CN106929518A - 一种橡胶树HbAG基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种橡胶树HbAG基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了该HbAG基因编码的蛋白及该HbAG基因的应用。本发明首次从橡胶树中克隆得到HbAG基因，该基因属于AG亚家族，参与花的发育、胚珠的形成和种子的成熟，执行D类基因功能。通过亚细胞定位分析表明该基因定位于细胞核，符合转录因子的特征。进一步将该基因转到拟南芥中，获得转基因植株，发现转基因植株出现开花时间明显提前，营养生长时间短，及植株矮化等表型，表明该基因在橡胶树的花器官发育、以及生殖发育中起着重要的调控作用。将来利用HbAG基因对橡胶树进行遗传改良，可为缩短橡胶树育种年限、提高育种效率提供有效的基因资源。

Description

一种橡胶树HbAG基因及其应用

技术领域

本发明生物技术领域，涉及一种橡胶树HbAG基因及其应用。

背景技术

巴西橡胶树俗称橡胶树，是中国热带地区重要的经济作物，其生产的天然橡胶是关系到国计民生的战略资源。随着国内天然橡胶消费量的逐年增加，受种植条件和宜胶地的限制，提高橡胶树单位面积产量迫在眉睫。橡胶树属多年生乔木，有性世代周期长，在橡胶树新品种选育中存在花多果少，座果率偏低等问题，导致许多杂交组合不能成功组配，使得橡胶树选育种效率受到很大限制，成为橡胶树育种中亟待解决的问题之一。因此，深入研究橡胶树花发育及生殖发育机理，旨在改变橡胶树“繁花少实”的现象，提高其坐果率，可为橡胶树优良杂交组合的配置提供理论基础与技术手段。

在植物花器官及生殖发育中，AGAMOUS基因作为一类重要的转录因子基因家族，它们在植物的生长发育和信号转导中起着关键性的调控作用，可以激活或抑制目的基因的转录表达，在植物生长发育和信号转导中起着重要的、不可或缺的作用。如前人研究表明AGAMOUS基因主要参与调控开花时间、决定花器官的发育、影响果实的成熟、调节营养器官的发育、以及对外界信号的响应。

发明内容

本发明通过对不同发育时期的橡胶树花器官进行转录组测序分析，结合RACE试验和PCR分析，鉴定出一个橡胶树花器官特征因子AGAMOUS(AG)基因，进一步对这个花器官特征因子HbAG基因进行生物信息学分析、进化树分析、时空表达模式分析、亚细胞定位、以及转基因功能验证，显示HbAG的过表达可导致植株矮小，使得营养生长期缩短，从而促进植株提前开花。

本发明的第一个方面是提供一种橡胶树HbAG基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二个方面是提供一种蛋白质，其为本发明第一个方面所述的橡胶树HbAG基因编码的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三个方面是提供一种本发明第一个方面所述的橡胶树HbAG基因的克隆方法，包括以下步骤：(1)从橡胶树根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、花序、雄花和/或雌花组织中提取总RNA；(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA；(3)设计HbAG基因全长序列扩增引物对，进行PCR扩增，回收PCR产物，其中，HbAG基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；(4)PCR产物连接载体，转化，测序，获得HbAG基因基因片段。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树HbAG基因在促进植株提前开花中的应用。

本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树HbAG基因在培育提前开花植株中的应用。

本发明的第六个方面是提供一种表达载体，其含有本发明第一个方面所述的橡胶树HbAG基因。

本发明的第七个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。该引物对可用于HbAG基因全长序列扩增。

本发明首次从橡胶树中克隆得到HbAG基因，该基因属于AG亚家族，参与花的发育、胚珠的形成和种子的成熟，执行D类基因功能。通过亚细胞定位分析表明该基因定位于细胞核，符合转录因子的特征。进一步将该基因转到拟南芥中，获得转基因植株，发现转基因植株出现开花时间明显提前，营养生长时间短，以及植株矮化等表型，表明该基因在橡胶树的花器官发育、以及生殖发育中起着重要的调控作用。将来利用HbAG基因对橡胶树进行遗传改良，可为缩短橡胶树育种年限、提高育种效率提供有效的基因资源。

附图说明

图1为橡胶树HbAG基因的ORF扩增电泳图。

图2为橡胶树MADS-box基因外显子-内含子结构，其中，CDSf片段是第一个外显子，CDSi片段是中间的外显子，CDSl片段是最后一个外显子，刻度尺表示基因的长度，单位bp。

图3为橡胶树MADS-box基因的相对荧光定量表达分析结果，其中，Ro代表根、St代表茎、Stt代表茎尖、Le代表叶片、Ba代表树皮、Xy代表木质部、La代表胶乳、Fr代表果实、HX3代表3cm花序、HX6代表6cm花序、HX9代表9cm花序、HX12代表12cm花序、XR代表雄蕊、CR代表雌蕊。

图4为植物过表达载体的构建和鉴定结果，其中，A：M:DL5000DNAMarker，1:19T-HbAG质粒经XhoI和PstI双酶切，2:Pxcs-HAStrep质粒经XhoI和PstI双酶切，3:Pxcs-HAStrep质粒无酶切对照；B:M:DL5000DNA Marker，1:Pxcs-HbAG-HAStrep质粒经XhoI和PstI双酶切。

图5为转基因拟南芥阳性植株的PCR鉴定结果，其中，A:HbAG基因；B：bar基因；CK：阴性对照。

图6为HbAG的转基因植株的表型。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.)或酵母遗传法实验指南(Methodsin Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory CourseManual，Adams A et al编，Cold Spring Harbor Laboratory,1998出版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1、橡胶树HbAG基因的克隆

(1)取橡胶树的根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、花序、雄花和雌花等组织参照InvitrogenReagent提取RNA的方法步骤进行，得到符合后续试验要求的总RNA。反转录，得到cDNA。设计ORF引物，以获得的cDNA作为模板，进行PCR扩增，扩增条件如下：

a.设计引物如下：

Forward primer(5’-3’)：ATGGCATACCAGAGCGAG；

Reverse primer(5’-3’)：TTAAACTAACTGAAGGGACATCTG

b.PCR扩增体系如下：

c.反应程序为：94℃变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分，34个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物低温保藏备用。

(2)将PCR扩增产物加入5μL 6×Loading buffer混匀后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，得到的目的条带大小与预期一致。

用普通琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收PCR产物，将回收的PCR产物与T载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取转化阳性的克隆提取质粒送测序，经过测序确定正确的克隆用于后续克隆及酶切。测序结果与之前的转录组里的序列大部分相同。

2、橡胶树HbAG基因生物信息学分析

将得到的橡胶树HbAG基因编码序列与橡胶树基因组序列比对，用以筛选相应的基因组序列信息，用FGENESH网站做HbAG基因结构分析(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fgenesh&group＝programs&subgroup＝gfind)，进而得到HbAG基因的内含子与外显子的数目及位置，基因结构分析结果显示橡胶树HbAG基因包含7个外显子，6个内含子(图2)。

3、橡胶树不同组织中HbAG基因表达分析

选取橡胶树的根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、花序、雄花和雌花10个组织，花序又分成几个时期(以花序长度区分)，以橡胶树18S为内参基因，探究HbAG基因在橡胶树各个组织器官中的表达情况。荧光定量分析结果表明HbAG基因主要在橡胶树的茎尖、果实、花序、以及雄花和雌花中特异性高调表达(图3)，表明HbAG基因参与了橡胶树花器官与生殖发育进程。

4、HbAG基因过表达载体构建

用XhoI和PstI两个限制性内切酶将含有酶切位点的19T-HbAG基因载体和Pxcs-HAStrep载体切开(图4-A)，并回收载体大片段和目的基因片段，连接，然后转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提质粒，进行双酶切(图4-B)，得到两条酶切片段大约750bp和大于5000bp，片段大小符合预期，说明载体构建成功，正确载体命名为pXCS-HbAG-HAStrep。

5、转基因拟南芥植株的筛选

将构建好的表达载体pXCS-HbAG-HAStrep转入农杆菌。用沾花浸染(floraldipping)的方法转化拟南芥野生型。将转化后得到的T0代拟南芥种子放在含有20mg/LBASTA的MS固体培养基上培养，培养两周后，转基因苗仍为绿色，不含目的载体的植株逐渐白化死去。待植株长到六片真叶时，移出存活的植株(如图5)。洗去根上的培养基，种植到营养土中。共转移出8株，标记为L1-8。取每株的一两片叶粗提DNA，进行PCR验证。之后保留阳性植株，待种子成熟后，分株收种，得到T1代种子。然后再进行筛选，将T1代拟南芥种子放在含有30mg/L BASTA的MS固体培养基上培养，将后代分离比为3:1的存活的植株随机选取8株，移栽到营养土中，待种子成熟后，分株收种，得到T2代种子。再次进行筛选，选用不发生性状分离的株系做后续实验。

以T0代8个株系的DNA为模板，分别用bra基因引物和HbAG基因引物进行PCR扩增。结果如图5所示，L1-L6株系都能扩增从400bp左右(bar)和750bp左右(HbAG)的目的片段，说明这几个株系都是阳性植株。

6、转基因拟南芥植株的表型

选取后代存活分离比为3:1的两个株系L1和L5得到的纯合转基因种子和野生型的拟南芥种子，同时播种，在同样的培养条件，统计它们的形态学指标。分别统计植株的莲座叶数目、莲座上的最长叶片的长度、抽薹两周后的株高、以及从种子萌发到开花的时间和果荚成熟时的长度。结果如表1和图6所示。

表1 HbAG的转基因植株表型的统计分析

由表1可知：野生型植株的这些形态学指标都显著性的高于转基因株系的，说明野生型植株营养生长时间长，植株高大粗壮，而转基因植株开花时间明显提前，营养生长时间短，故植株矮小。

从图6可以直观看出它们的差异，转基因植株已经长出果荚了，野生型的才开始开花；转基因植株叶片整体偏小。通过局部的观察(图6)，可以看出野生型的莲座不仅叶片数目多，而且还长出了多个分枝，转基因植株没有明显的分枝或有分枝但是不长大，受到抑制作用；野生型的花序比较密集，开花比较多，茎上的分枝较多，转基因植株的每个小花比较分散，而且数目少，分枝也少。

进一步对转基因拟南芥中花发育相关内源基因的表达情况进行检测，结果显示在转基因拟南芥植株中HbAG的过表达可以促进AtFT、AtAP1、AtLFY和AtFUL基因的表达，抑制AtSVP基因的表达，推测HbAG可能通过与这些基因的互作来影响橡胶树的生殖发育进程。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所

<120> 一种橡胶树HbAG基因及其应用

<130> 123456

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HbAG基因

<400> 1

atggcatacc agagcgagtc cagggagact tcaccccaga ggaaaatggg taggggtaag 60

atcgagatca agcggatcga aaacaccaca aatcgtcaag ttactttctg caaaaggcgc 120

aacggtctgc tcaagaaagc ttatgaatta tctgttcttt gtgatgctga ggttgctctt 180

atcgtcttct ctagccgtgg ccgcctctat gagtatgcca acaatagtgt taaatctaca 240

attgagaggt acaagaaggc atgtgcagat tcatccaata ctggatctgt ttctgaagct 300

aatgctcagt actatcagca agaagctgcc aagctgcgtg ggcaaataag caatttgcag 360

aagtcaaaca ggcatatgct gggtgagtcg ctaggagcct taacagtgaa agaacttaag 420

agcttggaga tacgactaga aaaaggaatc agtagaattc ggtccaaaaa gaatgagctg 480

ctgtttgcag aaatcgagta tatgcagaaa agggaaattg atttgcacaa caataaccag 540

attctccgag ccaagattgc tgagaacgaa aggaagcagc agaacatgaa tttgatgcca 600

ggtggaggta gttatgagat catgcaatct caaccattcg ataacaggaa ctattttcaa 660

gtgaatgcat tacaacccgc taatcattat ccacaccaag accagatgtc ccttcagtta 720

gtttaa 726

<210> 2

<211> 241

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HbAG蛋白质

<400> 2

Met Ala Tyr Gln Ser Glu Ser Arg Glu Thr Ser Pro Gln Arg Lys Met

1 5 10 15

Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Asn Arg

20 25 30

Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala Tyr

35 40 45

Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe Ser

50 55 60

Ser Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ala Asn Asn Ser Val Lys Ser Thr

65 70 75 80

Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Cys Ala Asp Ser Ser Asn Thr Gly Ser

85 90 95

Val Ser Glu Ala Asn Ala Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ala Ala Lys Leu

100 105 110

Arg Gly Gln Ile Ser Asn Leu Gln Lys Ser Asn Arg His Met Leu Gly

115 120 125

Glu Ser Leu Gly Ala Leu Thr Val Lys Glu Leu Lys Ser Leu Glu Ile

130 135 140

Arg Leu Glu Lys Gly Ile Ser Arg Ile Arg Ser Lys Lys Asn Glu Leu

145 150 155 160

Leu Phe Ala Glu Ile Glu Tyr Met Gln Lys Arg Glu Ile Asp Leu His

165 170 175

Asn Asn Asn Gln Ile Leu Arg Ala Lys Ile Ala Glu Asn Glu Arg Lys

180 185 190

Gln Gln Asn Met Asn Leu Met Pro Gly Gly Gly Ser Tyr Glu Ile Met

195 200 205

Gln Ser Gln Pro Phe Asp Asn Arg Asn Tyr Phe Gln Val Asn Ala Leu

210 215 220

Gln Pro Ala Asn His Tyr Pro His Gln Asp Gln Met Ser Leu Gln Leu

225 230 235 240

Val

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F

<400> 3

atggcatacc agagcgag 18

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R

<400> 4

ttaaactaac tgaagggaca tctg 24

Claims (7)

1.一种橡胶树HbAG基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种蛋白质，其特征在于，其为权利要求1所述的橡胶树HbAG基因编码的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种权利要求1所述的橡胶树HbAG基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从橡胶树根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、花序、雄花和/或雌花组织中提取总RNA；

(2)以总RNA为模板进行反转录获得cDNA；

(3)设计HbAG基因全长序列扩增引物对，进行PCR扩增，回收PCR产物，其中，HbAG基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

(4)PCR产物连接载体，转化，测序，获得HbAG基因基因片段。

4.一种表达载体，其特征在于，其含有权利要求1所述的橡胶树HbAG基因。

5.如权利要求1所述的橡胶树HbAG基因在促进植株提前开花中的应用。

6.如权利要求1所述的橡胶树HbAG基因在培育提前开花植株中的应用。

7.一种引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。