CN108165553A

CN108165553A - 一种橡胶树花器官特征因子基因及其编码产物与应用

Info

Publication number: CN108165553A
Application number: CN201810045160.6A
Authority: CN
Inventors: 位明明; 李维国; 黄华孙
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2018-01-17
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2038-01-17
Also published as: CN108165553B

Abstract

本发明涉及一种橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1，一种橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO:2，本发明还涉及橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2的应用。本发明的基因HbPMADS2为一类转录基因，参与橡胶树花芽分化、以及雌雄蕊的发育进程，在植物生长发育和信号转导中起着重要的、不可或缺的作用，该基因对橡胶树的叶片和根系发育、以及果实发育中起着重要的调控作用，可利用HbPMADS2基因对橡胶树进行遗传改良，为促进橡胶树根系发育，以及提高橡胶树座果率提供有效的基因资源。

Description

一种橡胶树花器官特征因子基因及其编码产物与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因及其应用，同时也涉及到该基因编码蛋白质，尤其涉及一种橡胶树花器官特征因子基因及其编码产物与应用。

背景技术

技术

巴西橡胶树俗称橡胶树，是中国热带地区重要的经济作物，其生产的天然橡胶是关系到国计民生的战略资源。随着国内天然橡胶消费量的逐年增加，受种植条件和宜胶地的限制，提高橡胶树单位面积产量迫在眉睫。橡胶树属多年生乔木，有性世代周期长，在橡胶树新品种选育中存在花多果少，座果率偏低等问题，导致许多杂交组合不能成功组配，使得橡胶树选育种效率受到很大限制，成为橡胶树育种中亟待解决的问题之一。因此，深入研究橡胶树花发育及生殖发育机理，旨在改变橡胶树“繁花少实”的现象，提高其坐果率，可为橡胶树优良杂交组合的配置提供理论基础与技术手段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种从橡胶树中获得的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2，以及该基因编码产物与应用。

本发明的第一个方面是提供一种橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二个方面是提供一种本发明第一个方面所述的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三个方面是提供一种表达载体，其包含原始载体和本发明第一个方面所述的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2。

其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用Pxcs-HAStrep载体，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述原始载体为Pxcs-HAStrep载体，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列位于Pxcs-HAStrep载体的XhoI和PstI两限制性内切酶位点之间。

本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2、或者本发明第三个方面所述的表达载体在促进植物叶片发育中的应用。

本发明的第五个方面是提供本发明第一个方面所述的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2、或者本发明第三个方面所述的表达载体在促进植物果实发育中的应用。

本发明的第六个方面是提供本发明第一个方面所述的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2、或者本发明第三个方面所述的表达载体在促进植物根系发育中的应用。

本发明的第七个方面是提供一种在拟南芥中过表达橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2的应用方法，其特征在于，用本发明第三个方面所述的表达载体重组质粒转化拟南芥。

本发明的第八个方面是提供一种用于橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

本发明的基因HbPMADS2为一类转录基因，参与橡胶树花芽分化、以及雌雄蕊的发育进程，在植物生长发育和信号转导中起着重要的、不可或缺的作用，进一步将该基因转到拟南芥中，获得转基因植株，发现转基因植株的叶片、根系、以及果夹长度都显著高于野生型，表明该基因对橡胶树的叶片和根系发育、以及果实发育中起着重要的调控作用，可利用HbPMADS2基因对橡胶树进行遗传改良，为促进橡胶树根系发育，以及提高橡胶树座果率提供有效的基因资源。

附图说明

图1为HbPMADS2基因扩增电泳结果图。

图2为橡胶树HbPMADS2基因外显子-内含子结构，其中，刻度尺表示基因的长度，单位bp，1所示的片段是第一个外显子，2-4所示的片段是中间的外显子，5所示的片段是最后一个外显子。

图3为橡胶树HbPMADS2基因的相对荧光定量表达分析结果：Ro代表根、St代表茎、Stt代表茎尖、Le代表叶片、Ba代表树皮、Xy代表木质部、La代表胶乳、Fr代表果实、HX3代表3cm花序、HX6代表6cm花序、HX9代表9cm花序、HX12代表12cm花序、XR代表雄蕊、CR代表雌蕊。

图4为植物过表达载体的构建和鉴定结果：图A中，M：DL5000 DNA Marker，1：19T-HbPMADS2质粒经XhoI和PstI双酶切，2：Pxcs-HAStrep质粒经XhoI和PstI双酶切，3：Pxcs-HAStrep质粒无酶切对照；图B中，M：DL5000 DNA Marker，1：空载体，2：Pxcs-HbPMADS2-HAStrep质粒经XhoI和PstI双酶切。

图5为转基因拟南芥阳性植株的PCR鉴定结果，其中，A：HbPMADS2基因，B：bar基因，CK：阴性对照。

图6为HbAG的转基因植株的表型，其中，图A中从左往右分别为苗期WT和转基因株系；图B中上面一行为抽薹期WT莲座叶叶片，下面一行为抽薹期转基因株系莲座叶叶片；图C中从左往右分别为转基因株系和WT抽薹开花期花序形态。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

1、橡胶树HbPMADS2基因的克隆

提取橡胶树不同组织的RNA后进行反转录，得到cDNA模板，用设计好的ORF引物(Forward primer 5’-3’：ATGGGAAGAGGAAAGATTGAGA；Reverse primer 5’-3’：TTACATCCTCTCCTGCAAAT)进行PCR扩增，接着用凝胶电泳检测PCR产物，得到含有碱基序列为639bp的HbPMADS2基因片段(图1)。接着，对目的基因片段进行回收、连接和转化，得到阳性菌斑，送测序公司进行测序，其序列如SEQ ID No.1所示；编码HbPMADS2基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2、橡胶树HbPMADS2基因结构分析

将得到的橡胶树HbPMADS2基因编码序列与橡胶树基因组序列比对，用以筛选相应的基因组序列信息，用FGENESH网站做HbPMADS2基因结构分析(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fgenesh&group＝programs&su bgroup＝gfind)，进而得到HbPMADS2基因的内含子与外显子的数目及位置，基因结构分析结果显示橡胶树HbPMADS2基因包含5个外显子，4个内含子(图2)。

3、橡胶树HbPMADS2基因的表达模式分析

选取橡胶树的根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、雄花和雌花9个组织，以及不同发育时期花序为材料(以花序长度区分)，以橡胶树18S为内参，探究HbPMADS2基因在橡胶树各个组织器官中的表达情况。荧光定量分析结果表明HbPMADS2基因主要在橡胶树的茎尖、木质部、花序、雄花、以及雌花中特异性高调表达(图3)，表明HbPMADS2基因参与了橡胶树花器官与生殖发育进程。

4、HbPMADS2基因过表达载体构建

用XhoI和PstI两个限制性内切酶将含有酶切位点的19T-HbPMADS2基因载体和Pxcs-HAStrep载体切开(图4A)，然后分别回收目的片段连接、转化和验证。将重组质粒pXCS-HbPMADS2-HAStrep再进行双酶切(图4B)，得到两条酶切片段大约700bp和大于5000bp，片段大小符合预期，说明载体构建成功。

5、表达载体转化至拟南芥

①表达载体转化农杆菌感受态细胞，培养形成单菌落。将含有目的基因的菌落，接种到盛100ml含有三种抗生素的LB液体培养基(50mg/L的Amp，40mg/L的Rif，50mg/L的Gent)的锥形瓶中，放置在28℃、200rpm的摇床上，震荡培养至菌液OD600约为0.8。

②将菌液分装到50ml灭菌的离心管中，室温、5000rpm离心8min，保留沉淀，弃上清。

③加入20ml侵染液(4.4g/L MS、10μl/ml 6-BA、5％sucrase、0.03％MES和0.0012％L-77)，重悬浮菌体，再加侵染液使其OD600约为0.8。

④提前一天给开花的拟南芥浇水，侵染前把已经结荚的和开败的花剪掉，减少以后的筛选工作量。

⑤将拟南芥的花序浸泡在侵染液中10sce，等花序都侵染过后，将拟南芥放至光照培养箱中暗培养一天，然后再正常培养两天。

⑥重复步骤5两次。之后正常管理，直到收完种子。得到转基因T0代种子。

6、转基因拟南芥植株的筛选

将T0代拟南芥种子放在20mg/LBASTA的MS固体培养基上培养，培养两周后，转基因苗仍为绿色，不含目的载体的植株逐渐死去。待存活植株长到6片真叶时，对植株进行移栽。先洗去根上的培养基，将种植到营养土中。共转移出6株，标记为L1-L6。取每株的一两片叶粗提DNA，进行PCR验证。之后保留阳性植株，待种子成熟后，分株收种，得到T1代种子。然后再进行筛选，将T1代拟南芥种子放在30mg/LBASTA的MS固体培养基上培养，将后代分离比为3:1的存活的植株随机选取8株，移栽到营养土中，待种子成熟后，分株收种，得到T2代种子。再次进行筛选，选用不发生性状分离的株系做后续实验。

以T0代6个株系的DNA为模板，分别用bra基因引物和HbPMADS2基因引物进行PCR扩增。结果如图5所示，L1-L6株系都能扩增出400bp左右(bar)和700bp左右(HbPMADS2)的目的片段，说明这几个株系都是阳性植株。

7、转基因拟南芥植株的表型

选取后代存活分离比为3:1的两个株系L1和L2得到的纯合转基因种子和野生型的拟南芥种子，同时播种，在同样的培养条件，统计它们的形态学指标。分别统计了植株的莲座叶数目、莲座上的最长叶片的长度、抽薹两周后的株高、从种子萌发到开花的时间、以及果荚成熟时的长度。

结果如表1所示：在生育期、株高、以及开花时间基本一致的前提下，转基因株系的叶片长度与果夹长度都显著性高于野生型植株，表明转HbPMADS2基因能促进拟南芥叶片，以及果实的发育。从种子萌发到移栽的苗期阶段，我们可以看出转基因株系的根系长度都显著性长于野生型植株(图6A)，表明转HbPMADS2基因还能促进拟南芥根系发育。此外，通过局部观察，可以看出野生型植株的花序比较密集，开花较多，茎上的分枝也较多；而转基因植株花序上的每个小花比较分散，花序分枝较少，但苞叶较大(图6C)。

表1HbPMADS2的转基因植株表型的统计分析

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所

<120> 一种橡胶树花器官特征因子基因及其编码产物与应用

<130> 123445677

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 639

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> CDS

<223> HbPMADS2的基因编码序列

<400> 1

atgggaagag gaaagattga gatcagaagg attgagaacc cgagcaacag gcaagtgacc 60

tactcaaaga ggagaaatgg gatcatgaaa aaagctaagg agatcacagt tttatgtgat 120

gctcaggttt ccctggttat ctttgctagt tcggggaaga tgcatgagta ctgtagccct 180

tctactacgt tgattgatat gctggacaag tatcacaagc aatctggcaa aagccggctg 240

tgggatgcaa aacatgagga ccttagcaat gagattgata gaatcaagaa agagaatgac 300

aacatgcaga ttgagctcag gcacctgaaa ggggaggata tcacttcttt gcatcacgaa 360

gagctgggag tcatagagga agcccttgaa aaaggccttg ccactattcg tgacaaacag 420

atggaatact acaatatgaa gaagaaaaat gaaaagattt tggaagatat gaacaagcgc 480

ctgagcttca ttttgcaaca acaagagatg gctatcgaag agaatatgag ggagatggaa 540

aatccttatc atcaacagag ggtgagggac tacaattccc agatgccctt tgccttgagg 600

gtgcaaccaa ttcagccaaa tttgcaggag aggatgtaa 639

<210> 2

<211> 212

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> HbPMADS2蛋白编码序列

<400> 2

Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Arg Arg Ile Glu Asn Pro Ser Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Met Lys Lys Ala

20 25 30

Lys Glu Ile Thr Val Leu Cys Asp Ala Gln Val Ser Leu Val Ile Phe

35 40 45

Ala Ser Ser Gly Lys Met His Glu Tyr Cys Ser Pro Ser Thr Thr Leu

50 55 60

Ile Asp Met Leu Asp Lys Tyr His Lys Gln Ser Gly Lys Ser Arg Leu

65 70 75 80

Trp Asp Ala Lys His Glu Asp Leu Ser Asn Glu Ile Asp Arg Ile Lys

85 90 95

Lys Glu Asn Asp Asn Met Gln Ile Glu Leu Arg His Leu Lys Gly Glu

100 105 110

Asp Ile Thr Ser Leu His His Glu Glu Leu Gly Val Ile Glu Glu Ala

115 120 125

Leu Glu Lys Gly Leu Ala Thr Ile Arg Asp Lys Gln Met Glu Tyr Tyr

130 135 140

Asn Met Lys Lys Lys Asn Glu Lys Ile Leu Glu Asp Met Asn Lys Arg

145 150 155 160

Leu Ser Phe Ile Leu Gln Gln Gln Glu Met Ala Ile Glu Glu Asn Met

165 170 175

Arg Glu Met Glu Asn Pro Tyr His Gln Gln Arg Val Arg Asp Tyr Asn

180 185 190

Ser Gln Met Pro Phe Ala Leu Arg Val Gln Pro Ile Gln Pro Asn Leu

195 200 205

Gln Glu Arg Met

210

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物

<400> 3

cccatgggat gttccgtgtt tca 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物

<400> 4

gactagtctt atgatacgtg cctg 24

Claims

1.一种橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.一种权利要求1所述的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，其包含原始载体和权利要求1所述的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述原始载体为Pxcs-HAStrep载体，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列位于Pxcs-HAStrep载体的XhoI和PstI两限制性内切酶位点之间。

5.如权利要求1所述的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2、或者权利要求3或4所述的表达载体在促进植物叶片发育中的应用。

6.如权利要求1所述的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2、或者权利要求3或4所述的表达载体在促进植物果实发育中的应用。

7.如权利要求1所述的橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2、或者权利要求3或4所述的表达载体在促进植物根系发育中的应用。

8.一种在拟南芥中过表达橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2的应用方法，其特征在于，用权利要求3或4所述的表达载体重组质粒转化拟南芥。

9.一种用于扩增橡胶树花器官特征因子基因HbPMADS2的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。