

图2中D图：互补转化载体58S-C的外源片段在基因组上的位置。

图3：互补载体58S-C及MH-C的构建过程示意图。

图4：58S-C转基因T₁代家系中阴性单株与阳性单株结实率比较。附图标记说明：

图4中A图：长日照下58S-C转基因T₁代家系中阴性单株与阳性单株整株。

图4中B图：短日照下58S-C转基因T₁代家系中阴性单株与阳性单株整株。

图4中C图：长日照下58S-C转基因T₁代家系中阴性单株与阳性单株小穗。

图4中D图：短日照下58S-C转基因T₁代家系中阴性单株与阳性单株小穗。

图4中“-”表示转基因阴性，“+”表示转基因阳性。

图5：基于亲本间PMS1T序列差异开发的分子标记检测胶图。附图标记说明：

图5中A图：基于明恢63与农垦58S之间PMS1T序列在P6处的差异开发分子流程图及检测胶图。

图5中B图：基于明恢63与农垦58S之间PMS1T序列在SNP S2处的差异开发分子流程图及检测胶图。其中加粗的字母为SNP S2处的碱基，6个相连字母下的横线分别标明限制性内切酶SpeI在明恢63中的识别位点，及在农垦58S中对应的碱基序列。星号示意省略的基因组序列。

图6：PMS1T抑制表达载体dsi构建流程图。

图7：PMS1T抑制表达载体dsi转化农垦58S转基因单株表型。附图标记说明：

图7中A图：长日照和短日照下58S-dsi转基因T₁代家系中阴性单株与阳性单株整株。

图7中B图：长日照和短日照下58S-dsi转基因T₁代家系中阴性单株与阳性单株小穗。

图7中的“-”表示转基因阴性，“+”表示转基因阳性。

图8：PMS1T超量表达载体Ubi:S和Ubi:S-T构建流程图。

图9：PMS1T超量表达载体转基因后代单株长日照下的小穗表型。附图标记说明：

图9中左图：超量表达载体Ubi:S转基因T₁代单株阴性单株与阳性单株小穗。

图9中右图：超量表达载体Ubi:S-T转基因T₁代单株阴性单株与阳性单株小穗。

图9中：“-”表示转基因阴性，“+”表示转基因阳性。

图10：明恢63和农垦58S中PMS1T预测的ORF示意图。附图标记说明：红色方框代表ORF1，粉红色方框代表明恢63中的ORF2，黄色方框代表农垦58S中的ORF2，蓝色方框代表ORF3；红色显示的碱基是SNP S2，蓝色显示的碱基是SNP S1，短横线代表P6处缺失的碱基，末尾的省略点代表序列的省略，该省略处的碱基序列在明恢63和农垦58S中完全一样。

图11：58S-ORF1+G，58S-ORF2+G和58S-ORF3+G转基因T₁代单株长日照下的小穗表型。附图标记说明：

图11中：“-”表示转基因阴性，“+”表示转基因阳性。

图12：PMS1T基因在长、短日照下农垦58S和NIL(MH)全生育期不同组织中的表达量分析。附图标记说明：泳道编号1-16分别代表水稻不同发育时期的不同组织：其中泳道：1，分蘖期叶片；2，雌雄蕊形成期叶片；3，雌雄蕊形成期倒二节间；4，雌雄蕊形成期叶片叶鞘；5，剑叶；6，小孢子发育晚期倒二节间；7，剑叶叶鞘；8，二次枝梗分化期幼穗(<0.5cm)；9，雌雄蕊形成期幼穗(0.5-1.0cm)；10，花粉母细胞时期形成期幼穗(1.0-2.0cm)；11，小孢子减数分裂期小花(3.0-4.0mm)；12，花粉母细胞减数分裂四分体时期小花(4.0-4.5mm)；13，小孢子形成期小花(4.5-5.0mm)；14，小孢子晚期小花(5.0-6.0mm)；15，二细胞花粉形成期小花(6.0-7.0mm)；16，花粉成熟期花药。

具体实施方式

以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有pms1基因的pms1位点以及揭示基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：分离克隆包含有pms1基因区段的DNA片段

1.利用图位克隆技术确定控制水稻光敏感核不育基因pms1

本发明中准备定位群体时用到了两个亲本：光敏感核不育系农垦58S(李泽炳等，《光敏感核不育水稻育性转换机理与应用研究》，湖北科学技术出版社的，湖北武汉，1995版)和明恢63(三明市农业科学研究院选育，公开应用的水稻品种)。明恢63是典型的籼稻品种。以农垦58S为轮回母本与明恢63进行杂交，多次回交后得到农垦58S/明恢63BC₅F₂随机群体6848株用于光敏感核不育基因pms1的精细定位。将这些单株在正季长日照下种植于武汉华中农业大学的试验田，并且将所有单株的叶片按照常规报道的CTAB法提取水稻总DNA，对pms1区段的分子标记进行重组交换分析。总DNA的抽提按Murray和Thompson(Murray M.G.,Thompson W.F.1980，Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.NuclAcids Res.8:4321-4325)的CTAB法进行。

基于华中农业大学作物遗传改良国家重点试验试验室前期研究结果，选取分别位于pms1的两侧的SSR标记Fssr和pj23对6848个F₂单株进行筛选(Liu N etal.Identification of an 85-kb DNA fragment containing pms1,a locus forphotoperiod-sensitive genic male sterility in rice.Mol Gen Genomics 2001,266(2):271-275)，共得到88个在分子标记之间发生重组交换的单株。对该F2群体进行分析发现pms1区段杂合基因型的单株结实率与农垦58S纯合基因型的单株的结实率之间存在重合的情况，即部分杂合基因型单株的结实率很低，与农垦58S相似(图1)，表明农垦58S中pms1调控的光敏感雄性不育是显性的，与以往遗传分析认为光敏感雄性不育性受隐性基因控制的结论不同。因此，我们仅选取这88个重组单株中重组情况表现为杂合基因型与明恢63纯合基因型之间的交换用于进一步的精细定位。结果显示光敏感核不育基因pms1被限定在分子标记P4和P6之间约4.0kb的DNA区段内，两端各有一个重组单株，详细定位结果见图2中A图和B图；其中部分重组单株的信息如表1所示。水稻单株结实率考察方法：稻穗成熟后取每个单株的3个主穗分别考察实粒数和空壳数(两者之和为总粒数)，单株结实率为实粒数占总粒数的百分比。花粉碘染方法：水稻开花盛期时，从每株不同分蘖上挑选即将开花的小花，保存于75％的乙醇中。用镊子挑出6朵小花的花药，滴加1％的I2-KI，碾碎后，加上盖玻片，于显微镜下镜检、拍照。

互补遗传转化载体的构建

为了验证候选DNA序列的功能，我们采用基因自身启动子进行互补转化的方式来进一步确定基因的功能，将来自于明恢63和农垦58S的包含有pms1区段的基因组序列分别转化到农垦58S和近等基因系NIL(MH)中(所述的构建水稻近等基因系的方法按照常规方法，，申请人将所得到的近等基因系命名为水稻NIL(MH)，Oryza sativa L.NIL(MH)，于2016年5月12日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:P201612)。互补载体具体构建方法如下：用PstI与SacI双酶切明恢63编号为21O9(GenBank:DQ989628)的BAC(细菌人工染色体)，将其中5,682bp大小的基因组片段通过挖胶回收，再连接到酶切好的pCAMBIA1301载体上，构建好的载体命名为MH-C，包括了完整的4.0kb定位区间。同时，采用高保真、适于扩增长片段的DNA聚合酶用引物58S-C-F与58S-C-R进行配对扩增农垦58S的基因组序列，获得5,954bp长的PCR产物，同样采用PstI与SacI双酶切后得到5,695bp的片段，连接到pCAMBIA1301载体上，命名为58S-C。MH-C与58S-C载体包含的外源片段DNA序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，它们在基因组上的位置参见图2中的D图。载体构建流程图参见图3。

本发明中使用的载体pCAMBIA1301由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for theApplication of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠。构建载体过程中使用的限制性内切酶和DNA聚合酶均购自宝生物工程大连有限公司，DNA连接酶购自Promega公司。构建好的载体电转到农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)超毒力菌株EHA105中，用于水稻遗传转化。构建载体58S-C涉及到的引物序列如下：

58S-C-F：5’-ATGAAGGACCGAGAAGAAGC-3’

58S-C-R：5’-GTTCTCAGATGATATGGAACTGTG-3’

表1利用pms1区段的分子标记对重组单株进行的基因型分析(部分数据)

表1说明：M代表明恢63纯合基因型；H代表杂合基因型；标示斜体粗体字母的灰色背景区域为发生重组的位置。

2.互补遗传转化与转基因植株表型分析

采用农杆菌介导的遗传转化方法分别将携带有载体MH-C和58S-C的农杆菌侵染农垦58S和NIL(MH)的愈伤组织。本申请中使用的水稻遗传转化方法参照本实验室林拥军老师的先前报道方法进行(林拥军，2001.农杆菌介导的水稻转基因研究。中国博士学位论文全文数据库http://www.cnki.net)或参照华中农业大学在先申请的水稻基因专利或基因应用专利的文献。

在本实施例中，将载体58S-C转化NIL(MH)共获得了79株转基因T₀代独立转化单株，收获种子后，将T₁代分别种植于武汉大田长日照和短日照下，用于鉴定基因型和考察结实率。采用分子标记P6(见实施例3)来鉴定转基因植株的基因型。在长日照下，T₁代家系的基因型与表型完全共分离，具体表现为相对于转基因阴性单株，阳性单株结实率显著降低；而在短日照下，转基因阴性和阳性单株之间的育性并没有明显的区别，均表现为可育(参见图4)。以其中一个家系的情况为例：长日照下，23株阳性植株平均结实率为37.61±4.19％，7株阴性单株平均结实率为77.22±1.08％，统计学t检验发现阳性植株与阴性植株之间的结实率存在极显著差异(P＝0.0000)；短日照下，24株阳性单株和4株阴性单株的平均结实率分别为55.49±1.64％和59.69±2.94％，两者之间没有显著差异(t测验的P值为0.3309)。上述结果表明58S-C载体携带的外源片段能够降低受体NIL(MH)的育性，并且这种效应只在长日照下发挥作用，说明遗传转化片段包含有控制光敏感雄性不育的pms1基因。

另一方面，将MH-C转化农垦58S获得了47株转基因T₀代独立转化单株，按照前述方法分析T₁代家系的表现型。长日照下，25株阳性植株平均结实率为2.16±0.56％，5株阴性单株平均结实率为0.81±0.25％，不存在显著性差异(P＝0.2992)；短日照下，14株阳性单株和10株阴性单株的平均结实率分别为63.26±2.70％和66.52±3.63％，也没有显著差异(P＝0.4691)。该结果说明来自于明恢63的包含有pms1位点的基因组不能恢复长日照下农垦58S的育性。

本实施例的遗传转化结果表明，来自于光敏感核不育系农垦58S中含有pms1基因的DNA片段能够使育性不随光长改变的NIL(MH)具有光敏感核不育的特性。

实施例2：pms1基因全长cDNA的获得

实施例1将水稻光敏感核不育基因pms1定位在分子标记P4和P6之间，在明恢63基因组中的物理距离为4.0kb，遗传转化实验也证实该区间内确实包含有候选的pms1基因。在Rice Genome Annotation Project网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上查看该区间内的基因注释结果，发现该区间内并不包含有完整的预测基因，且相离最近的左右侧两个基因均为反转座子蛋白(图1)，预示着pms1基因很可能拥有一个全新的，未知功能的转录本。

为了全面注释该区间内存在的基因，设计了覆盖该区间的一系列引物，以农垦58S和NIL(MH)幼穗分化V期的幼穗RNA反转录产物为模板，将这些引物进行配对扩增，发现确实存在有未被预测到的新转录本。因此，进一步采用Clontech公司的SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit来分离确定pms1候选基因的mRNA 5’和3’端以及全长cDNA。选取长日照下大田中生长的农垦58S和NIL(MH)花粉母细胞形成期的幼穗，按照Invitrogen公司的RNA抽提试剂盒说明书提取水稻总RNA，于-70℃保存。前期样品处理完全根据SMART^TM RACEcDNA Amplification Kit说明书完成，并且按照要求设计了基因特异引物用于巢式PCR扩增。分离5’端时第一轮PCR扩增采用引物RACE5-1与试剂盒提供的接头引物UPM配对；第二轮PCR扩增采用引物RACE5-2与接头引物NUPM配对。进行3’-RACE时，第一轮和第二轮PCR扩增分别采用引物RACE3-1与UPM及RACE3-2与NUPM配对。扩增得到的PCR产物经过挖胶回收，通过TA克隆到pGEM-T载体(购自Promega公司)中，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序验证，与pms1基因组序列比对，确定转录本的5’和3’端。再根据该结果扩增EST序列，测序分析后确定mRNA的序列。结果表明，在pms1定位区间内有且仅有一条转录本，位于正义链上，并且没有intron(图1)。来自于农垦58S的转录本全长1,453bp(详见SEQ ID NO:4)，明恢63的转录本全长1,388bp(详见SEQ ID NO:3)。我们将该转录本命名为PMS1T。本实施例涉及到的引物序列如下：

RACE5-1：5’-CTGATGACTGTGTTCCAGTATTTG-3’

RACE5-2：5’-ACGCAAGCTTGGCTCTTTGTT-3’

RACE3-1：5’-CAATTTTGCCTGGTATCACCAA-3’

RACE3-2：5’-CAACATCATTAGGTTGCTGTGAT-3’

实施例3：光敏感雄性不育基因pms1分子标记的设计

比较分析分子标记P4与P7之间的序列，发现农垦58S与明恢63之间共有四处序列差异，除了共分离分子标记P5位于PMS1T的启动子区外，其余三处均位于PMS1T的转录本上。PMS1T的启动子区存在一段AT重复序列，其中在农垦58S中重复数为14，明恢63中的重复数为40，根据此差异可设计共分离SSR分子标记P5，该标记也曾使用并被命名为Rssr(Liu Net al.Identification of an 85-kb DNA fragment containing pms1,a locus forphotoperiod-sensitive genic male sterility in rice.Mol Gen Genomics 2001,266(2):271-275)。用于该标记检测的引物为P5-F和P5-R。

比较分析来自于明恢63和农垦58S的PMS1T核苷酸序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，共有三处序列差异：位于第106bp处和第437bp处的单碱基序列差异(SNP)及第507bp开始的65bp长度的序列缺失，分别命名为S2，S1和P6(见图2中C图)。在P6处，相对于农垦58S，明恢63缺失了65bp，利用该差异开发了Indel(insertion/deletion，插入/缺失)标记P6(图5中A图)。PCR反应体系如下：DNA模板1μl，10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)1.5μl，2mM dNTP 1μl，10uM引物(F/R)各0.2μl，rTaq酶0.2μl(宝生物工程大连有限公司5U/μl)，加双蒸水至终体系为15μl，使用的引物对为P6-F和P6-R。PCR扩增反应程序设置如下：94℃，3min；94℃，30sec；57℃，30sec；72℃，30sec；35cycles；72℃，7min，降至25℃结束反应。PCR扩增产物在明恢63和农垦58S的长度分别为354bp和419bp，可采用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。基于65bp差异设计的Indel标记P6除了可用于鉴定pms1转基因阳性和阴性单株之外，还可用于分子标记辅助选择育种。P6标记检测明恢63和农垦58S基因型流程图及胶图见图5中的A图，可清晰区分和读取两种基因型。

在SNP S2位置，明恢63中的碱基G(见括号中的斜体G)(CTACTAGTGT)突变为农垦58S中的碱基T(见括号中的斜体T)(CTACTATTGT)，结合附近序列分析，发现此突变位点正好落在限制性内切酶SpeI的识别位点ACTAGT上，突变后农垦58S中就丢失了SpeI的识别位点。利用SNP S2的差异可以开发成CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic sequence)标记。具体方法为：先以基因组DNA为模板进行常规PCR扩增，引物为S2-F和S2-R，PCR反应体系和程序与前面P6扩增方法相同；再对PCR产物进行酶切检测，酶切体系如下：PCR产物5μl，10×Mbuffer 1μl，SpeI限制性内切酶0.3μl(TaKaRa 10U/μl)，加双蒸水至终体系为10μl，37℃酶切2小时或过夜。PCR扩增产物及酶切产物均可用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。在明恢63和农垦58S中的PCR扩增产物长度均为390bp，由于明恢63的扩增片段中存在SpeI的识别位点，将被酶切成266bp和124bp大小的两条带；而农垦58S片段中不存在该限制性内切酶的识别位点，电泳结果仍然显示390bp大小的单条带。该标记检测方法及胶图见图5中的B图。

SNP S1处的单碱基差异无法开发成CAPS或者dCAPS标记，但可用测序的方法检测该SNP位点处的碱基。

由于SNP S2与标记P5和P6之间的物理距离都非常近，而在实际应用中，相较于CAPS标记，SSR和Indel标记使用更为方便和经济，后两者仅需直接检测PCR产物长度即可，不需要进一步进行酶切反应，更为省时省力省钱；但是SNP S2的CAPS标记是PMS1T的共分离标记，准确性更高，而且与基因功能直接相关。因此，在实际应用中，可根据目的灵活选择这三个分子标记进行运用。

分子标记P5引物序列如下：

P5-F：5’-AGGCGCAGTAAAAACACCTG-3’

P5-R：5’-CTTGCGTGGTTTCAAGGG-3’

分子标记P6引物序列如下：

P6-F：5’-CATTAGGCGGAGATGGCAAT-3’

P6-R：5’-ATAGCCAACACTCATCACTGTCG-3’

分子标记S2引物序列如下：

S2-F：5’-GACTACATGGGCACCCCTTGAA-3’

S2-R：5’-ACCTGGCATAGACCGATAGTTAC-3’

实施例4：PMS1T基因抑制表达和超量表达载体构建与转基因植株的表型分析

本实施例中，申请人构建了超量表达和抑制表达的载体，并进行了遗传转化。抑制表达载体的构建过程如下：根据已分离得到的PMS1T基因全长cDNA序列，利用各种网站预测信息，确定该序列中更易形成dsRNA的区间，针对该区段设计引物对即dsi-F和dsi-R。分别以农垦58S及NIL(MH)花粉母细胞形成期幼穗RNA反转录的cDNA为模板，使用上述该对引物进行扩增，回收PCR产物后经过KpnI与BamHI双酶切连到pDS1301载体上【pDS1301载体是华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的袁斌改造而成的双链RNA抑制载体(Yuan B etal.Mitogen-activated protein kinase OsMPK6negatively regulates rice diseaseresistance to bacterial pathogens.Planta 2007,226(4):953-960)】。连接产物转入大肠杆菌，经过质粒抽提及测序验证，找到无突变的阳性克隆，使用SpeI和SacI进行双酶切，再与同样经过了SpeI和SacI双酶切的dsi-F与dsi-R扩增PCR产物进行连接，完成第二链的连接。最终构建完成的双链RNA抑制载体dsi分别用于转化不同的受体材料。载体dsi的构建流程图及结构图参见图6。

利用双链RNA抑制载体转化农垦58S愈伤组织，获得转基因T₀代植株(命名为58S-dsi)后，收种，在中国.湖北省武汉市长日照和短日照下分别种植T1代家系，用于考察基因型与结实率的共分离情况。使用引物对PMCG-F与PMCG-R进行PCR扩增检测转基因植株的阴性和阳性，结果显示T₁代植株的基因型与表型完全共分离。以其中一个T₁代转基因家系结果为例：长日照下，13株阳性单株平均结实率为72.18±4.36％，5株阴性单株平均结实率为8.35±0.57％，t检验存在极显著差异(P＝0.0000)；短日照下，9株阳性单株平均结实率为73.64±2.11％，4株阴性单株平均结实率为71.37±3.90％，两者之间没有显著差异(P＝0.5884)。该结果表明，抑制农垦58S中PMS1T的表达能够恢复其在长日照下的育性，参见图7。

反之，以双链RNA抑制载体转化NIL(MH)愈伤组织得到的T₁代家系(命名为MH-dsi)中，长日照下阳性单株和阴性单株的平均结实率分别为90.57±0.74％和91.68±1.17％(P＝0.5884)；短日照下阳性单株和阴性单株的平均结实率分别为77.42±0.94％和76.17±1.66％(P＝0.4929)。无论长日还是短日条件下，抑制NIL(MH)中PMS1T的表达对育性均没有影响。

本实施例中，构建超表达载体的具体步骤如下：根据pms1基因的全长cDNA序列(如序列表SEQ ID NO:4所示)设计引物OX-1F和OX-1R，以农垦58S基因组序列为模板，扩增pms1基因，然后用KpnI和BamHI双酶切，连接到超表达载体pU1301上。【pU1301载体由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的邱德运改造(Qiu D et al.OsWRKY13mediates ricedisease resistance by regulating defense-related genes in salicylate-andjasmonate-dependent signaling.Mol Plant Microbe Interact 2007,20(5):492-499)】，将玉米ubiquitin基因启动子构建到pCAMBIA1301载体中，使目标基因片段在ubiquitin的启动子启动下进行组成型表达。将此构建好的超表达载体Ubi:S用来转化NIL(MH)愈伤组织。超表达载体Ubi:S构建流程图见图8。获得转基因植株，采用分子标记P6来鉴定转基因植株的阴性和阳性，在长日照下种植，考察基因型与结实率的共分离情况，发现基因型与表型完全共分离。具体表现为：T₁代家系中24株阳性单株平均结实率为0.39±0.13％，16株阴性单株平均结实率为73.34±1.67％，两者存在极显著差异(P＝0.0000)。该结果表明在NIL(MH)中超表达农垦58S的PMS1T基因能够显著降低NIL(MH)的育性(参见图9中左图)。另外，改用引物OX-1F和OX-3R进行扩增，得到截短的PMS1T基因，该段序列长度为691bp，从PMS1T转录起始位点开始到P6标记后面的一段序列。然后采用与载体Ubi:S相同的构建方法(该载体命名为Ubi:S-T，构建流程图见图8)及转基因受体进行遗传转化，得到的转基因植株基因型与表型完全共分离，也表现出与Ubi:S转化同样的效应(参见图9中右图)，说明在NIL(MH)中超表达农垦58S PMS1T基因并不需要完整的转录本也能发挥效应。

在NIL(MH)中，无论是互补还是超表达来自于农垦58S的PMS1T基因均能够降低育性，比较实施例1-3与本实施例结果发现，超表达的效应要大于自身启动子的互补转化。

本实施例中涉及到的引物序列如下：

dsi-F：5’-TCGACTAGTTGGCAGGGTACCTGTACATGCCCAACAAGCTCT-3’

dsi-R：5’-GGCGAGCTCGGATCCTGTTCGCATGGACAATTGGTG-3’

PMCG-F：5’-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3’

PMCG-R：5’-CTGAGCTACACATGCTCAGGTT-3’

OX-1F：5’-TATGGTACCGACTACATGGGCACCCCTTGAA-3’

OX-1R：5’-TATGGATCCCGTGATTCAGCAGGTGGAGTTAA-3’

OX-3R：5’-TATGGATCCCCGTAAACAATTATCGGTGATA-3’

实施例5：光敏感核不育基因PMS1T是一个不编码蛋白质的长链RNA

基因预测表明PMS1T是一个新的转录本，位于基因间区.为了进一步研究PMS1T发挥功能的作用形式，采用生物信息学的方法分析PMS1T基因序列，发现该基因共编码3个小于100aa的短肽，具体位置参见图8。PMS1T预测编码的ORF1和ORF3在农垦58S和明恢63中序列完全一样，分别编码44和51个氨基酸长度的短肽；ORF2在明恢63中编码101aa的短肽，但在农垦58S中由于分子标记P6处多出来的65bp导致翻译提前终止，仅编码54aa长的短肽；同时，在明恢63中，ORF2与ORF3有部分序列重叠。这些预测的短肽在PMS1T上的位置参见图10。在蛋白质数据库中搜索比较分析，发现这几个预测的ORF都不存在与之同源程度较高的蛋白质，结合该基因在基因组中的位置，申请人推测PMS1T不编码蛋白质，可能是在RNA水平上发挥作用。为了验证这一假设，重新构建了3个载体用于遗传转化验证分析。核心思路是在PMS1T基因中预测为编码ORF的起始密码子ATG序列后面插入一个碱基G，导致整个氨基酸读码框发生改变，编码蛋白质序列完全变化，但是RNA序列变化甚微。用于改造的基本载体是58S-C，具体方法如下：以载体58S-C质粒为模板，分别用引物对ORF1G-R/ORF1G-muF与ORF1G-F/ORF1G-muR扩增PMS1T基因部分片段，将这两个PCR产物等量混合后作为模板，再以引物对ORF1G-F/ORF1G-R进行扩增，得到的PCR产物回收后用ApaLI和SpeI双酶切，连接到58S-C载体上，由此得到ORF1起始密码子ATG序列后面插入一个碱基G，但其他序列与58S-C载体外源序列完全一样的载体58S-ORF1+G；同理，用引物对ORF2G-F/ORF2G-muR扩增后，经ApaLI和SpeI双酶切，连接到58S-C载体上，得到58S-ORF2+G；用引物对ORF3G-R/ORF3G-muF与ORF3G-F/ORF3G-muR扩增PMS1T基因部分片段，将这两个PCR产物等量混合后作为模板，再以引物对ORF3G-F/ORF3G-R进行扩增，PCR产物回收后经SpeI和SacI双酶切，连接到58S-C载体上，得到58S-ORF3+G。

将这三个载体分别转化NIL(MH)愈伤组织，得到转基因植株后，于长日照下种植T₁代进行共分离分析。结果显示这三个转化载体的转基因后代基因型与表型完全共分离，具体表现为，转基因阳性单株相较于转基因阴性单株的结实率大大下降，参见图11。这种表型与58S-C载体转化结果完全一样，表明人工突变这三个预测的ORF，对基因功能的发挥并没有影响，证实了先前的推测：PMS1T基因不编码蛋白质，而是以RNA的形式起作用。

本实施例中涉及到的引物序列如下：

ORF1G-R：5’-CATTAGGCGGAGATGGCAAT-3’

ORF1G-muF：5’-CAAAATCACAATAAAGATATATGGATCAAAACCTTAATAAT-3’

ORF1G-muR：5’-ATTATTAAGGTTTTGATCCATATATCTTTATTGTGATTTTG-3’

ORF1G-F：5’-AGGTGTCGGTTCTAATGGTAGAAC-3’

ORF2G-F：5’-CCATTTATAGGCTACTCCTTTCC-3’

ORF2G-muR：5’-AACTAGTATATAGTATATAGAGAAGCCCAAGTACCGAACTTTTTCTGTTCGCCAT-3’

ORF3G-R：5’-ATTGTTGCAGGTGAAGGTGAGC-3’

ORF3G-muF：5’-CCCATTGCCATCTCCGCCTAATGGAACGCCTTGCATGTTGG-3’

ORF3G-muR：5’-CCAACATGCAAGGCGTTCCATTAGGCGGAGATGGCAATGGG-3’

ORF3G-F：5’-CAATTTTGCCTGGTATCACCAA-3’

实施例6：光敏感核不育基因PMS1T的表达分析

本实施例对PMS1T基因进行了表达谱的分析，以农垦58S与NIL(MH)在长日照和短日照下不同生长时期的各种组织RNA为材料。首先，按照试剂盒提供的说明，使用Invitrogen公司的Trizol试剂盒提取总RNA，经SuperScript^TMⅢ反转录酶反转录成cDNA，于-20℃保存。以等量反转录cDNA为模板，用PCR扩增的方法检测pms1在不同组织中的表达情况，以Ubiquitin基因(LOC_Os03g13170)作为内参基因。PCR反应体系如下：cDNA模板2μl，10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)1.5μl，2mM dNTP 1μl，10uM引物(RT-F/RT-R或UBQ-F/UBQ-R)各0.1μl，rTaq酶0.1μl(宝生物工程大连有限公司，5U/μl)，加双蒸水至终体系为15μl。PCR扩增反应程序设置如下：94℃，3min；94℃，30sec；57℃，30sec；72℃，30sec；35(PMS1T)/25(UBQ)循环；72℃，7min，降至25℃结束反应。PCR扩增产物在2.0％的琼脂糖凝胶上检测。结果显示，相对于内参基因来说，PMS1T总体表达水平偏低，并且呈现明显的组织表达特异性，具体表现在：在水稻幼穗发育的各个时期幼穗组织中表达量最高，在营养组织中的表达量较低(见图12)。

表达量分析使用的引物序列如下：

RT-F：5’-AAAGTTCGGTACTTGGGCTTCTCT-3’

RT-R：5’-ACTCCCATTCGATATTGTTGCAAGGGC-3’

UBQ-F：5’-AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3’

UBQ-R：5’-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3’。

Claims (6)

1.一种分离的pms1显性等位基因在控制水稻光敏感核不育性状中的应用，其特征在于，所述的pms1显性等位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.一种分离的pms1基因的隐性等位基因在控制水稻光敏感核不育性状中的应用，其特征在于，所述的pms1隐性等位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

4.权利要求3所述的分子标记在水稻育种中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用包括鉴定pms1基因的显性等位基因或隐性等位基因的基因分型。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用包括对水稻光敏感核不育系或其他品种中基因分型的鉴定。

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