CN102952795B - 水稻光敏感核不育基因pms3的分离克隆及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及水稻基因工程技术领域。本发明通过图位克隆的方法分离得到一个编码长链RNA的光敏感核不育基因pms3，该基因能调控水稻花粉的育性。pms3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。其等位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，在该序列的790bp处存在一个由C到G的等位基因突变。本发明还得到一种选育水稻光敏感核不育基因的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在该序列的1711bp处存在一个碱基突变。本发明获得的控制水稻花粉育性的基因pms3，其等位基因以及选育水稻光敏感核不育系的分子标记可广泛应用到水稻的育种与遗传改良，尤其是在新的水稻不育系的产生，光敏感水稻不育系的选育中的应用。

Description

水稻光敏感核不育基因pms3的分离克隆及应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻光敏感核不育基因pms3的分离克隆、功能验证及在水稻改良中的应用。
背景技术
水稻是世界人口的主要粮食来源之一。随着世界人口的膨胀，土地面积的减少，水稻单产及总产量的提高一度成为育种工作者追求的目标。基于不育系、保持系和恢复系的“三系”法杂交水稻的成功培育与利用堪称水稻育种史上“一次伟大的革命”，但是，随着人口的继续增长以及人们生活水平的日益提高，对粮食生产提出了更高的要求，三系杂交稻不育胞质单一的弊端也逐渐显露出来，成为了阻碍三系杂交稻进一步推广和利用的重要因素。光温敏核不育水稻是石明松1973年从粳稻品种农垦58群体中首次发现的自然突变体，命名为农垦58S(石明松.对光照长度敏感的隐性雄性不育水稻的发现及初步研究.中国农业科学，1985，2：44-48)，它在长日照下雄性不育，短日照下雄性可育。利用这个重要特性，该水稻品种在长日高温条件下可作为不育系用于杂交制种，而在短日低温条件下又能自交繁殖下一年的不育系种子，因此，在杂交水稻种子生产过程中可以免去作为产生不育系种子的保持系，使常规使用的“三系”减少为“两系”。另外，农垦58S与其他的水稻品种杂交F1代均为正常可育，配组自由度增大，其育性恢复不受胞质基因限制，因而比CMS的恢复源更广泛。通过分离克隆光、温敏雄性不育基因，研究其作用的机理，阐明其作用的本质，并以此为指导，转化到理想的遗传背景中，将有助于快速创造优良的目标品系以应用于生产，从而提高水稻产量。
发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆光敏感核不育基因pms3，对该基因进行功能验证及在水稻育种中的应用。该基因是一个不编码蛋白的长链RNA(见实施例5)。利用该基因的信息将极大的提高了优良不育系选育的速度，加快两系法育种进程，进一步提高水稻的生物学产量。
本发明涉及分离和应用一个包含pms3基因的DNA片段，并对该片段的作用机理进行阐述。这一段DNA具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明涉及分离和应用编码长链RNA的光敏感核不育基因pms3，这个基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，包括与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列有90％以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物。这个基因的等位基因具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
本发明克隆的水稻光敏感核不育基因pms3突变植株，其花粉的育性受到光照长度的影响：在长日照条件下，花粉完全败育；而短日照条件下，花粉则表现部分或全部可育。将突变植株中的包含pms3基因的DNA片段通过遗传转化的方法导入到正常水稻品种中，可以使正常水稻的花粉败育(见实施例1)，可用于新的不育系的培育。本发明涉及根据pms3的DNA片段序列信息发展的用于培育水稻光敏感核不育系的分子标记，通过对水稻正常植株与光敏感突变植株的pms3基因区段的DNA序列比较分析发现，光敏感突变植株的pms3基因中有一个特有的单碱基的替换突变，根据这个单碱基的突变，我们发展了可以用于辅助育种的分子标记(见实施例2)。本发明中，pms3基因表达量的上升可以使光敏感雄性不育植株的花粉恢复正常，将该基因构建到植物表达载体中时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子，使pms3基因在不育植株中过量表达或者诱导表达，可以人工改变水稻的花粉育性，用于水稻育种(见实施例4)。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的包含有pms3基因的DNA片段序列(全长6440bp；在第1711bp处碱基G突变为C)。
序列表SEQ ID NO：2显示的是本发明分离克隆的pms3基因的核苷酸序列(全长1236bp，不含intron，不编码蛋白，该DNA序转录成RNA后就能发挥功能)。
序列表SEQ ID NO：3显示的是本发明分离克隆的pms3基因等位基因的核苷酸序列(全长1236bp，不含intron，不编码蛋白，该DNA序转录成RNA后就能发挥功能，相对于SEQ ID NO：2所示的序列的第790位的“C”，该序列在第790bp处存在一个等位基因突变，即由C突变为G)。
图1：互补载体pCAMBIA1301示意图。
图2.pms3基因功能互补实验。图中A：S6K互补转化成熟时期阴性植株(左)与阳性植株(右)株型比较；B：成熟时期阴性植株(左)与阳性植株(右)小穗育性比较；C：开花时期阴性植株(左)与阳性植株(右)的小花形态比较；D：开花时期阴性植株(左)与阳性植株(右)的花药形态观察；E：阴性植株花粉碘染，bar＝50μm；F：阳性植株花粉碘染，bar＝50μm；G：T1代阴性植株(-)与阳性植株(+)花粉育性与小穗育性统计(3个家系)，数值代表平均值+/-标准误。
图3：基于农垦58S突变序列发展的分子标记。图中A：本发明中CAPS标记形成的原理；B：CAPS标记农垦58，农垦58S及DH80中的基因型表现；C：利用该CAPS标记对6种常规水稻品种及42种野生稻品种的基因型鉴定，C中所涉及的水稻资源如下所述(具体来源见《遗传资源来源披露登记表》，该遗传资源不是作为本发明的遗传用途，仅仅是作为测试材料的对照)：
1-珍汕97；2-明恢63；3-日本晴；4-中花11；5-牡丹江8；6-农垦58S；7-农垦58；8-DH80；9-mPA64s；10-IRGC 1012；11-IRGC 1034；12-IRGC 14619；13-IRGC 17376；14-IRGC 26977；15-IRGC 27635；16-IRGC 30346；17-IRGC 53453；18-IRGC 53454；19-IRGC 66515；20-IRGC 66528；21-IRGC 66560；22-IRGC 66627；23-IRGC 66809；24-IRGC 66813；25-IRGC 66831；26-IRGC 77144；27-IRGC 73118；28-IRGC 74730；28-IRGC 76290；30-IRGC 76404；31-IRGC 77143；32-IRGC 77144；33-IRGC 77529；34-IRGC 77636；35-IRGC 77645；36-IRGC 77665；37-IRGC 78269；38-IRGC 80180；39-IRGC 81586；40-IRGC 82097；41-IRGC 84154；42-IRGC 104921；43-IRGC 113509；44-IRGC 80622；45-IRGC 81831；46-IRGC 81845；47-IRGC 81883；48-IRGC 81915；49-IRGC 81928；50-IRGC 82037；51-IRGC 83795。
上述以IRGC编号开头的为国际水稻研究所统一编号的野生稻品种。
图4：超量表达载体pCAMBIA1301A构建示意图。
图5：pms3基因超量表达转基因植株的表型。图中A：pms3基因超量表达转基因植株T1代单株pms3基因的表达量检测(上)及GUS标记检测(下)；B：T1代阴性植株(-)与阳性植株(+)花粉育性与小穗育性统计(3个家系)，数值代表平均值+/-标准误。C：pms3基因超量表达转基因阳性植株与阴性植株成熟期整株表现；D：pms3基因超量表达转基因阳性植株与阴性植株刚开花后花药形态比较，左边为阴性植株的花药，右边为阳性植株的花药；Bars＝0.5mm。E：pms3基因超量表达转基因阳性植株与阴性植株小穗形态比较，左边为阴性植株的小穗，右边为阳性植株的小穗；F：pms3基因超量表达转基因阳性植株与阴性植株花粉育性比较，上边为阴性植株的花粉，右边为阳性植株的花粉，Bars＝50μm。
图6：pms3基因在水稻全生育期不同组织中的表达分析。编号1-15分别代表水稻不同发育时期的不同组织：1，苗期根；2，苗期叶；3，分蘖期叶；4，二次枝梗分化期叶鞘；5，雌雄蕊形成期茎；6，二次枝梗分化期叶片；7，雌雄蕊形成期叶片；8，花粉母细胞形成期叶片；9，花粉母细胞有丝分裂期剑叶；10，二次枝梗分化期幼穗；11，雌雄蕊形成期幼穗；12，花粉母细胞时期幼穗；13，花粉母细胞减数分裂期幼穗；14，有丝分裂期时期的穗；15，抽穗期的小穗。
图7：原位杂交确定pms3基因在水稻中的表达部位。图中A：该基因在农垦58叶鞘中有微量表达；B：该基因在农垦58叶片中有微量表达；C：该基因在农垦58花粉母细胞中表达；D：该基因在农垦58减数分裂的花药中表达；E：该基因在农垦58减数分裂后液泡化小孢子中表达；F：阴性对照。标尺长度为15μm。
图8：农垦58和农垦58S花药石蜡切片的比较。图中A、B、C、D、E和F分别表示农垦58花药在孢母细胞细胞时期、减数分裂二分体时期、减数分裂四分体时期、小孢子时期、液泡化花粉时期和成熟花粉期的花药横切片；G、H、I、J、K和L分别表示农垦58S花药在孢母细胞细胞时期、减数分裂二分体时期、减数分裂四分体时期、小孢子时期、液泡化花粉时期和成熟花粉期的花药横切片。
英文字母分别表示花药的结构。E，表皮细胞；En，药室内壁；ML，中层；T，绒毡层；Ms，造孢细胞；Msp，小孢子Mp，成熟花粉Bars＝15μm。
具体实施方式
以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆pms3基因以及验证pms3基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：分离克隆包含有pms3基因区段的DNA片段
1.利用图位克隆技术鉴定水稻光敏感核不育基因pms3
本发明中基因的定位群体所用到的亲本包括农垦58S和DH80，其中DH80由农垦58S/1514F1代花药培养加倍而来(水稻材料农垦58S来源文献：Li X.，Lu Q.，Wang F.，Xu C.，Zhang Q.2001，Separation of thetwo-locus inheritance of photoperiod-sensitive genic male sterility in rice and precisely mapping the pms3 locus.Euphytica 119：343-348)。本发明的基因定位工作中总共构建了农垦58S/DH80F2随机群体约7000株的定位群体，在武汉华中农业大学试验田分单株种植，通过两年田间育性观察，得到极端不育单株892株(水道材料来源农垦：58S/DH80F2：Lu Q.，Li X.，Guo D.，Xu C.，Zhang Q.2005，Localization of pms3，a gene forphotoperiod-sensitive genic male sterility，to a 28.4-kb DNA fragment.Mol Genet Genomics 273：507-511)。将这些极端不育单株的叶片按照常规报道的CTAB法全部抽提总DNA，酶切转膜，对pms3区段的分子标记进行重组交换分析。总DNA的抽提按Murray和Thompson(Murray M.G.，Thompson W.F.1980，Rapidisolation of high molecular weight plant DNA.Nucl Acids Res.8：4321-4325)的CTAB法进行。分子标记的RFLP分析，包括DNA酶切、电泳、转膜和杂交，按Liu等人的实验程序进行(Liu K et al.1997，A genome-wideanalysis of wide compatibility in rice and the precise location of the S5locus in the molecular map.Theor ApplGenet.95：809-814)。pms3基因被限定在分子标记237295/HhaI(自己命名)和148125L/177182R/BsrBI(自己命名)之间，它们之间的物理距离是12kb。结果如表1所示。
2.遗传转化载体的构建
我们采用互补转化与超量表达转化的方式来进一步确定基因的功能。本发明中，花粉育性受到一对等位基因的控制，武汉夏季长日照条件下，农垦58正常可育，农垦58S完全败育，而农垦58与农垦58S的杂种育性为50％，甚至更低。我们不能直接区分它们的显隐性关系，因此，我们采用双向互补转化的策略验证基因的功能。互补载体构建方法如下：以pCAMBIA1301载体为骨架载体，用SacI与SalI双酶切农垦58的BAC，BAC的编号为117H5，得到6440bp大小的基因组片段，该片段位于上述定位区间12kb内，将该片段连接到pCAMBIA1301中，即N6K互补转化载体。在N6K载体基础上用KpnI单酶切后回收载体，同时以58S DNA为模本，用引物SNP-F1与pms3-F4配对扩增，获得1852bp外源，将PCR产物TA clone测序验证，然后用KpnI单酶切获得1477bp长的片段，与回收的载体连接，得到的阳性克隆为S6K。N6K与S6K除了一个SNP差异外，其余全部相同，全长6440bp(该片段的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在第1711bp处，N6K为C碱基，S6K为G碱基)。
表1定位区间分子标记分析重组单株结果(部分数据)
Figure BSA00000559864000041
表1说明：A为不育亲本带型；B为杂合带型。
本发明中所用的双元载体pCAMBIA1301(图1)来自澳大利亚CAMBIA实验室(Center for theApplication of Molecular Biology to International Agriculture)。本发明中所使用的内切酶、碱性磷酸酶均购自宝生物工程大连有限公司代理，连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考产品的说明书。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加800ul LB复苏30分钟，取80ul涂于含卡那霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(X-β-gal)及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LA平板，37℃温箱培养14-16小时(LA与LB配方参考：萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，北京。2002年)。挑白色单克隆，扩大培养并抽提质粒，酶切验证及测序验证后得到目的克隆。把构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(由澳大利亚CAMBIA实验室赠送)中。转化后的菌株分别命名为EHA105-pCAMBIA1301-N6K与EHA105-pCAMBIA1301-S6K。载体构建涉及到的引物如下：
SNP-F1：5’-ACTCAGATCATCCCATTCAC-3’
pms3-F4：5’-ACATTGGATCTAGCGATTGG-3’
3.遗传转化与转基因植株表现
采用农杆菌介导的遗传转化方法分别将菌株EHA105-pCAMBIA1301-N6K导入农垦58S的愈伤组织，将EHA105-pCAMBIA1301-S6K导入农垦58的愈伤组织，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素(用于筛选阳性的转基因愈伤的一种抗生素，购自北京原平皓生物技术有限公司)抗性的愈伤组织、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方主要应用Hiei等人报道的方法基础上进行优化(Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.，and Kumashiro，T.1994，Efficient transformation of rice(Oryzasativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J 6，271-282.Lin，Y.，and Zhang，Q.2005，Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indicarice.Plant Cell Rep 23，540-547)，或参见申请人在先专利文献，专利号ZL 200710053552.9(发明的名称：水稻广亲和基因S5的分离克隆及应用专利申请日：2007年10月15日；专利公开日：2008年6月18日；公开号：CN101200725；专利授权日：2010年04月21日)报道的方法进行。
本实施例的结果显示，将互补载体-pCAMBIA1301-N6K通过农杆菌介导的方法转化导入农垦58S的愈伤组织，一共得到25棵T0代独立转化植株。在长日照条件下，对这些转基因植株进行了阳性检测与花粉育性考察(阳性检测用GUS标记，引物序列如下：GUS1.6F：5’-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3’；GUS1.6R：5’-GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACCG-3’)，得到的19株阳性植株的平均碘染率为3.7％，得到的6株阴性转基因植株的碘染率为2.1％，通过统计学的t检验发现阳性植株与阴性植株之间的花粉育性没有显著差异(t＝0.77，P＝0.2233)，说明来自农垦58的基因组DNA片段N6K导入到农垦58S中不能使农垦58S的育性恢复。相反，将互补载体pCAMBIA1301-S6K通过农杆菌介导的方法转化导入农垦58的愈伤组织，一共得到43棵T0代独立转化植株，用同样的方法在长日照条件下对这些转基因植株进行了阳性检测，分别有36株阳性植株与7株阴性植株，通过对这些植株的T0代小穗育性进行考察发现，阴性植株的平均结实率为89.0％，而阳性植株的平均结实率为56.1％。统计学t检验发现阳性植株与阴性植株之间的花粉育性有极显著差异(t＝-6.3，P＝0.0000)，为了进一步证明这一结果，随机选取了三个独立的，并且T-DNA拷贝数插入为单拷贝的T0代植株收种，进行T1代种植，并进行了基因型与表型的共分离检测。结果显示，这三个家系都表现完美的共分离，即阳性植株表现不育，而阴性植株正常(图2)。上述结果说明来自农垦58S的基因组DNA片段S6K导入到农垦58中能使农垦58的花粉育性下降。
遗传化结果表明，不育水稻品种农垦58S中含有pms3基因的DNA片段能够使可育品种农垦58的花粉发生败育。
实施例2：光敏雄性不育基因分子标记的获得
在LJ25与LK40之间共28kb的区间，申请人对农垦58，农垦58S及DH80进行了比较测序，发现可育亲本农垦58与不育亲本农垦58S之间的区间仅有单碱基替换的差异：由农垦58中G碱基突变为农垦58S中C碱基。申请人将这个单碱基差异转化为CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic sequence)标记加以利用。在农垦58、DH80中为G(TGGTAGACAAA)，而在农垦58S中突变成了C(TGGTACACAAA)，由此导致丢失了AccI的识别位点GTAGAC。在该序列两边设计一对引物210225F(CAGTAGGGACACTTGTATCCA)/210225R(TGCACCGTGCAAATGTACCA)对三个亲本进行扩增，再利用AccI对PCR产物进行酶切，电泳检测(图3，A)。酶切结果显示，在农垦58与DH80的片段中存在AccI酶切位点，故扩增片段被酶切成451bp与920bp的两条带，而农垦58S则不能被酶切，电泳显示1371bp大小的片段(图3，B)。PCR反应体系如下：DNA模板1μl，10×buffer 1.5μl，2mM dNTP 1μl，25mMMgCl21.2μl，10uM引物(F/R)各0.2μl，rTaq酶0.2μl(TaKaRa 5u/ul)，加ddH2O至15μl。PCR扩增反应程序：94℃，5min；94℃，45sec；59℃，45sec；72℃，1min 30sec；32cycles；72℃，5min，25℃保存。酶切体系：PCR产物15ul，10×M buffer 1.7μl，AccI 0.2μl(宝生物工程大连有限公司代理，10u/ul)，ddH2O 0.1μl。37℃酶切2hr或过夜。PCR扩增产物或酶切产物在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。
为了进一步确定这个SNP是农垦58S所特有，申请人另外选取了6个水稻常规品种以及42个野生稻(材料来源见：上述《附图说明》图3的说明)用该CAPS标记进行了实验检测，结果发现只有mPA64S与58S基因型相同，其余的均是58N的基因型，而mPA64s恰好是由农垦58S与籼稻品种杂交培育而来的光温敏不育系(图3，C)。上述由农垦58与农垦58S单碱基差异发展而来的CAPS标记将有助于申请人更加快速地培育新的光敏不育系，加快光温敏不育系(简称两系)水稻育种的进程。
实施例3：pms3基因全长cDNA的获得
上述结果将水稻光敏感核不育基因pms3定位在两个分子标记237295/HhaI和148125L/177182R/BsrBI之间，它们的物理距离有12kb。利用RGAP软件(http://rice.plantbiology.msu.edu/)对12kb区间进行了基因的预测，但是没有发现有完整的预测基因位于该区间。为了获得pms3，申请人在SNP的附近设计了一系列的引物，以农垦58幼穗时期RNA的反转录产物为模版进行PCR扩增，发现该区间存在未预测出的转录本。本发明进一步用Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit获得pms3候选基因全长cDNA，使用材料为农垦58与农垦58S花粉母细胞形成期的幼穗，液氮冷冻后于-70℃冰箱待用。按照TRIZOL说明书所述步骤提取RNA，-70℃保存待用。其中反转录步骤完全按照试剂盒说明书要求完成，后面的扩增有稍许改动。第一轮PCR反应体系如下：反转录产物模板1μl，2×GCI buffer 10μl，2mM dNTP2μl，10×UPM 2μl，10uM GSP1 0.5μl，LA Taq酶0.2μl(TaKaRa 5u/ul)，加ddH2O至20μl；第一轮PCR反应程序：94℃3min；94℃30sec，72℃3min，5次循环(cycles)；94℃30sec，67℃3min，32cycles；67℃，5min；25℃保存。第二轮PCR反应体系如下：第一步反转录产物稀释50×作为模板1μl，2×GCI buffer 10μl，2mM dNTP 2μl，0uM NUP 0.5μl，10uM GSP20.5μl，LA Taq酶0.2μl(宝生物工程大连有限公司代理，5u/ul)，加ddH2O至20μl；第二轮PCR反应程序：94℃5min；94℃45sec，59℃45sec，72℃3min，35次循环(cycles)；72℃5min；25℃保存。扩增产物挖胶回收，将回收产物构建到pGEM-T(购自Promega公司)载体中，转化大肠杆菌，然后抽提质粒，测序验证。通过RACE与PCR扩增，确定该基因全长1236bp，没有inton。涉及到的引物的编号及序列如下：
5’端UTR：
pms3-R5：5’-AACATGGCATGAGCACTGGA-3’，
210214R：5’-GGAAGAACCATGGACGAACA-3’，
pms3-R6：5’-CCAAGCTCTAGCTGCTCTAC-3’；
3’端UTR：
225240F：5’-CTGAGTTGGATGTGCAACCA-3’，
SNP-R1：5’-ACAAGACTATTTCATAGCACCT-3’；
试剂盒提供的接头引物：
UPM-long：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，
UPM-short：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’，
NUP：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’。
实施例4：pms3基因超量表达载体构建与转基因植株的表型
本实施例中，申请人还构建了pms3超量表达载体，具体步骤如下：根据获得的pms3基因全长cDNA(该基因的DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所示)，设计一对引物OSNPF(GTTGGATCCGTATCAGAAGCTACAACATGT)/OSNPR(AGGCTGCAGCTGAGTAGGAAAATCATCTGA)，以农垦58幼穗RNA反转录的CDNA为模板，扩增pms3基因，然后用BamHI与PstI双酶切，连接到双元载体pCAMBIA1301A(图4)。pCAMBIA1301A是由肖本泽等(Xiao B，Hung Y，Tang N，Xiong L.2007，Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions.Theor Appl Genet115：35-46)以pCAMBIA1301为骨架，进行改造的，将水稻的肌动蛋白基因actin的启动子构建到pCAMBIA1301载体中，使目标基因在actin的启动子启动下组成型表达。以农垦58S的愈伤为转化受体进行遗传转化。遗传转化步骤与上述互补转化步骤相同。一共获得26株T0代转基因植株，同样用GUS标记检测植株的基因型，同时在湖北省武汉市大田长日照下对这些植株进行结实率的考察，发现一共有19株阳性植株，平均结实率为48.7％，而其他7株阴性植株的平均结实率则为2.9％，统计分析显示阳性植株与阴性植株之间的花粉育性有极显著差异(t＝-6.7，P＝0.0000)。同样的，对这些转基因植株进行了T1代共分离检测以确定农垦58S长日照下花粉育性恢复确实是由pms3基因控制。结果显示T1代植株的基因型与表型完全共分离，即所有的阳性植株，花粉育性恢复正常，而阴性植株花粉完全不育(图5)。
pms3的超量表达遗传转化结果说明pms3基因的表达量上升能使农垦58S的花粉育性在长日照条件下恢复正常。
实施例5：光敏感核不育基因pms3是一个不编码蛋白的长链RNA
为了进一步研究pms3的作用机理，用生物信息学的方法对pms3基因进行了分析，发现该基因预测有一个编码73aa的短肽，但是没有预测到同源的蛋白，申请人推测该基因不编码蛋白，而是在RNA水平上发挥作用。申请人利用遗传转化的方法验证了这种假说。首先将pms3基因中上述预测编码短肽的起始密码子ATG  突变为CTG，具体的方法如下：首先设计引物ASNPFTTCTTTCATCAAATTGCCTGCTTCACCAGCACGTCCATATTGAAT与ASNPR：ATTCAATATGGACGTGCTGGTGAAGCAGGCAATTTGATGAAAGAA；然后以以农垦58幼穗RNA反转录的CDNA为模板，分别用引物对OSNPF/ASNPR与ASNPF/OSNPR扩增pms3基因部分片段；将这两个PCR产物混合后作为模板，再以引物对OSNPF/OSNPR进行扩增；PCR反应体系如下：DNA模板1μl，10×buffer1.5μl，2mM dNTP 1μl，25mM MgCl21.2μl，10uM引物(F/R)各0.2μl，rTaq酶0.2μl(宝生物工程大连有限公司代理，5u/ul)，加ddH2O至15μl。PCR扩增反应程序：94℃，5min；94℃，45sec；59℃，45sec；72℃，1min 30sec；32次循环；72℃，5min，25℃保存。得到的PCR产物用BamHI与PstI双酶切，连接到双元载体pCAMBIA1301A(图4)；然后按照实施例1中的遗传转化的方法，对预测的起始密码子突变了的pms3基因进行了超量表达，转化的受体是农垦58S。一共获得了22株T0代转基因植株，同样，在长日照下，对这些植株进行阳性检测与小穗育性的考察，结果显示，有14株阳性植株，平均结实率为43.6％；8株阴性植株，其平均结实率为2.9％。统计分析显示阳性植株与阴性植株之间的花粉育性有极显著差异(t＝-3.7，P＝0.0007)。说明预测的起始密码子突变以后不影响该基因发挥功能，阳性植株小穗育性能正常恢复。
通过突变pms3基因预测的翻译起始密码子实验，申请人可以推断，pms3基因不编码蛋白质，它是通过转录成RNA来发挥功能的。
实施例6：光敏感核不育基因pms3的表达分析
本实施例对pms3基因进行了表达谱的分析，首先获取了农垦58与农垦58S的不同组织，使用invitrogen公司的Trizol试剂盒提取RNA。RNA提取方法按照该试剂盒提供的说明书进行。RNA反转录是使用invitrogen公司的DNase I和SuperScriptTMIII反转录酶，方法按照试剂盒提供的说明书进行。以反转录产物为模板，用PCR的方法检测了pms3在不同组织中的表达情况，PCR体系如下：cDNA模板1μl，2×GC I buffer 7.5μl，2mM dNTP 1μl，10uM引物(SNP-F5/SNP-R1或UBQF1/UBQR1)各0.2μl，rTaq酶0.2μl(购自宝生物工程大连有限公司代理，5u/ul)，加ddH2O至15μl。PCR扩增反应程序：94℃，5min；94℃，30sec；59℃，30sec；72℃，1min；33(pms3)/27(UBQ)循环；72℃，5min，25℃保存。PCR产物在2％的琼脂糖胶中检测。结果显示，pms3在各个组织中都有表达，但是在水稻发育的幼穗中表达明显增强(图6)。表达分析涉及的引物的编号及序列如下：
SNP-F5：5’-TAGAGTATCTGAACTGCGTGTTG-3’
SNP-R1：5’-ACAAGACTATTTCATAGCACCT-3’
UBQF1：5’-GAAGAAGTGTGGTCACAGCA-3’
UBQR1：5’-GAGATAACAACGGAAGCATAA-3’
为了进一步确定pms3基因的表达部位，本实施例还使用了RNA原位杂交技术。根据RNA探针杂交信号确定本发明基因在叶片中中有微弱表达，但在小孢子母细胞，小孢子中表达明显(图7)。RNA原位杂交流程参见Drews发表的文献(Drews G.N.1998，In situ hybridization.Methods Mol Biol 82：353-71)。
实施例7：农垦58与农垦58S的花药发育细胞学观察
取农垦58及农垦58S不同发育时期的小花，于50％FAA固定液(甲醛∶冰乙酸∶50％乙醇＝体积比5∶5∶90)中固定24h，经梯度酒精脱水，二甲苯透明和梯度石蜡浸蜡后，纯石蜡包埋。石蜡切片机纵切花药，切片厚度为8μm，展片后于37℃恒温箱中放置24h，然后进行梯度脱蜡，最后封片，用LEICA荧光显微镜观察摄影(Leica DM 4000B)。
结果显示农垦58S的花药发育过程中，绒毡层细胞提早降解，并且降解速度较慢，导致绒毡层的降解也推迟结束(图8)。石蜡切片观察结果显示农垦58S的花粉不育是花药绒毡层的不正常解体导致。
Figure ISA00000559864200011
Figure ISA00000559864200021
Figure ISA00000559864200051

Claims (2)

1.核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示的pms3基因在改良使水稻花粉育性正常中的应用，其特征在于将包含如序列表SEQ ID NO：2所示的pms3基因的基因组片段与能够超量表达目标基因的载体连接，转入对水稻花粉育性敏感的水稻，通过超量表达pms3基因改良水稻对花粉育性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其还包括核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示的pms3基因的等位基因在改良使水稻花粉育性正常中的应用，其特征在于在SEQ ID NO：3所示序列的第790bp处存在一个碱基突变。
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