CN109068605A - 单性结实植物及其产生方法 - Google Patents

Abstract

提供显示兼性单性结实的茄科植物。所述植物在SlAGL6基因中包含功能缺失突变，备选或额外地特征在于与相同遗传背景的非单性结实番茄在非单性结实番茄的受精许可条件下至少大约相同的平均果实重量/植物。还提供产生这种植物的方法和从这种植物产生的加工产品。

Description

单性结实植物及其产生方法

发明领域和背景

在其一些实施方案中，本发明涉及单性结实植物及其产生方法。

受精之后的果实发育对于完成植物生命周期是必要的。在番茄中，子房与其余花器官一致发育(生长期I，根据Gillaspy等人1993)，在开花前不久(1-2天)停止经历细胞分裂，因此进入“子房停滞”状态。仅当受精成功完成时，认为由幼胚产生的信号驱使子房重新开始生长。该生长最初涉及7-10天的快速细胞分裂和扩增期(称为II期) (Varga和Bruinsma 1986; Bohner和Bangerth 1988)，其后(III期期间)生长主要由细胞增大协同核多倍体化驱动(Joubes和Chevalier 2000，以及其中的参考文献)。一旦达到全尺寸，成熟过程开始。

受精依赖的果实发育的默认程序保障植物的适应性，因为不浪费资源支撑无用器官发育。或者，单性结实，即受精不依赖的无籽果实发育在不能营养繁殖的所有野生型种类中为反生产性状。然而使得在缺乏种子发育下能够果实发育的突变在包括番茄在内的许多作物的现代育种中相当重要，这由以下几个原因造成。

第一，小孢子发生过程和成熟的雄性配子对适度的高或低温，以及对极端的湿度或光强度极其敏感(El Ahmadi和Stevens 1979; Picken 1984; Sato等人 2006)。在许多重要蔬菜作物包括番茄、辣椒(Capsicum annuum)、茄子(aubergine) (Solanum melongena)和甜瓜的露地条件下这是全年的受精依赖的果实生产的主要障碍。因此，培育授粉不依赖的果实生产被认为是有价值的目标，特别是在在多种多样的环境条件下维持可持续农业的背景下(Gorguet等人2005; Ruan等人2012; Ariizumi等人2013, Shinozaki和Ezura 2016)。

第二，无籽在旨在用于挑剔的消费者的优良品种中是期需性状，所述消费者发现籽损伤各种果实的质量，所述果实包括：西瓜、葡萄、柑橘、苹果、梨、无花果、茄子、黄瓜、南瓜(squash)、番茄(特别地樱桃番茄)、香蕉和不同的仙人掌果实。

第三，在某些情况下发现其改善果实质量。例如，在番茄中，有报道无籽与提高的总可溶性固体的含量相关(Falavigna等人1978; Casas Diaz等人1987; Ficcadenti等人1999; Carmi等人2003)，似乎是因为较少的同化物从果实的果肉重新定位到种子。据报道认为，无籽延迟西瓜果实的老化和变质，这是因为籽是老化相关激素的来源(Adelberg等人1997)。

第四，在为了加工产品，例如番茄糊、红辣椒调味剂和罐头甜瓜而培养的作物中，无籽可为有利的，这是因为在分离种子与加工产品中消耗的能量可以节省。

最后，单性结实对于种子公司可为有益的，因为其帮助保护他们的变种。

由于番茄和可获益于单性结实的其它蔬菜通常从种子繁殖，因此仅兼性单性结实的基因源具有实用价值，其中有籽果实可在成功受精之后发育(Varoquaux等人2000)。当前，在番茄中最广泛表征的兼性单性结实的非转基因源为：三个单基因源，pat (Beraldi等人, 2004; 推测为突变的Solyc03g120910, Selleri 2011)、procera (突变的SlDELLA, Bassel等人, 2008)和entire (突变的SlAUX/IAA9, Mazzucato等人, 2015; Saito等人,2011)，其全部显示不期需的多效性作用。三个二基因源(digenic source)，pat-2 (Hazra和Dutta, 2010; Vardy等人, 1989b)、IL5-1和IVT-line1 (Gorguet等人, 2008)，均显示可接受的单性结实表型。尽管据报道pat-2与定型生长习性相关联(Lin等人1984)，并且果实尺寸通常比轮回亲本小一些(Vardy等人1989b)。以及下等寡基因源pat-3/pat-4 (Nuez等人, 1986; Philouze和Maisonneuve, 1978, Vardy等人1989b)。尽管该性状的重要性，在育种程序中利用这些突变体仍相当受限。其一些与轻度或严重的不期需的多效性作用相关联(例如，Ariizumi等人, 2013; Carrera等人, 2012; Lin等人, 1984; Mazzucato等人, 1998; Philouze 1989; Shinozaki和Ezura 2016)。二基因源的渐渗更加费力，特别是由于作为任何这三个二基因源基础的基因身份目前尚未报道(Shinozaki和Ezura 2016)。

先前已经报道，MADS-框基因调节花和果实发育(Yao 2001, Proc. Natl. Acad.Sci. 98(3):1306-1311; Rijpkema等人Plant J. 60(1):1-9, Wang等人2009 PlantCell. 21:1428-1452)。然而，在MADS-框基因遗传修饰的番茄中尚未曾观察到真正的单性结实(例如，Pnueli等人1994 Plant Cell 6(2):163-173; Amporah-Dwamena等人, PlantPhysiol. 2002 130(2):605-17, Pan等人2010, J. Exp. Bot. 61:1795-1806)，因为即使观察到，单性结实也总是表现为严重的同源异型畸变，而不是导致在不存在受精时发育缺乏种子的正常果实。

在其它种类中，沉默或突变SlAGL6同源的基因不引起单性结实：例如，碧冬茄属，其中单性结实未有报道(Rijpkema等人Plant J. 60(1):1-9)，拟南芥属，其中其影响开花和分枝时间但不引起单性结实(Koo等人2010)。敲除其黑种草(Nigella damascene)同源物影响萼片和花瓣结构，指示A-功能，但单性结实未报道(Wang等人, 2015)。在水稻中其导致严重的花形态学变化(Zhang等人2010, Duan等人2012)，与我们在番茄中观察到的表型大不相同，(在水稻中种子为无论如何不能严肃地谈论单性结实的产品)。

额外的相关背景技术：

美国专利申请20100146656

美国专利申请20090089902

美国专利申请20030217391

美国专利申请20070250945

美国专利6,268,552。

发明概述

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种茄科(Solanaceous)植物，其选自番茄、辣椒(pepper)和茄子，显示兼性单性结实并且在AGL6基因中包含功能缺失突变。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种茄科植物，其选自番茄、辣椒和茄子，显示兼性单性结实和与相同遗传背景的非单性结实番茄至少大约相同的平均果实重量/植物。

根据本发明的一些实施方案，所述茄科植物进一步显示以下至少之一：

(i) 与相同遗传背景的非单性结实番茄在非单性结实番茄的受精许可条件下至少大约相同的果实产量/植物；

(ii) 与相同遗传背景的非单性结实番茄在非单性结实番茄的受精许可条件下至少大约相同的平均果实重量/植物；

(iii) 当所述茄科植物为番茄时包含胶状物填充；

(iv) 至少80%的果实产量缺乏同源异型畸变；和

(v) 无籽果实内从非受精子房发育的扩大的胚珠。

根据本发明的一些实施方案，果实产量为红色果实产量。

根据本发明的一些实施方案，所述植物为番茄。

根据本发明的一些实施方案，所述植物为加工番茄。

根据本发明的一些实施方案，所述植物为定型(determinate)番茄。

根据本发明的一些实施方案，所述植物为不定型番茄。

根据本发明的一些实施方案，所述植物为半定型番茄。

根据本发明的一些实施方案，所述植物为良种系(elite line)。

根据本发明的一些实施方案，所述植物为转基因的。

根据本发明的一些实施方案，番茄为选自普通番茄(Lycopersicon esculentum)、樱桃番茄(Lycopersicon cerasiforme)、醋栗番茄(Lycopersicon pimpinellifolium)、契斯曼尼番茄(Lycopersicon cheesmanii)、小花番茄(Lycopersicon parviflorum)、克梅留斯基番茄(Lycopersicon chmielewskii)、多毛番茄(Lycopersicon hirsutum)、潘那利番茄(Lycopersicon penellii)、秘鲁番茄(Lycopersicon peruvianum)、智利番茄(Lycopersicon chilense)和类番茄茄(Solanum lycopersicoides)的种类。

根据本发明的一些实施方案，番茄选自每桁架单果(single fruit per truss)、分支番茄和樱桃番茄。

根据本发明的一些实施方案，兼性单性结实在热或冷应激下显示。

根据本发明的一些实施方案，所述植物为自交系。

根据本发明的一些实施方案，所述植物在AGL6基因中包含功能缺失突变。

根据本发明的一些实施方案，功能缺失突变为纯合子形式。

根据本发明的一些实施方案，所述植物包含用于抑制AGL6基因表达的沉默剂。

根据本发明的一些实施方案，植物外源表达选自大范围核酸酶、RNA引导的DNA内切核酸酶、锌指核酸酶和TALEN的核酸酶。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供所述植物的果实。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供所述植物的种子。

根据本发明的一些实施方案，种子为杂种种子。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供所述植物或果实的可食用加工产品。

根据本发明的一些实施方案，加工产品选自番茄糊、番茄酱、番茄沙司、番茄汤、番茄汁、番茄粉、番茄切块、压碎的番茄、切碎的番茄和番茄浓缩物。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供产生所述植物的方法，所述方法包括下调植物中AGL6基因的表达或活性。

根据本发明的一些实施方案，下调通过用诱变剂处理植物或其再生部分实现。

根据本发明的一些实施方案，下调通过用RNA沉默剂处理植物实现。

根据本发明的一些实施方案，下调通过用DNA编辑剂处理植物实现。

根据本发明的一些实施方案，所述方法包括使植物自交或杂交。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种育种方法，包括使植物自交或杂交。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文所描述的那些相似或相当的方法和材料可用于实践或检验本发明的实施方案，但下文描述了示例性的方法和/或材料。如果冲突，以本申请说明书，包括定义，为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的，并且不意在必然限制。

附图简述

本发明的一些实施方案在本文中，仅以例示的方式，参考附图描述。现在具体详细参考附图，强调所显示的细节为举例，并且为了说明性讨论本发明的实施方案的目的。就此而言，说明书连同附图使得可如何实践本发明的实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。

在附图中：

图1A-I显示突变2012使得能够在极端热应激下单性座果。单性结实的BC₁F₂子代在2010年极热的夏天(7-8月)期间从花发育结出高质量果实，并在20.9.2010收获。(图1A-C)：M82系植物不结任何正常果实，仅极小的、空心的“坚果”小果实。与(图1D-F)相比：BC₁F₂群体的单性结实同胞，其在相同条件下结出许多红色高质量果实。性状的稳定性在下一个夏季证实。BC₁F₂子代在2011年的晚夏生长。(图1G)尽管单性结实的同胞确实结出高质量完熟果实，(图1H)非单性结实的同胞仅结出极小的“坚果”果实，或少数带几个籽的膨胀小果实。果实在27.9.2011收获。(图1I)该日期收获的单性结实的红色果实的重量显著(t-检验，p<0.001)高于从非单性结实的同胞收集的果实(大多绿色)。

图2A-B描述SLAGL6。(图2A) MADS框蛋白SlAGL6的蛋白质序列。MADS框用深灰色突出显示，K-框用浅灰色突出显示。(图2B) SlAGL6的ORF；交替的外显子用实线和虚线加下划线。将作为突变体2012基础的C268/t突变标记。为CRISPR/cas9修饰选择的靶指导序列在序列上方以粗黑线呈现，邻近的PAM (其反向互补)通过虚线描绘，箭头标记Cas9切割靶位点，AclI限制位点(AACGTT)突出显示为灰色，所述AclI限制位点预期被Cas9诱导的突变破坏。

图3A-F显示CRISPR/cas9诱导的突变的SlAGL6等位基因纯合的植物中的单性结实。(图3A)亲本WT系MP-1的有籽果实。(图3B) R₀植物sg4 (携带二等位基因突变)的sg4-2R₁子代的无籽果实。(图3C) sg1-21 (R₀植物sg1中发现的突变形式的纯合子子代)的无籽果实，vs. (图3D) sg1-20 (杂合同胞子代，仅结有籽果实)的果实。(图3E) sg5-101 (R₀植物sg5中发现的突变形式的纯合子代)的无籽果实，vs. (图3F) sg5-39 (杂合同胞子代，仅结有籽果实)的果实。在基因型描述中，(+)代表WT等位基因，(m)代表所有诱导的不同突变形式的SLAGL6。

图4A-C显示去雄的和非去雄的单性果实的胎座上发育的相似扩大的胚珠。(图4A)将单性结实的CRISPR衍生的植物sg5-79 (m/m)的花在开花前去雄，并通过彩色标签标记(上组图右侧的果实)。从同一植物上发育的去雄的和非去雄的果实(上组图左侧的果实)收集的扩大的胚珠的尺寸和外观在尺寸和外观上无不同(中间组图)。(图4B) 为了比较而呈现从杂合子同胞sg5-52收集的种子。该果实小，由于其结的籽非常少，此外，其籽比在环境温度而非高温下发育的果实中所发育的那些小(数据未示出)。(图4C) 中间行组图中呈现的胚珠的更大的量值。所有呈现的果实在同一日期，30.9.2015收集。

图5A-C显示具有不同SNP No. 3 (SlAGL6)基因型的2012 BC₂F₂植物以及亲本系M82的产量分析。(图5A)由于单性结实植物极度显示更集中的果实发育和成熟(参见图6A-F)，为了评估突变的基因型对生产潜能的作用，将达到至少几乎成熟的绿色阶段的所有果实的产量包括在所呈现的分析中，显示不同基因型的2012的总产量潜能与M82无不同。(图5B) (m/m)单性结实植物的可销售的红色果实产量显著(p < 0.001)高于M82系或SNP No.3非纯合的同胞。(图5C) 从单性结实(m/m)衍生的红色果实的平均重量为显著高于亲本系M82的唯一一个。在每一组中，伴随不同小写字母的条显著不同。

图6A-F为从来自2012 BC₂F₂群体的代表性单一植物收获的果实。突变的SNP. No.3 (agl6)的纯合子以迅速均匀的果实成熟为特征。在上方的四个组图中，呈现从特定基因型的单一植物采摘的果实的总产量(除极小的“坚果”之外)。如清楚显示的，不像M82，(图6A)和WT等位基因纯合的(+/+)(图6B)或SNP No. 3杂合的(图6C)的BC₂F₂植物，(m/m)植物的大部分果实(图6D)为完熟的。所有植物在同一日期(10.6.2014)收获。当在其收获前检查植物时，(m/m)植物产量的集中性质清楚可见，(图6F)，相对于(+/m)植物上非集中的果实发育(图6E)。

图7A-N显示亲本系MP-1和SlAGL6突变系sg1-8 (R₂)的外观比较。(图7A) 植物的生长习性无不同，(图7B) 叶形状相似，比例尺 = 8cm。(图7C) 第一个花序在相似数目的真叶后出现(Mann-Whitney秩和检验，P = 0.371)。(图7D) 花相似，除了sg1-8的花瓣更苍白，并且比MP-1的那些窄和长一些。花粉能育性在MP-1 (图7E)和sg1-8 (图7F)中相似。呈现的为具有相似伸长的花粉管的体外萌发的花粉粒，孵育18 h后拍照，比例尺= 100 μm。(图7G-N) sg1-8系的单性果实的果皮(图7G-J)与相似重量和尺寸的MP-1的有籽果实(图7K-N)相似(图7G,K比例尺=2cm)。(图7H,L)果皮宽度和形状相似，比例尺 = 1000 μm。维管束边缘和外皮层(外果皮)之间的层中的细胞(图7I,M)，以及维管束边缘和内皮层(内果皮)之间的那些(图7J,N)外观相似，图7I, 7J, 7M, 7N比例尺 = 500 μm。照片(图7H–J和L-N)为取自G、K中呈现的几乎成熟的绿色果实的中间(赤道)的薄的徒手横切面，并在倒置光学显微镜下拍照。sg1-8系对于SlAGL6突变，并且缺乏Cas9盒，其携带表4A中描绘的突变sg1。

图8A-D显示2012 BC₂F₂ (m/m)单性果实的典型形状。(图8A) “Gamba样”较大果实。(图8B)椭圆形果实，上组图—纵向侧视图，下组图—横切视图，最大的果实无籽，较小的果实结很少籽，其中一些用箭头标记。(图8C)单一桁架上发育的相似尺寸的许多椭圆形果实，呈现的所有果实均来自同一桁架，12个中的9个为完熟阶段(左侧组图)，来自同一植物的横切果实(右侧组图)。与(图8D) M82有籽果实相比。在所有组图中比例尺=10cm。

图9A-B显示在较大的果实背景中2012突变的表现。(图9A) Marmande和对于突变的SNP No. 3 (Slagl6)纯合的单性结实2012植物之间杂交的F₂子代之中平均果实重量(g)和无籽的分布。仅呈现对于突变的SNP No. 3纯合的子代，与亲本系的单一植物的平均果实重量相比。灰色条代表的F₂植物确实结无籽果实。包含星号(*)的条为果实在(图9B)中呈现的那些。注意植物#521的一些单性果实在尺寸和形状上与Marmande果实的那些相似。比例尺 = 10 cm。

图10显示与亲本系MP-1相比，CRISPR/Cas9 SlAGL6突变系sg1的R₁子代的有籽、次有籽(under-seeded)和无籽果实的平均重量。伴随与1H all (所有杂合的sg1子代的结籽果实的平均重量)相似的小写字母的空心条(单性果实)无显著不同(t-检验，p<0.05)。条内用与MP-1 all条(MP-1植物的结籽果实的平均重量)不同的数字标记的空心条(单性果实)显著不同(p<0.05，根据t检验或Mann-Whitney检验)。内部用相同的A字母标记的条无显著不同(Anova, 多范围检验)。

图11显示2012突变的SlAGL6等位基因纯合的植物和sg1突变的等位基因纯合的植物之间的杂种产生无籽果实，而同一2012植物和MP-1 (野生型)之间的杂种仅产生有籽果实，表明2012和sg1突变形式的SlAGL6的等位性。

图12显示当既不去雄也不振动花时，三个不同的CRISPR诱导的SlAGL6突变sg1、sg4和sg5中显示的单性结实的兼性性质。

图13A-H显示Slagl6单性结实改善热应激下的产量。与MP-1系相比，sg1系显示显著更高的：(图13A) 红色果实产量，(图13B) 红色果实数目，(图13C) 红色果实重量，和(图13D)白利糖度(Brix)，而(图13E) 果实pH保持不变。图13A-E中呈现的数据衍生自在4个重复上进行的实验，如在材料和方法中详述的。(图13F,G) 部分落叶的MP-1 (图13F)和sg1(图13G)植物之间果实载量的差异，在收获前拍照。(图13H) 2016年夏季期间盛行的热应激条件，当比较MP-1和Slagl6系sg1的产量时。20.4.2016将幼苗种植在网棚中，26.6.2016第一次收获(图13A-E中的数据，从该次收获获得)。注意14-16.5.2016之间格外高的昼夜温度(图13H)。sg1系(R₂)为sg1突变纯合的，并且缺乏Cas9盒。

本发明具体实施方案的详述

本发明，在其一些实施方案中，涉及单性结实植物及其产生方法。

详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明在其应用中不一定限于下列说明书中阐述的或实施例所例示的细节。本发明能够有其它实施方案或能够以不同的方式实践或进行。

当将本发明转化为实践时，本发明人证明MADS框基因无性生殖样6 (Agamous like 6) (SlAGL6)的(各种)突变等位基因在番茄中赋予虽然兼性但是强的单性结实，并且无任何可见的多效性作用，因此致使其成为番茄中一个新的有用的单性结实源。

具体地，本发明人已经确定EMS诱变的番茄群体中发现的单性结实2012突变体(在定型加工品种M82背景中产生)由在前89个aa之后包含提前终止密码子的突变的SlAGL6基因引起。其鉴定基于NGS数据的生物信息学分析接着分子标记辅助的SNPs绘图 (表1、2、3；图1A-I、5A-C、6A-F、8A-D)。该发现通过利用CRISPR/cas9技术仅突变SlAGL6 (图2A-B)以及在不定型系MP-1的背景中(表4B、5、6，图3A-F)从新产生相同单性结实表型验证。2012作为突变SlAGL6的身份的额外证据通过显示纯合2012与纯合CRISPR突变体sg1之间的F₁杂交产生无籽子代(图11)而提供。

纯合状态的该突变使得能够在严重阻碍未携带纯合状态突变的植物的产量(图13A-C)的慢性热应激(图13H)下以及在极端热和冷条件下果实发育，以致于实际上防止未携带纯合状态的突变的植物的产生(图1)。

该突变不负面影响植物的生产潜能(图5A-C)，或营养发育。在定型背景中，其改善产品的集中(图5A-C, 6A-F)，此为对于露地生长的定型加工番茄品种极端重要的性状，并且预期产生集中的作物，其通过单一机械收获收集。室外生长有暴露于短期极端波动温度的风险，这损伤花粉发育，因此极度减少可销售的产量。这继而废除连续开花阶段的产量，导致不一致的成熟和严重的产量损失。该风险在Slagl6 单性结实突变体中最小化。突变使得能够在不定型系MP-1中在非常高或低的温度下结实和发育，因此将其引入市售半定型或不定型新鲜市场品种中将确保数月连续生产，而不损失在授粉限制环境条件下桁架开花的产量。

重要地，当进一步构想本发明的实施方案时，本发明人意识到相同的教导可应用于具有肉质果实的其它茄科植物，即，辣椒和茄子。因此，根据本发明的实施方案，本公开内容涉及该茄科植物亚类，尽管认为每一植物种类是一个独立的实施方案。

因此，根据一个方面，提供一种茄科植物，其选自番茄、辣椒和茄子，显示兼性单性结实并且在AGL6基因中包含功能缺失突变。

备选或额外地，提供一种茄科植物，其选自番茄、辣椒和茄子，显示兼性单性结实和与相同遗传背景的非单性结实番茄至少大约相同的平均果实重量/植物。

如本文所使用的术语“植物”包括全植物，嫁接植物，植物和植物部分包括种子、苗、茎、根、砧木、接穗以及植物细胞、组织和器官的祖先和子代。植物可为任何形式，包括悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

番茄植物可为栽培遗传背景或野生番茄遗传背景。

如本文所使用的，术语“番茄”指种类Solanum lycopersicum (同义词为Lycopersicon lycopersicum或普通番茄(Lycopersicon esculentum))或以前在属名番茄属(Lycopersicon)下已知的种类内的植物、系或群，包括但不限于樱桃番茄、契斯曼尼番茄、智利番茄、克梅留斯基番茄、普通番茄(现在S. pennellii)、多毛番茄、小花番茄、潘那利番茄、秘鲁番茄、醋栗番茄或类番茄茄。新提出的普通番茄的科学名称为S. pennellii，类似地，野生型种类的名称可变化。潘那利番茄变成S. pennellii，多毛番茄可变成S.habrochaites，秘鲁番茄可拆分成S. `N peruvianum`和S. `Callejon de Hueyles`、S.peruvianum以及S. corneliomuelleri，小花番茄可变成S. neorickii，克梅留斯基番茄可变成S. chmielewskii，智利番茄可变成S. chilense，契斯曼尼番茄可变成S.cheesmaniae或S. galapagense，以及醋栗番茄可变成S. pimpinellifolium。

一般地栽培番茄指适合消耗并且满足商业栽培需求的番茄，例如，典型地分类为Solanum lycopersicum。除了番茄植物本身，及其适合消耗的部分，例如果实，本发明还包括适于繁殖的植物部分或衍生物。适于繁殖的部分的实例为器官组织例如叶、茎、根、苗等、原生质体、体细胞胚、花药、叶柄、培养细胞等。适于繁殖的衍生物为例如种子。根据本发明的植物可以以常规方式但是也可以以从植物部分组织培养技术的方式栽培或繁殖。

本发明旨在使用任何番茄品种，例如家用、新鲜市场番茄和加工番茄。

变种的选择取决于市场需求、地区适应性、疾病抗性和产品的最终用途。新鲜市场番茄的示例性段(segment)包括，但不限于Beef (果实重量约220-400 gr), Standard (果实重量约160-220 gr)和Cluster (均匀的果实重量，约120-180 gr)。这些变种从主要的种子公司可得，例如，Grodena、Macarena、Estatio、Zouk、Climbo和Climstar，所有均从Syngenta可得。其它变种可为专利的，或从其它供应商可得，包括但不限于，Cherry-微小(至多5 gr)圆形樱桃、迷你圆形樱桃(7.5-15 gr)、迷你紫红色细长樱桃(10-25 gr)。这些变种的实例为Creativo (Clause)、Batico (Nirit种子)、Shiren (Hazera Genetics)。Cocktail圆形和细长(25-40 gr)：Romanita、Cherry和Cocktail，具有红色、黄色、橙色、粉色、斑马、巧克力背景。实例包括，但不限于，Summer sun (Hazera Genetics)、Black pearl(Burpee)、Tyty (Tomodori)，Roma定型和不定型120-200gr。中间标志(intermediatemarker)的实例包括，但不限于，lancelot (Vilomorin)和Parsifal (Vilomorin)。粉色番茄分为beef (220-400)、standard (160-220)和cluster (120-180)。实例：Momotaro型、Cor di bue 番茄(150-350 gr)、Pinton (250-300 gr)、露地番茄- 定型或半定型(180-400gr)。

示例性的加工番茄品种包括，但不限于，Roma、SUN 6366、AB 2、Heinz 9780、Heinz9557、Halley 3155和Hypeel 303。

存在2种主要类型的番茄生长：定型和不定型。定型生长产生“灌木”番茄，其为紧密性而培育。一旦末梢果实成熟，整个植物停止生长，其余所有果实几乎同时成熟，然后植物死亡。不定型生长产生可生长多达10英尺高的番茄(所谓的“藤本”番茄)，其将仅在(例如被霜冻)杀死时停止生长。其果实连续成熟。在典型的植株中，所有生长均源自模块合轴单元的重复，每一单元产生三片叶和和一个多花花序。大多数露地生长的番茄变种，包括M82，为定型植物，其苗产生平均6个合轴单元，每一含有单一花序，其中在早熟的生长终止之前叶数目逐渐减少。一般而言，定型番茄适于露地生产。半定型和不定型“栽培的”变种适于在露地或受保护的网中打桩培养以及适于温室培养。

根据本发明的实施方案，番茄植物为定型番茄。

根据本发明的实施方案，番茄植物为不定型番茄。

根据本发明的实施方案，番茄植物为半定型番茄。

根据实施方案，番茄选自每桁架单个果实、分枝番茄和樱桃番茄。

如本文所使用的“辣椒”指栽培种类"Capsicum (后文称为"C") annuum"，或野生种类"C. pubescens"、"C. baccatum"、"C. chinense"和"C. frutescens”。此外，“辣椒”为包括以“辣椒”之外的名字称呼的植物的概念，例如，称为“多香果(piment)”、“红辣椒”和“甜椒”的园艺作物。

如本文所使用的“茄子”指栽培种类"Solanum (后文称为"S") melongena"或野生种类"S. incanum"、"S. torvum"、"S. nigrum"、"S. aethiopicum"、"S. macrocarpon"和"S. quitoense”。

将理解的是，术语“单性结实”、“单性果实形成”“无籽”和“受精不依赖的果实形成”在本文中可交换地使用。

如本文所使用的“单性结实”指不存在受精的果实生产。因此，根据一些实施方案，单性果实特征在于无籽或每一果实小于5个籽。

有性生殖能力的维持在产生结籽果实时显而易见。

例如，在番茄中认为结籽果实是每一果实至少10个籽或当携带野生型SlAGL6等位基因时同一品种所产生的籽的至少15%。

兼性单性结实指在受精限制条件下的无籽果实形成，例如非生物应激条件，例如温度应激，即热或冷应激、湿度、光强，其可为急性或慢性的。

一般而言，偏离最佳温度5-15 ℃阻碍受精依赖的结实。

根据一些示例性的实施方案，稳定结实的平均每日温度范围如下提供：番茄13-25℃，茄子16–25 ℃，甜椒18–25 ℃ (如Karapanos等人2008, Kawasaki 2015所综述的)。因此，冷应激与这样的低温有关，其阻止有活力的花粉产生。对于多数番茄品种，其意指夜间温度在10 ℃以下持续超过3-4 h，但减少的活力已经在12 ℃以下遇到，特别是在花粉发育的减数分裂后阶段期间，即开花后-5 - +2天。温度低于10 ℃还损伤花粉对柱头的粘附及其萌芽和花粉管伸长(Picken 1984)。通常，热应激在温度升高至植物生长和发育最佳以上5-15 ℃时发生(Sato等人2006, Mesihovic等人2016，以及其中的参考文献)。在番茄中，取决于变种，日温36 ℃ - 38 ℃以上持续2-4 h和夜温18-20 ℃及以上损伤小孢子发生过程，其对开花后-9 - -5天之间温度≥ 35 ^oC持续2-4 h的热应激尤其敏感，因此导致结实严重减少(例如，参见图13A中MP-1系)。

在辣椒中，花粉产生过程对热应激敏感。具体地，早期花发育(对应于小孢子母细胞减数分裂，开花前14-17天)期间，以及晚期花发育(对应于小孢子成熟、开花和授粉，开花之前-2 - 0天)期间暴露于温度33℃导致对结实最严重的有害作用(Erickson和Markhart2002)。如果花芽暴露于10℃或更低，辣椒雄性能育性严重受损。甚至当夜温低于15.5 ℃或高于24 ℃时结实已经受损。在茄子中，作物对低温敏感，夜温10 ℃或更低时结实受损。花粉产生和受精在小孢子发生期间温度35 ℃以上时也受损(Karapanos等人2008, Kawasaki2015)。

因此，根据本发明的一些实施方案，果实在热和冷应激条件下以及阻碍受精-依赖的结实的高湿度(≥ 90%)或低光强下产生。

在这种情况下兼性单性结实具有很高的商业价值，这是因为茄子、番茄和辣椒从种子繁殖。备选或另外，果实甚至在优先阻碍花粉产生和/或受精的非生物应激(例如，适度极端的温度、极端的高或低湿度)或在阻碍受精的任何其它条件例如遗传性雄性不育下产生。

观察到的表型在各种遗传背景中明显，如实施例部分中所显示的，其中果实重量维持在(1) 分离的2012 BC₂F₂群体(定型品种M82背景)，(ii) 从大果实半定型品种Marmande和单性结实2012植物之间的杂交衍生的分离的F₂群体，和(iii) 在不定型MP-1系背景下CRISPR/Cas9衍生的sg1系的R₁子代的单性果实中观察到。

如本文所使用的，“AGL6”指一种转录因子，其为强加于开花的“子房停滞”状态和受精触发的结实之间的转变的关键调节基因。

当茄科植物为番茄时，则AGL6基因为SlAG6基因，即Solyc01g093960编码序列，SEQID NO: 1, 2, 3。

当茄科植物为茄子时，则AGL6基因为Sme2.5_06058.1 SEQ ID NO: 7, 8, 9。

当茄科植物为辣椒时，则AGL6基因为Capana01g001334 (Chr01-44476983-44483323) SEQ ID NO: 4, 5, 6。

技术人员将知道如何发现栽培种类内不同品种的序列信息。

如本文所使用的，短语“功能缺失的变化”指基因(在该情况下AGL6)的DNA序列中的任何突变，其导致表达产物即，mRNA转录物和/或翻译的蛋白质的表达水平和/或活性下调。这种功能缺失的变化的非限制性实例包括错义突变，即将蛋白质中的氨基酸残基变成另一个氨基酸残基从而消除蛋白质的调节活性的突变；无义突变，即在蛋白质中引入终止密码子的突变，例如，导致缺乏调节活性的更短的蛋白质的早期终止密码子；移码突变，即，一种突变，通常为核酸缺失或插入，其改变蛋白质的读数框并且可能通过在读码框内引入终止密码子导致早期终止(例如截短的蛋白质，缺乏调节活性)，或导致更长的氨基酸序列(例如，通读蛋白)，这影响蛋白的二级或三级结构，导致无功能的蛋白，缺乏非突变多肽的调节活性；通读突变，由移码突变或修饰的终止密码子突变(即，当终止密码子突变为氨基酸密码子时)引起，伴随消除的调节活性；启动子突变，即启动子序列中的突变，通常基因转录起始位点的5'，其导致特定基因产物的下调；调节突变，即基因上游或下游或内部的突变，其影响基因产物的表达；或缺失突变，即，缺失基因序列中的编码核酸的突变，其可能导致移码突变或框内突变(编码序列内，缺失一个或多个氨基酸密码子)；插入突变，即，在基因序列中插入编码或非编码核酸的突变，其可能导致移码突变或框内插入一个或多个氨基酸密码子；倒位，即导致倒转的编码或非编码序列的突变；剪接突变，即导致异常剪接或差剪接的突变；和重复突变，即导致复制的编码或非编码序列的突变，其可为框内的或可导致移码。

根据具体的实施方案，基因的功能缺失的变化可包括基因的至少一个等位基因。

如本文所使用的术语“等位基因”指基因座的一个或多个替代形式的任一个，所有等位基因与性状或特征相关。在二倍体细胞或有机体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的对应的基因座。

根据其它具体的实施方案，基因的功能缺失的变化包括基因的两个等位基因。在这种情况下，例如AGL6可为纯合形式或杂合形式。根据该实施方案，纯合性为其中例如AGL6基因座处的两个等位基因以相同的核苷酸序列为特征的情况。杂合性指例如AGL6基因座处的基因不同的情况。

根据具体的实施方案，功能缺失突变为纯合或杂合形式，而二者均编码功能异常的产物。

根据具体的实施方案，功能缺失突变为缺失，例如，例如SlAGl6的外显子2。

根据具体的实施方案，功能缺失突变引起提前终止密码子。

根据一些实施方案，本发明的兼性单性结实的植物(如本文所使用的“植物”)显示以下至少之一：

(i) 与相同遗传背景的非单性结实番茄在非单性结实番茄的受精许可条件下至少大约相同(例如，80 %、90 %、100 %、110 %)的果实产量/植物；

(ii) 与相同遗传背景的非单性结实番茄在非单性结实番茄的受精许可条件下至少大约相同的平均果实重量/植物；

(iii) 当所述茄科植物为番茄植物时包含胶状物填充；

(iv) 至少80%的果实产量缺乏同源异型畸变；和

(v) 红色无籽单性果实内扩大的胚珠。

如本文所使用的“大约相同”指在相同发育阶段和在相同条件下± 10 %或20 %。

如本文所使用的“果实产量”指可销售的收获的果实的总重量，其为每一植物的果实数目乘以收获的果实的平均重量的乘积。

“相同的遗传背景”指植物和非单性结实植物之间共享至少95 %、96 %、97 %、98%、99 %或99.9 %的基因组。

如本文所使用的“胶状物填充”指在果实的小腔内流质到半流质的填充。

如本文所使用的“同源异型畸变”指植物的解剖结构，例如花或果实结构中的发育畸变，其关于构成野生型(WT)花的轮数或器官形状偏离正常的花形状，或除了缺乏正常的籽(单性结实固有的)之外果实形状、尺寸和内部结构与有籽果实明显不同。

如本文所使用的“扩大的胚珠”指成熟无籽果实中观察到的小的假籽(例如，如图4C中)。

然而，就茄子而言，应指出果实在不同的尺寸可收获。

根据具体的实施方案，当植物为定型番茄植物时，果实产量为产量集中，其中4-6阶段的果实几乎同时成熟。

根据具体的实施方案，植物为良种系。番茄良种系的实例为本领域所已知，其一些在本文中列出。

良种辣椒品种的实例包括，但不限于，Bastille、Rampart、Bayonet、Cutlass、Lafayette、Crusader、Pageant、Rising Sun、Trifecta (Syngenta)、Atir、Gilad、Serenada、Vilmorin: E5661 F1、RIFLESSI、Lussac、Vivaldi、Tyson (Hazera Genetics)、Razer、E20B10015 (Enza Zaden)、Alma Paprika Peppe等。

茄子优良品种的实例包括但不限于，杂交品种：Classic、Dancer、Dusky、FairyTale、Ghostbuster、Nadia、Purple Rain。

根据具体的实施方案，植物为转基因植物(例如，对于基因组编辑剂或RNA沉默剂，如下文所描述的)。

根据具体的实施方案，植物可为转基因植物但转基因可能与兼性单性结实无关(即不是其原因)，如本文所描述的。例如，转基因可发挥功能以改善生物应激抗性、杀虫剂抗性或非生物应激抗性。

根据具体的实施方案，植物包含二倍体基因组。

根据具体的实施方案，植物为自交系。

根据具体的实施方案，植物为杂种植物，或种子为杂种种子，其中例如，每一亲本系为如本文所描述的对于AGL6功能缺失突变纯合的。

产生如本文所描述的植物的方法可依靠使用诱变剂例如EMS或基因工程改造，后者天然地为更定向的方法，因此涉及较少的育种步骤。

因此，根据本发明的一个方面，提供产生如本文所描述的植物的方法，所述方法包括下调植物中AGL6基因的表达或活性。

下面为在AGL6基因中诱导功能缺失突变的方法的非限制性描述，其可用于产生所述植物。

因此，根据本发明的一些实施方案，下调AGL6通过用诱变剂处理植物或其再生部分实现。在这种情况下植物为用诱导AGL6下调的试剂非遗传修饰的。

备选或另外，造成兼性单性结实性状的遗传事件的发生可通过将植物(即，番茄、辣椒、茄子)或其部分暴露于化学或物理诱变剂(如实施例部分所描述的)实现。化学诱变剂的实例包括，但不限于亚硝酸、烷化剂例如甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、硫酸二乙酯(DES)和碱基类似物例如5-溴-脱氧尿苷(5BU)。物理诱变剂包括辐射(例如快中子、γ辐射)。

最初暴露通常伴随额外的自交、选择、杂交和自交或其组合步骤，其中任何步骤可重复超过一次，只要AGL6基因的功能丧失为纯合形式。选择可为表型的，或使用标记辅助的育种，如后文所进一步描述的。

根据另一个具体的实施方案，非遗传修饰的本发明的植物由多次杂交/自交招致的自发的遗传事件引起。

下面为用于在植物中实现敲除(也称为“基因组编辑”)和转录沉默的平台技术的描述。

向目的基因(在该情况下AGL6)中引入核酸变化的方法为本领域所熟知[参见例如Menke D. Genesis (2013) 51: - 618; Capecchi, Science (1989) 244:1288-1292;Santiago等人Proc Natl Acad Sci USA (2008) 105:5809-5814; 国际专利申请号WO2014085593、WO 2009071334和WO 2011146121；美国专利号8771945、8586526、6774279和UP专利申请出版号20030232410、20050026157、US20060014264; 其内容通过引用以其整体结合]，包括靶向同源重组、位点特异性重组、PB转座酶类和通过工程改造的核酸酶基因组编辑。用于向目的基因中引入核酸变化的试剂可为设计的公开可用的源或从Transposagen、Addgene和Sangamo Biosciences市售获得的。

下面为用于向目的基因中引入核酸变化的各种示例性方法和用于实现这一点的可按照本发明的具体实施方案使用的试剂的描述。

任何下列方法可定向于AGL6基因的任何部分，只要实现功能丧失。在具体的实施方案中，试剂定向于编码SlAGL6氨基酸坐标aa 172-252所对应的基因的c端部分的核酸部分，其对于番茄、茄子和辣椒不同。备选或另外，试剂定向于基因的其它部分，例如，如实施例部分中所描述的编码AA 71-80的位置。其它实例在后面的实施例部分提供。

当需要时，进行进一步的自交步骤以获得纯合形式的突变。

如本文所使用的“靶序列”指AGL6 DNA编码或RNA转录物。将理解的是，AGL6也可使用AGL6抗体或化学抑制剂在蛋白质水平被下调。尽管该选择未在本文中详细讨论，其仍被认为是用于产生所述植物的实施方案。

使用工程内切核酸酶的基因组编辑—该方法是指使用在基因组的所需位置处切割并产生特定双链断裂的人工工程核酸酶的反求遗传学方法，所述双链断裂然后通过细胞内源过程例如同源指导修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)得到修复。NHEJ直接连接双链断裂中的DNA末端，而HDR利用同源序列作为模板用于在断裂点再生缺失的DNA序列。为了将特定的核苷酸修饰引入基因组DNA，含有所需序列的DNA修复模板在HDR期间必须存在。基因组编辑不能使用传统的限制性内切核酸酶进行，因为大多数限制性内切酶识别DNA中的少数碱基对作为其靶标，且所识别的碱基对组合将存在于基因组中的许多位置，导致多个切割不限于所需位置的概率非常高。为了克服该挑战并产生位点特异性单链或双链断裂，迄今发现了若干不同类别的核酸酶并经生物工程改造。这些包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统。

大范围核酸酶—大范围核酸酶通常被分成4个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cys框家族和HNH家族。这些家族的特征在于影响催化活性和识别序列的结构基序。例如，LAGLIDADG家族的成员的特征在于具有一个或两个拷贝的保守的LAGLIDADG基序。就保守的结构元件和因此DNA识别序列特异性和催化活性而论，将大范围核酸酶的4个家族彼此大大区分开来。大范围核酸酶通常存在于微生物物种中，具有有极长的识别序列(>14bp)的独特性质，因此使其当然非常特异性地在所需位置切割。这可被用于在基因组编辑中产生位点特异性双链断裂。本领域技术人员可以使用这些天然存在的大范围核酸酶，然而这类天然存在的大范围核酸酶的数目是有限的。为了克服该挑战，采用诱变和高通量筛选方法以产生识别独特序列的大范围核酸酶变体。例如，不同的大范围核酸酶经融合以产生识别新序列的杂交酶。或者，可改变大范围核酸酶的DNA相互作用氨基酸以设计序列特异性大范围核酸酶(参见例如美国专利8,021,867)。可采用描述于例如Certo, MT et al. NatureMethods (2012) 9:073-975；美国专利号8,304,222；8,021,867、8,119,381、8,124,369、8,129,134、8,133,697、8,143,015、8,143,016、8,148,098或8,163,514 (其内容通过引用以其整体结合到本文中)的方法，设计大范围核酸酶。或者，可采用商购可获得的技术例如Precision Biosciences' Directed Nuclease Editor™基因组编辑技术，获得具有位点特异性切割性质的大范围核酸酶。

ZFN和TALEN—工程核酸酶的两个不同类别锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，已被证实在产生定向双链断裂时是有效的(Christian et al.,2010；Kim et al., 1996；Li et al., 2011；Mahfouz et al., 2011；Miller et al.,2010)。

基本上，ZFN和TALEN限制性内切核酸酶技术利用与特异性DNA结合结构域(分别为一系列锌指结构域或TALE重复序列)连接的非特异性DNA切割酶。通常，选择其DNA识别位点和切割位点彼此间隔开的限制性内切酶。切割部分被分开，然后与DNA结合结构域连接，从而得到对所需序列有极高特异性的内切核酸酶。具有这种性质的示例性的限制性内切酶是Fokl。此外Fokl具有需要二聚化以具有核酸酶活性的优势，这就意味着特异性大幅提高，因为每个核酸酶配偶体识别独特的DNA序列。为了增强这种效果，Fokl核酸酶已经工程改造，使得仅作为异二聚体起作用且催化活性增加。异二聚体功能化核酸酶避免不需要的同二聚体活性的可能性，因此增加双链断裂的特异性。

因此，例如为了靶向特定位点，构建ZFN和TALEN作为核酸酶对，该对的每个成员被设计成在靶定位点结合相邻序列。在细胞中瞬时表达时，核酸酶与其靶位点结合，且FokI结构域异二聚化以产生双链断裂。这些双链断裂通过非同源末端连接(NHEJ)途径的修复最通常导致小的缺失或小的序列插入。由于通过NHEJ进行的各个修复是独特的，因此使用单个核酸酶对可在靶位点产生具有多种不同缺失的等位系列。缺失的范围通常为约几个碱基对到几百个碱基对的任何长度，但通过同时使用两对核酸酶，已成功地在细胞培养中产生较大的缺失(Carlson et al., 2012；Lee et al., 2010)。另外，当联合核酸酶对引入与靶定区具有同源性的DNA片段时，通过同源指导修复，可修复双链断裂以产生特异性修饰(Li et al., 2011；Miller et al., 2010；Urnov et al., 2005)。

虽然ZFN和TALEN两者的核酸酶部分具有相似的性质，但是这些工程核酸酶间的差异在于其DNA识别肽。ZFN依赖Cys2-His2锌指，而TALEN依赖TALE。这两个DNA识别肽结构域具有它们天然组合存在于其蛋白质中的性质。Cys2-His2锌指通常存在于相隔3 bp的重复序列中，并以不同的组合存在于多种核酸相互作用蛋白质中。另一方面TALE存在于氨基酸和所识别的核苷酸对之间识别率为1:1的重复序列中。因为锌指和TALE两者恰好呈重复的形式，所以不同的组合会试图产生多种多样的序列特异性。用于产生位点特异性锌指内切核酸酶的方法包括例如模块式装配(modular assembly) (其中与三联体序列相关的锌指成行连接以覆盖所需序列)、OPEN (肽结构域的低严格性选择相对于三联体核苷酸接着肽组合的高严格性选择相对于细菌系统中的最终靶标)和锌指文库的细菌单杂交筛选等。ZFN也可经设计和商购获自例如Sangamo Biosciences™ (Richmond，CA)。

用于设计和获得TALEN的方法描述于例如Reyon et al. Nature Biotechnology2012 May;30(5):460-5；Miller et al. Nat Biotechnol. (2011) 29: 143-148；Cermaket al. Nucleic Acids Research (2011) 39 (12): e82和Zhang et al. NatureBiotechnology (2011) 29 (2): 149-53。Mayo Clinic引进了名为Mojo Hand的最新开发的基于web的程序，用于设计基因组编辑应用的TAL和TALEN构建体(可通过www(dot)talendesign(dot)org访问)。TALEN还可经设计和商购获自例如Sangamo Biosciences™(Richmond，CA)。

能够下调AGL6的另一种试剂是RNA引导内切核酸酶技术，例如CRISPR系统(其在随后的实施例部分更详细例示)。

本文所用术语“CRISPR系统”亦称为成簇规律间隔短回文重复(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，总的来说是指参与CRISPR相关基因的表达或指导其活性的转录物和其它元件，包括编码Cas9基因(例如CRISPR相关内切核酸酶9)的序列、tracr (反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-配偶序列(包括“同向重复(direct repeat)”和tracrRNA加工的部分同向重复)或指导序列(亦称为“间隔区”)包括但不限于crRNA序列(即赋予靶标特异性然而需要tracrRNA与Cas结合的内源细菌RNA)或sgRNA序列(即单指导RNA)。

在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于I型、II型或III型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件(例如Cas)来源于包含内源CRISPR系统的特定生物，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)。

一般来说，CRISPR系统的特征在于在靶序列(在内源CRISPR系统的情况下亦称为前间区)位点上促进CRISPR复合体形成的元件。

在CRISPR复合体形成的情况下，“靶序列”，在这种情况下为AGL6，是指指导序列(即指导RNA，例如sgRNA或crRNA)被设计成与之具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列间的杂交促进CRISPR复合体的形成。完全互补性不一定是必需的，条件是有足够的互补性引起杂交和促进CRISPR复合体形成。因此，按照一些实施方案，与靶序列的整体同源性可为50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。靶序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的核或胞质中。

因此，CRISPR系统包含两种不同的组分，与靶序列杂交的指导RNA (gRNA)和核酸酶(例如II型Cas9蛋白)，其中gRNA靶向靶序列，核酸酶(例如Cas9蛋白)切割靶序列。指导RNA可包含内源细菌crRNA和tracrRNA的组合，即gRNA使crRNA的靶向特异性与tracrRNA的支架性质(Cas9结合所需要的)联合。或者，指导RNA可以是能够直接结合Cas的单指导RNA。

通常，在内源CRISPR系统的情况下，CRISPR复合体(包含与靶序列杂交并与一个或多个Cas蛋白形成复合物的指导序列)的形成导致靶序列中或附近(例如距靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对以内)的一条或两条链的切割。虽不希望受理论束缚，但tracr序列(其可包含野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约或超过约20、26、32、45、48、54、63、67、85个或更多个核苷酸)或由其组成)，例如还可通过沿tracr序列的至少一部分与指导序列有效连接的tracr配偶序列的全部或部分杂交，形成CRISPR复合体的部分。

在一些实施方案中，tracr序列与tracr配偶序列具有足够的互补性以杂交并参与CRISPR复合体形成。如同靶序列一样，不需要完全互补性，只要其足以是功能性的。在一些实施方案中，在最佳比对时，tracr序列沿tracr配偶序列的长度具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的序列互补性。

将CRISPR/Cas导入细胞可使用驱动CRISPR系统的一个或多个元件表达的一个或多个载体实现，使得CRISPR系统元件的表达在一个或多个靶位点指导CRISPR复合体的形成。例如，Cas酶、与tracr-配偶序列连接的指导序列和tracr序列各自可在分开的载体上与分开的调节元件有效连接。或者，自相同或不同调节元件表达的两个或更多个元件可在单个载体与一个或多个其它载体(提供不包括在第一载体中的CRISPR系统的任何组分)组合。在单个载体中组合的CRISPR系统元件可以任何合适的方向排列，例如一个元件位于相对于第二元件的5' (“上游”)或3' (“下游”)。一个元件的编码序列可位于第二元件的编码序列的相同或相对链上并以相同或相反方向取向。单个启动子可驱动编码CRISPR酶的转录物和嵌入一个或多个内含子序列(例如不同内含子的每一个、至少一个内含子中的两个或更多个或单个内含子中的全部)的指导序列、tracr配偶序列(任选与指导序列有效连接)和tracr序列的一个或多个的表达。

“击中逃离(Hit and run)”或“入-出(in-out)”—包括两步重组程序。第一步中，使用含有阳性/阴性双重选择标记盒的插入型载体引入所需序列变化。插入载体含有与靶定基因座同源的单个连续区并经修饰以携带目标突变。将这种靶向构建体用限制性内切酶在同源区内的一个位点线性化，转化至细胞中，进行阳性选择以分离同源重组体。这些同源重组体含有间插载体序列(包括选择盒)分隔开的局部重复。在第二步中，对靶定克隆进行阴性选择以鉴定通过重复序列间的染色体内重组失去选择盒的细胞。局部重组事件除去重复，并根据重组位点，等位基因保留引入的突变或恢复到野生型。最终结果是引入所需修饰而不保留任何外源序列。

“双重置换”或“标签和交换”策略—包括与击中逃离方法类似，但需要使用两种不同的靶向构建体的两步选择程序。第一步中，使用具有3′和5′同源臂的标准靶向载体在其中将引入突变的位置附近插入阳性/阴性双重选择盒。在转化和阳性选择后，鉴定同源靶定克隆。接下来，将含有与所需突变同源的区域的第二靶向载体转化至靶定克隆，应用阴性选择除去选择盒并引入突变。最终的等位基因含有所需突变同时排除不需要的外源序列。

位点特异性重组酶—来源于P1噬菌体的Cre重组酶和来源于酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Flp重组酶是位点特异性DNA重组酶，各自识别独特的34碱基对DNA序列(分别称为“Lox”和“FRT”)，且被Lox位点或FRT位点侧接的序列在Cre或Flp重组酶表达时，可通过位点特异性重组分别容易地除去。例如，Lox序列由两侧是13个碱基对反向重复序列的不对称的8个碱基对间隔区组成。通过与13个碱基对反向重复序列结合并催化链切割和间隔区内的再连接，Cre使34碱基对lox DNA序列重组。间隔区中由Cre产生的交错DNA切口被6个碱基对分隔开，得到起同源传感器作用的重叠区以确保仅具有相同重叠区的重组位点进行重组。

基本上，位点特异性重组酶系统提供在同源重组之后除去选择盒的手段。该系统还允许产生可以时间或组织特异性方式失活或激活的条件改变的等位基因。值得注意的是，Cre和Flp重组酶留下34个碱基对的Lox或FRT “痕(scar)”。保留的Lox或FRT位点通常留在修饰基因座的内含子或3′ UTR中，现有的证据表明这些位点通常不显著干扰基因功能。

因此，Cre/Lox和Flp/FRT重组包括引入带有含有目标突变、两个Lox或FRT序列和通常置于两个Lox或FRT序列之间的选择盒的3′和5′同源臂的靶向载体。应用阳性选择，鉴定含有靶定突变的同源重组体。Cre或Flp的瞬时表达结合阴性选择导致选择盒切离，并选出其中失去盒的细胞。最终的靶定等位基因含有外源序列的Lox或FRT痕。

在AGL6转录物(RNA)水平上的沉默可采用下列示例性平台实现。

本文所用短语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组调节机制[例如RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压抑、共抑制和翻译阻遏]，其导致相应蛋白质编码基因表达的抑制或“沉默”。在许多类型的生物中，包括植物、动物和真菌，观察到RNA沉默。

本文所用术语“RNA沉默剂”是指能够特异性抑制或“沉默”靶基因(AGL6)的表达的RNA。在某些实施方案中，RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制防止mRNA分子的完整加工(例如完全翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包含配对链的RNA双链体以及这类小的非编码RNA可从中产生的前体RNA。示例性RNA沉默剂包括dsRNA，例如siRNA、miRNA和shRNA。

在一个实施方案中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。

在另一个实施方案中，RNA沉默剂能够介导翻译阻遏。

按照本发明的一个实施方案，RNA沉默剂对靶RNA是特异性的，不交叉抑制或沉默显示与靶基因有99%或更低的整体同源性，例如与靶基因有小于98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%整体同源性的其它靶标或剪接变体；如通过PCR、蛋白质印迹、免疫组织化学和/或流式细胞术测定的。

RNA干扰是指动物中由短干扰RNA (siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。

下面是可按照本发明的具体实施方案使用的RNA沉默剂的详细描述。

DsRNA、siRNA和shRNA—细胞中长dsRNA的存在刺激称为切酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性。切酶参与dsRNA加工成dsRNA的短片段，称为短干扰RNA (siRNA)。来源于切酶活性的短干扰RNA通常长约21-约23个核苷酸，并包含约19个碱基对双链体。RNAi反应的特征还在于内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，其介导切割具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域中部。

因此，本发明的一些实施方案预期使用dsRNA以下调蛋白质自mRNA表达。

按照一个实施方案，使用长于30 bp的dsRNA。不同的研究表明长dsRNA可用于沉默基因表达而不诱导应激反应或引起重大脱靶作用—参见例如[Strat et al., NucleicAcids Research, 2006, Vol. 34, No. 13 3803-3810；Bhargava A et al. Brain Res.Protoc. 2004;13:115-125；Diallo M., et al., Oligonucleotides. 2003;13:381-392；Paddison P.J., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002;99:1443-1448；Tran N.,et al., FEBS Lett. 2004;573:127-134]。

按照本发明的一些实施方案，在其中干扰素途径不被激活的细胞中提供dsRNA，参见例如Billy et al., PNAS 2001, Vol 98, pages 14428-14433和Diallo et al,Oligonucleotides, October 1, 2003, 13(5): 381-392. doi:10.1089/154545703322617069。

按照本发明的一个实施方案，特别设计了不诱导下调基因表达的干扰素和PKR途径的长dsRNA。例如，Shinagwa和Ishii [Genes & Dev. 17 (11): 1340-1345, 2003]开发了一种载体(名为pDECAP)以从RNA聚合酶II (Pol II)启动子表达长双链RNA。因为来自pDECAP的转录物缺乏有利于ds-RNA输出至胞质的5'-帽结构和3'-poly(A)尾两者，因此来自pDECAP的长ds-RNA不干扰干扰素反应。

哺乳动物系统中逃避干扰素和PKR途径的另一种方法是经由通过转染或内源表达引入小抑制RNA (siRNA)。

术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小抑制RNA双链体(一般介于18-30个碱基对之间)。通常，siRNA被化学合成为21聚体，具有中心19 bp双链体区和在末端的对称的2-碱基3'-突出端，但最近描述了与相同位置的21聚体相比，25-30碱基长度的化学合成RNA双链体效能可增加高达100倍。提出了所观察到的采用较长RNA引发RNAi而获得的效能提高产生于为切酶提供底物(27聚体)而不是产物(21聚体)，且这提高siRNA双链体进入RISC的速率或效率。

已经发现，3'-突出端的位置影响siRNA的效能，且在反义链上具有3'-突出端的不对称双链体一般比在有义链上具有3'-突出端的那些更有效(Rose et al., 2005)。这可归因于加载至RISC的不对称链，因为当靶向反义转录物时观察到相反的功效模式。

双链干扰RNA (例如siRNA)的链可连接形成发夹或茎-环结构(例如shRNA)。因此，如所述，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂也可以是短发夹RNA (shRNA)。

本文所用术语“shRNA”是指RNA试剂，其具有茎-环结构，包含互补序列的第一和第二区，所述区的互补性程度和取向足够使得碱基配对发生在所述区之间，第一和第二区通过环区连接，该环产生于在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)间缺乏碱基配对。环中核苷酸的数目是介于和包括3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-11的数目。环中的一些核苷酸可参与与环中其它核苷酸的碱基对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-CAAGAGA-3'和5’-UUACAA-3’ (国际专利申请号WO2013126963和WO2014107763)。本领域技术人员应认识到，所得的单链寡核苷酸形成包含能够与RNAi机器相互作用的双链区的茎-环或发夹结构。

适于与本发明的一些实施方案使用的RNA沉默剂的合成可如下实现。首先，扫描AA二核苷酸序列的AUG起始密码子下游的AGL6 mRNA序列。每个AA和3’邻接的19个核苷酸的出现记录为可能的siRNA靶位点。优选，siRNA靶位点选自可读框，因为非翻译区(UTR)较富含调节性蛋白质结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]。但应认识到，针对非翻译区的siRNA也可以是有效的，正如对于GAPDH其中针对5’ UTR的siRNA介导细胞GAPDH mRNA约90%降低和蛋白质水平完全消失所表明的(www(dot)ambion(dot)com/techlib/tn/91/912(dot)html)。

第二，应用任何序列比对软件，例如可获自NCBI服务器的BLAST软件(www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov/BLAST/)，将可能的靶位点与合适的基因组数据库(例如人、小鼠、大鼠等)进行比较。筛选出显示与其它编码序列有显著同源性的推定的靶位点。

选择合格的靶序列作为模板用于siRNA合成。优选的序列是包括低G/C含量的那些，因为与具有高于55%的G/C含量的那些相比，这些被证实在介导基因沉默中更有效。沿靶基因的长度优选选择数个靶位点用于评价。为了更好的评价所选的siRNA，优选联合使用阴性对照。阴性对照siRNA优选包括与siRNA相同的核苷酸组成但缺乏与基因组的显著同源性。因此，优选使用siRNA的杂混核苷酸序列，只要它不显示与任何其它基因有任何显著同源性。

可用于本发明的方法的构建体可采用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术构建。可将编码序列构建体插入载体中，载体可为市购获得的，适于转化至植物并适于在转化细胞中表达目标基因。遗传构建体可以是表达载体，其中核酸序列与允许在植物细胞中表达的一个或多个调节序列有效连接。

植物细胞可用本发明的核酸构建体稳定或瞬时转化。在稳定转化中，本发明的核酸分子整合至植物基因组，因此它代表了稳定的遗传性状。在瞬时转化中，核酸分子通过经转化细胞表达，但它未整合至基因组，因此它代表了瞬时性状。

有各种将外源基因引入单子叶植物和双子叶植物两者中的方法(Potrykus, I.,Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225；Shimamoto etal., Nature (1989) 338:274-276)。

引起外源DNA稳定整合至植物基因组DNA的主要方法包括以下两种主要方法：

(i) 土壤杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移：Klee et al. (1987) Annu. Rev.Plant Physiol. 38:467-486；Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds.Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)p. 2-25；Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J.,Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112。

(ii) 直接DNA摄取：Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds.Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)p. 52-68；包括直接摄取DNA进入原生质体的方法，Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. DNA uptake induced by brief electric shock of plantcells: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature(1986) 319:791-793。通过粒子轰击将DNA注射至植物细胞或组织中，Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563；McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926；Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209；通过使用微量移液管系统：Neuhaus etal., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36；Neuhaus and Spangenberg, Physiol.Plant. (1990) 79:213-217；

细胞培养物、胚或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化，美国专利号5,464,765或通过DNA与萌发的花粉直接孵育，DeWet et al. in Experimental Manipulation of OvuleTissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman,London, (1985) p. 197-209；以及Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719。

土壤杆菌系统包括使用含有整合至植物基因组DNA的确定DNA区段的质粒载体。植物组织接种的方法随植物种和土壤杆菌递送系统而变化。广泛使用的方法是叶盘法，该方法可采用提供引发整株植物分化的良好来源的任何组织外植体进行。Horsch et al. inPlant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht(1988) p. 1-9。补充方法采用与真空渗入结合的土壤杆菌递送系统。土壤杆菌系统在产生转基因双子叶植物中尤其是切实可行的。

有各种将直接DNA转移至植物细胞的方法。在电穿孔中，将原生质体短暂暴露于强电场中。在显微注射中，使用非常小的微量移液管将DNA机械地直接注入细胞中。在微粒子轰击中，DNA被吸附在微弹(microprojectile)(例如硫酸镁晶体或钨粒)上，微弹被物理加速进入细胞或植物组织中。

在稳定转化后，进行植物繁殖。最见的植物繁殖方法是通过种子。然而，通过种子繁殖的再生因杂合性所致在作物中没有一致性而有缺陷，因为种子通过植物按照孟德尔定律规定的遗传方差产生。基本上，每个种子在遗传上是不同的，各自将以其自身的特定性状生长。因此，优选如此产生转化植物，使得再生植物具有亲本转基因植物的相同性状和性质。因此，优选转化植物通过微体繁殖(micropropagation)再生，所述微体繁殖提供转化植物的快速一致的繁殖。

然而还预期其它生产方法，包括有性繁殖(和不论从形态上的还是使用本文所述分子标志物选择表型)、组织培养等。

微体繁殖是从所选的亲本植物或栽培种上切割的单块组织生长出新一代植物的过程。该过程允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物的大量繁殖。新产生的植物在遗传上与原始植物相同并具有原始植物的全部性质。微体繁殖允许在短时间内大量产生优质植物材料，并提供在保持原始转基因或转化植物的性质的情况下所选栽培种的快速繁殖。克隆植物的优势是植物繁殖的速度和所生产的植物的品质和一致性。

微体繁殖是一个在各阶段之间需要培养基或生长条件变化的多阶段过程。因此，微体繁殖过程包括4个基本阶段：第1阶段，初始组织培养；第2阶段，组织培养物繁殖；第3阶段，分化和植物形成；和第4阶段，温室培养和锻炼。在第1阶段，初始组织培养，建立组织培养物，并证实是无污染物的。在第2阶段，初始组织培养物经繁殖直到产生足量的组织样品以满足逐步的增加，使得它可在自然环境下生长。

已显示可用于转化植物宿主的病毒包括CaMV、TMV、TRV和BV。使用植物病毒转化植物描述于美国专利号4,855,237 (BGV)、EP-A 67,553 (TMV)、日本公布的申请号63-14693(TMV)、EPA 194,809 (BV)、EPA 278,667 (BV)和Gluzman, Y. et al., Communicationsin Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,pp. 172-189 (1988)。用于在许多宿主(包括植物)中表达外源DNA的假病毒颗粒描述于WO87/06261。

不论用于产生本发明的一些实施方案的茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)的方法如何，一旦植物或任何繁殖材料在手，就针对兼性单性结实性状进行选择。

因此，按照本发明的一个方面，提供选择兼性单性结实的茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)的方法，所述方法包括在茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)的基因组中检测AGL6基因中的功能缺失突变，其中突变的存在指示茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)为兼性单性结实的。

本领域已知用于分析突变的许多方法，包括例如单碱基延伸(SBE)、等位基因特异性引物延伸测序(ASPE)、DNA测序、RNA测序、基于微阵列的分析、通用PCR、熔解曲线SNP方法、等位基因特异性延伸、杂交、质谱法、连接、延伸-连接、Flap内切核酸酶介导测定法、限制性片段长度多态性(RFLP)、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)和随机扩增多态性DNA (RAPD)。

因此，本发明考虑可用于区分突变的和非突变的形式的AGL6的寡核苷酸(例如引物)。

因此，一旦携带功能缺失的遗传变化的植物被鉴定，认为其是兼性单性结实的。该植物材料在开发具有农业上的期需性状的茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)变种中可用作的育种材料。

根据一个实施方案，本发明的植物为杂种变种—即，在杂交(即交配)两株非等基因植物之后产生，所述两株植物均为功能缺失的AGL6基因突变纯合的。杂种可为F₁杂种。

本文所用“F₁杂种”是指使两株非等基因植物杂交的第一代子代。

本发明的茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)杂种的开发需要开发稳定的亲本系。在育种程序中，将来自两个或更多个种质来源或基因库的所需性状组合以开发出优良的育种变种。通过连续自花受粉和/或回交和选择最佳育种系，开发所需的近交或亲本系，有时利用分子标志物加速选择过程。

一旦鉴定出产生最优杂交性能的亲本系，例如均携带上述例如在AGL6基因中的功能缺失突变，便可无限地产生杂交种子，只要保持亲本的纯合性。按照一个实施方案，本发明的茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)是稳定的亲本植物品系(携带例如呈杂合形式或纯合形式的AGL6基因中的功能缺失突变)。

本文所述短语“稳定的亲本系”是指开放授粉的近交系，在自花受粉和种植的周期中对所需植物是稳定的。按照一个具体的实施方案，在本发明的亲本系中，95%的基因组呈纯合形式。

植物育种中的常规实践是采用回交方法以通过单一性状转变生成新的变种。

本文所用短语“单一性状转变”是指将新的单个基因掺入亲本系中，其中除转移的单个基因以外，基本上亲本系所有所需的形态和生理性质得以恢复。

本文所用术语“回交”是指杂交子代重复杂交回到亲本茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)之一。为所需性质贡献基因的亲本茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)称为非轮回或供体亲本。该术语是指在回交方案中非轮回亲本被使用一次并因此不再轮回的事实。基因从非轮回亲本向其转移的亲本茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)称为轮回亲本，因为它在回交方案中被使用几轮。

在典型的回交方案中，使来自原始目标变种(轮回亲本)的植物与选自携带待转移的目标单一基因的第二变种(非轮回亲本)的植物杂交。然后使来自这种杂交的所得子代再次与轮回亲本杂交，重复此过程直到获得这样的茄科植物(即，茄子、番茄和辣椒，例如番茄)，其中转化植物中除了来自非轮回亲本单个转移基因以外，基本上轮回亲本的所有所需形态和生理性质恢复。

因此，近等基因系(NIL)可通过多次回交产生以得到在遗传组成上几乎相同的一系列个体，不同的是研究中的性状或基因组区，在此情况下为例如AGL6基因中的功能缺失遗传变化。

回交方法可与本发明一起使用以改进特征或将其引入亲本系。上文所述标记辅助育种(选择)可用于该方法中。

根据具体的实施方案，所述植物或植物种子为自交系。

根据具体的实施方案，植物为杂种植物或种子为杂种种子。

本发明还涉及本发明的番茄、茄子和辣椒植物的子代。这种子代可通过本发明的植物或其子代植物的有性或营养生殖而产生。再生的子代植物以与兼性单性结实亲本相同或相似的方式不依赖受精而生长果实。另外，可以修饰子代植物的一个或多个其它特征。这种额外的修饰例如通过诱变或通过用转基因转化实现。

如本文所使用的单词“子代”意指来自与显示不依赖受精的果实形成的本发明的植物杂交的后代或第一个和所有其它后代。本发明的子代为与携带导致不依赖受精的果实形成的突变(纯合形式)性状的本发明植物的任何杂交的后代。

“子代”还包括通过营养繁殖或生殖从本发明其它植物获得的携带本发明的性状的植物。

如所提及的，本文所描述的实施方案此外涉及杂种种子以及涉及产生杂种种子的方法，包括使第一亲本植物与第二亲本植物杂交和收获所得的杂种种子。在这种情况下性状为隐性的，因此两株亲本植物需要对于不依赖受精的果实形成性状为纯合的，以便所有杂种种子携带本发明的性状。对于其它性状，它们不需要必然一致。

本文所描述的实施方案还涉及植物种质。种质由有机体的所有遗传特征构成，根据本发明包括至少本发明的兼性受精不依赖的果实形成性状。

本文所描述的实施方案还涉及显示兼性受精不依赖的果实形成性状的植物的细胞。这种植物的每一细胞携带导致兼性单性结实的遗传信息(即，AGL6中功能缺失突变)。细胞可为个体细胞或为植物或植物部分例如果实的一部分。

本教导进一步涉及包含导致兼性单性结实的基因组(DNA)信息(即，AGL6中功能缺失突变)的消耗产品。

任何本文所描述的植物的果实可在成熟或收获后对于果实颜色、白利糖度、pH、糖、有机酸和缺陷水平(虫害、霉菌等)选择或定性。例如，番茄通常运输至大加工设施，在此将其收集并且在此可接着洗涤(通常使用氯水)和使用自来水漂洗，并进一步选择以去除呈现缺陷(例如不充分成熟、疾病损伤、霉菌等)的那些。番茄可储存(特别是如上所述显示改善的贮存期的那些)或直接送至消费者(新鲜市场番茄)。加工番茄可被加工成多种多样的产品。

对于果汁或果肉生产，番茄可经受烘箱脱水，并且捣碎和浸渍(分解和破碎)以获得可泵送的块。如技术人员将清楚的，这些操作本身在番茄加工领域为已知和常见的，在这方面可对方法进行任何调整而不脱离范围。

用于加工番茄和/或生产基于番茄的组合物的方法为本领域所熟知，一般参见美国专利号6,924,420。还报道用于制备，例如，糊(美国专利号7,074,451)、无菌糊(美国专利号4,206,239)、果泥(美国专利号4,556,576)、果酱(美国专利号7,122,217)、固化果酱(美国专利号4,038,424)、烤肉酱(美国专利号6,869,634)、萨尔萨辣酱(美国专利号5,914,146)、番茄酱 (美国专利号6,689,279)、番茄纤维组合物(美国专利号7,166,315)和脱水番茄产品(美国专利号5,035,909)的特定方法。也已经报道改进番茄糊、果肉和果泥的质感和稠度的方法，参见例如美国专利号6,720,019。

还提供可食用的加工番茄产品，其包含番茄或其可食用部分(例如，果实或其可食用部分)。

还提供根据本教导产生的番茄糊。

这种可食用产品的实例包括，但不限于罐装番茄(整个)、番茄糊、番茄酱、番茄沙司、番茄汤、脱水番茄、番茄汁、番茄粉、番茄切块、压碎的番茄、切碎的番茄和番茄浓缩物。

可受益于无籽的辣椒产品包括：用于新鲜消费的变种，以及用于加工和保存辣椒的变种。用于香料(红辣椒)生产而生长的品种由Capsicum annuum L.、甜红椒的干燥的碾磨壳(pod)组成。甜红辣椒香料加工包括去除种子，然后碾磨果皮，否则会降低质量。其它产品从红辣椒油树脂制成，其为来自Capsicum annuum果实的油可溶的提取物，主要在食品中用作着色和/或调味料。其还用于染色化妆品，包括沐浴和美容产品和补水唇膏。

消费者对无籽茄子有巨大需求，因为籽增加苦味，并且与果肉褐变有关。茄子通常在烹饪、烘焙、油煎或焙烧之后消耗。其还腌制或干燥消耗，干燥的小茄子皮用作填料。其还作为加工产品如冷冻的主菜和特制蘸料(dip)消耗。

根据一些实施方案，产品包含番茄、辣椒或茄子(例如，糊、干果、果汁等)的DNA(在AGL6基因中携带功能缺失突变，导致兼性单性结实表型)。

术语“包含”、“含有”、“包括”、“含”、“具有”及其变化形式意指“包括但不限于”。

术语“由……组成”意指“包括并限于”。

术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可以包括其它成分、步骤和/或部分，但只有当所述其它成分、步骤和/或部分不实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基础的和新的特征时。

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非文中另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以范围形式呈现。应理解，范围形式的描述仅仅是为方便和简洁起见，不应视解释为是对本发明范围的不可变更的限制。因此，范围的描述应当被视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内各个数值。例如，从1到6的范围的描述应当被视为具体公开了子范围例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等以及该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。这不论范围宽度如何均适用。

无论何时本文标明数值范围时，意味着包括该指定范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语第一标示数字和第二标示数字“之间的范围”以及“从”第一标示数字“到”第二标示数字“的范围”在本文可互换使用，意味着包括第一和第二标示数字及其之间的所有分数和整数。

本文所用术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和步骤，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或易于从已知的方式、手段、技术和步骤发展出的那些方式、手段、技术和步骤。

当引用特定序列表时，要了解所述引用还包括基本上相当于其互补序列的序列，如包括产生于例如测序错误、克隆错误的少数序列变异或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其它改变，条件是这种变异的频率为50个核苷酸中少于1个，或者100个核苷酸中少于1个，或者200个核苷酸中少于1个，或者500个核苷酸中少于1个，或者1000个核苷酸中少于1个，或者中5,000个核苷酸少于1个，或者10,000个核苷酸中少于1个。

要认识到，为了清楚起见，在各个实施方案的情况下描述的本发明的某些特征，也可以组合在单个实施方案中提供。反之，为了简洁起见在单个实施方案的情况下描述的本发明的不同特征，也可以单独地或以任何适合的亚组合、或适当时在本发明的任何其它描述的实施方案中提供。在不同实施方案的情况下描述的某些特征不得视为是那些实施方案的必要特征，除非所述实施方案没有那些要素不起作用。

上文描述的以及随附权利要求书部分中要求保护的本发明的不同实施方案和方面可以在以下实施例中找到实验支持。

实施例

一般地，本文所使用的命名和本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这种技术在文献中全面解释。参见，例如，"Molecular Cloning: Alaboratory Manual (分子克隆：实验室手册)" Sambrook等人, (1989); "CurrentProtocols in Molecular Biology (分子生物学通用方案)" 卷I-III Ausubel, R. M.,ed. (1994); Ausubel等人, "Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学通用方案)", John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "APractical Guide to Molecular Cloning (分子克隆实践指南)", John Wiley & Sons,New York (1988); Watson等人, "Recombinant DNA (重组DNA)", Scientific AmericanBooks, New York; Birren等人(eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series(基因组分析：实验室手册系列)", 卷1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork (1998); 美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中阐述的方法学; "Cell Biology: A Laboratory Handbook (细胞生物学：实验室手册)", 卷I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology (免疫学通用方案)" 卷I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites等人(eds), "Basic andClinical Immunology (基础和临床免疫学)" (第8版), Appleton & Lange, Norwalk,CT (1994); Mishell和Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology(选取的细胞免疫学方法)", W. H. Freeman和Co., New York (1980); 可用的免疫测定在专利和科学文献中广泛描述，参见，例如，美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521; "OligonucleotideSynthesis (寡核苷酸合成)" Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic AcidHybridization (核酸杂交)" Hames, B. D., 和Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation (转录和翻译)" Hames, B. D., 和Higgins S. J.,Eds. (1984); "Animal Cell Culture (动物细胞培养)" Freshney, R. I., ed.(1986); "Immobilized Cells and Enzymes (固定化细胞和酶)" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning (分子克隆实践指南)" Perbal, B., (1984)和"Methods in Enzymology (酶学方法)" 卷1-317, Academic Press; "PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications (PCR方案：方法和应用指南)", AcademicPress, San Diego, CA (1990); Marshak等人, "Strategies for ProteinPurification and Characterization - A Laboratory Course Manual (蛋白质纯化和表征策略—实验室课程手册)" CSHL Press (1996); 其所有通过引用结合，如同在本文中全部阐述。其它一般参考文献贯穿本文件提供。其中的程序认为是本领域所熟知，为了方便读者提供。其中包含的所有信息通过参考结合到本文中。

材料和方法

对于在极端温度下的产量筛选EMS诱导的M₂群体：约1000 M₂ EMS诱变的家族各自在露地由12株植物代表，分为两个重复，每一重复由6株植物组成，种植在单独的区块。亲本系M82用作对照，相似地由6株植物重复代表，对于露地种植的22个双排的每一排至少一株。幼苗在晚夏(2009年7月7日)种植在露地，从8月12日开始，在8-9月非常热的月份期间，重复筛查露地的结实和果实发育。发现来自几个家族的单一植物结出单性果实，但除了选择的突变2012和产生大的单性果实但其远端(花柱)有些形状扭曲的另一个之外，所有其它结出相对小(小于35 g)的无籽果实，推测代表仅部分补偿种子对果实发育至其全部潜能的贡献的突变。

产生用于2012突变体绘图和分析的群体：

2012 BC₁F₂群体：BC₁通过用从2012植物收集的花粉授粉M82去雄的花产生，将这些生长并允许自交以产生BC₁F₂。

测交(TC)群体：将几个显示WT表型，即非单性结实的2012 BC₁F₂植物去雄，用从单性结实的同胞收集的花粉授粉。将来自三种这些杂交的每一种的大约100个子代在2013年夏季(17.6.2013)种植。一个F₁群体鉴定为TC群体，因为当在网棚中在晚夏期间盛行的高温下生产时其显示明显的单性结实表型1:1分离。该群体用于表2中概述的分析。

2012 BC₂F₂群体：将来自BC₁F₂群体的显示明显的单性结实表型的植株之一用于授粉亲本系M82，使F₁植物生长并自交以产生BC₂F₂。

从2012 x Marmande杂交衍生的F₂群体：单性结实的2012 BC₁F₂植物的花粉用于授粉中-大、多腔果实、开放变种Marmande (www(dot)rareseeds(dot)com/marmande-tomato/)的去雄的花。从自交的F₁ 植物收集F₂种子。

在几乎环境条件下生长的2012 BC₂F₂植物的生长和表型分型：在冬天结束时(26.2.2014)，将498株BC₂F₂植物与来自亲本系M82的植物一起种植在不加热的网棚中。在2014年5月开始时，一些BC₂F₂植物已经结出红色甚至完熟的果实。因此第一轮表型分型在2014年5月13-15日进行。所有在该时间不能明确表型分型的植物之后重新取样几次以证实其是否为单性结实。由于发现2012突变导致强但兼性的单性结实，设置严格的方案用于子代表型分型，尤其是在其在几乎环境温度下生长和结实时。从每一植物挑选6-8个最成熟的果实。如果没有，如在对照和多数BC₂F₂植物中，挑选6个最大的绿色果实。将这些拍照、横切并记录种子的存在或不存在情况。将结出大的通常红色的无籽果实的植物定义为单性结实，即使一些其它的挑选的果实包含少量籽。基于结籽和果实尺寸将植物定义为非单性结实。

第一次筛查时不能明确表型分型的所有植物在以后的日期重新评估至少两次。确实结出明显的单性果实的植物定义为单性结实，即使其还结出好的有籽果实，如果果实发育延迟，并且最重要地，仅结有籽果实，那么植物定义为非单性结实，即使其一些果实中每一个的籽数目少。

对于生产参数包括生产潜能的分析(图5A-C中呈现)，允许植物再生长一个月。在2014年6月10-11日，从每一SlAGL6 (SNP No. 3)基因型的10-13株植物的每一株收获所有的成熟绿色、破色期(breaker)和红色果实。对于每一植物，测定所有收获的果实的数目和重量，以及红色果实的数目和重量。为了减少环境对产量的作用，不从位于排两端的植物收集果实。

2012 BC₂F₃家族的生长和表型分型：如果产生，从对于突变的SlAGL6纯合的2012BC₂F₂的每一株收集种子。将从三株这种植物衍生的不显示单性结实表型的子代(参见表3)在22.10.2014种植在不加热的网棚中，与定义为明显的单性结实的4株植物的子代并排。这些植物在非常严酷的2015年冬天生长。在26.3.2015收集果实和评估结籽。

2012衍生的子代的SNPs基因分型：基因分型作为服务由DYN R&D Ltd, SagiIndustrial park, Migdal-Haemek, Israel按照熔解曲线SNP (McSNP)方法(Ye等人,2002)进行。为了确认DYN R&D分析的可靠性，衍生自9株TC植物和亲本系M82的DNA用作模板，以PCR扩增6个SNPs每一个的两侧的序列(表1，第2列)。在所有检验的DNA样品中对于所有6个SNPs，相同的结果从PCR产物的传统测序和通过DYN R&D的平行基因分型得到。例行地，从在网棚中建立和编号的每一幼小植株取样4个叶块。每一植物经基因分型两次，即在4个取样的叶子中的两个上，并且分析作为“双盲”进行。在其中重复基因分型不一致的稀有情况下，两个其它的重复，并且如果需要，将来自有问题的植物的新样品基因分型以肯定地建立每一分析植物中的SNP基因型。

基因组DNA文库产生和测序：从衍生自2012 BC₁F₂群体(定义为“强单性结实”)的20株植物的每一株，挑选一片嫩叶(约150mg FW)并从20片叶子库提取DNA。相似地，DNA从在同一日期从23株“非单性结实”植物取样的23片叶子库提取。将DNA样品送至Technion, (TheLife Sciences and Engineering Infrastructure Center) Haifa, Israel，以制备两个测序文库，一个命名为“2012文库”，另一个命名为“NP (非单性结实)文库”。将文库在Illumina HiSeq 2000平台上使用100 bp成对的末端读数测序。使用Trimmomatic将分别包含15.4Gbp和15.9 GBp的原始序列数据过滤以去除接头和低质量序列(低于Q10) (Bolger等人2014)。将所得到的数据集使用BWA (Li和Durbin 2009)与M82序列(Bolger等人2014)比对。将比对过滤以去除含糊的、次级的或配对不一致的比对。其余高质量比对然后与SAMtools (Li等人2009)一起使用以产生单性结实和非单性结实库的“读数堆积”。定制的脚本用于解释堆积，并鉴定其中库实质上不同的基因组位置。然后将这些区域绘图并用于鉴定染色体1上从75.8Mbp到86.2Mbp的10.4 Mbp的区域，其最可能包含起因突变。有可能在该窗口内鉴定对于表型库唯一的19个高置信度的突变。将每一突变周围的序列提取并使用BLAST绘制到Heinz基因组。大多数突变为基因间的或在内含子中。在击中外显子的全部4个中，2个为同义变化，2个为具有轻微作用的非同义变化(缬氨酸到异亮氨酸)。另外，受影响的基因的功能注释未提示与所观察到的表型的明显联系。

为了改善分析，将来自两个文库的每一个的另一泳道测序。此外，为了确保已经公布的M82和当地M82系之间的背景差异不影响结果，还将亲本M82系测序。这些数据集分别包含39.6Gbp (2012文库)、38.1Gp (NP文库)和31.5Gbp (亲本M82系)数据。所有数据集使用Trimmomatic如前调整，并将2012和NP库与先前测序的数据组合。来自亲本系的读数使用BWA比对，将近30K高置信度变体使用SAMtools识别。将这些变体应用到公共可得的M82序列以产生亲本M82基因组序列。

新的和现有的单性结实和非单性结实数据集然后使用BWA与新测定的亲本M82基因组比对，并如前处理以确定库实质上不同的基因组位置。较大的数据集允许将因果窗口缩窄至染色体1上跨越76.67Mbp - 80.73Mp的区域，其对应于Heinz基因组上跨越84.9Mbp- 89.0Mbp的区域。在窗口内鉴定了9个高置信度突变，其为单性结实库所独特的。将这些如前绘制到Heinz基因组以确定对应的位置，如表1中所示。意外地，来自该分析的最强的候选突变，其在Solyc01g093960中导致早期终止密码子，在最初的数据集中不是清楚地可检测的，因为其在非表型库中以57% (14个读数中的8个)存在，远超预期的33%。

构建CRISPR/Cas9敲除质粒和番茄转化：

CRISPR/Cas9构建体设计为在212 bp Solyc01g093960编码序列之后 (预测的外显子2，70 aa之后，参见图2B)创建缺失。20 bp靶序列经选择随后为前间隔区邻近基序(PAM)、必需的Cas9结合位点、TGG (图2B中描绘)。选择的sgRNA使用引物SalI-gRNA-F:AGAgtcgacATAGCGATTGAGGATTAAGGCAACAACGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG, (SEQ ID NO:10)和HindIII-gRNA-R: TAAGCTaagcttCGATCTAAAAAAAGCACCGACT (SEQ ID NO: 11) (添加的限制位点以小写字母呈现，特异性的靶序列(cRNA)在SalI-gRNA-F引物序列中加下划线)扩增。将PCR产物限制性酶切并克隆入在合成的拟南芥属U6启动子控制下的PRCS双元载体SalI-HindIII位点(Waibel和Filipowicz, 1990)，连同植物密码子优化的Cas9形式(Li等人, 2013)。Cas9蛋白在组成型35S启动子下作为与蛋白质末端的核定位信号(NLS)的融合蛋白表达，用FLAG在其N端标记。将双元载体转化入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，其用于通过如前所描述的与从10天龄无菌幼苗切离的子叶共培养而转化不定型番茄系MP-1，对于每一转化的子叶选择不超过1个再生的苗(Barg等人1997)。

检测CRISPR/Cas9诱导的突变

Solyc01g093960 gRNA靶位点设计为包含AclI限制酶位点(AACGTT, SEQ ID NO: 12)，与PAM (参见，图2B预测的Cas9核酸酶切割位点)上游3 bp重叠，因此DNA双链断裂(DSB)修复可破坏限制位点。将R₀植物筛查携带突变的靶位点的嵌合部分的存在情况。为了增加检测Cas9产生的突变(在再生R₀植物的后期发育阶段发生)的概率，基因组DNA从主茎上比10-12号年幼的叶子提取。DNA使用特异性引物2012-F: 5'-GCCTTGAAATCAGTAAGAGTATTGG-3'(SEQ ID NO: 13)和2012-R: 5'-GTTCGTTGAAGTGCTTCAAACTTGG -3' (SEQ ID NO: 14)扩增，以得到sgRNA靶序列两侧的354 bp片段。除非突变，其用AclI消化，得到两个相似尺寸的带(170/184 bp，参见图2B)。消化的扩增子经受凝胶电泳。DNA从凝胶上未切割带的位置提取，即使当无清楚的带在UV光下可见时。提取的DNA在-20 ℃ O/N沉淀(0.3 mM乙酸钠pH=5.2,2.2 V乙醇和1 μg糖原)，重悬在10 μL水中，其中1 μL用作模板用于使用相同的引物对扩增。为了检验限制位点的丢失和产生的突变的性质，将扩增的条带用AclI限制性酶切并使用正向和反向引物二者测序。在发现包含突变的形式的多数R₀植物中，AclI抗性PCR带比限制性双带模糊得多，强烈提示突变的形式在R₀植物再生的后期产生，而不是在R₀植物再生的最初阶段。将相同的程序应用于R₁子代基因分型。

在子代中丢失或维持cas9/sgRNA盒使用引物对cas-F CGACAATCTGATCCAAGCTCA(SEQ ID NO: 15)和pRCS_val_rev: CGACAATCTGATCCAAGCTCA (SEQ ID NO: 16)经PCR检验。

分析sg1和MP-1在热应激下的产量

实验以4个重复进行，每一个重复由每个基因型的17-27株植物组成。将植物在2016年4月20日种植在网棚中，第一次收获在2016年6月26日进行(参见图13)。将每一重复的所有红色果实收获并称重。果实重量和每一植物的果实数目从每一重复6-8个批次的30个水果的重量计算。图13中呈现的数据对于每株植物计算，因为植物的数目在重复之间不同。对于每一重复，对从三个完熟果实的两个库榨出的果汁测量白利糖度(按照Carmi等人, 2003)。对于每一重复，对粉碎的6-8个完熟果实的两个库测量pH。

实施例1

鉴定2012系为从EMS诱变的M82群体衍生的新的单性结实单基因隐性突变体

筛查化学诱变的M₂群体在极端高温下的突变体产量，所述群体通过使种子吸取EMS溶液在M82品种(J Hirschenhoren和Y. Kapulnik, The Volcani Center, ARO产生的群体)中产生，如材料和方法中所描述的。家族编号2012包括两株植物，各自来自不同的重复(参见材料和方法)，其在这些条件下结出具有良好胶状物的好的单性果实，而亲本系植物至多结出一些极小的空心的“坚果”果实。

这两株植物之一的花粉用于授粉M82植物的去雄的花，这结出有籽果实。这些BC₁植物不是单性结实的。然而，40个BC₁F₂子代中的7个在2010年晚夏盛行的极端热的条件下结出无籽果实，而亲本系M82仅成功结出极小的“坚果”小果实(图1A-C vs. 1D-F)。因此，表明该性状为可遗传的，并且表现为单隐性突变。此外，来自同一BC₁F₂群体的植物还在冬天在非加热的玻璃室中生长，其玻璃窗保持恒定开放。在这些冷条件下，检验的30个BC₁F₂子代中的9个结出无籽果实，而其余同胞未结出正常果实，表明突变也在太低而不允许受精依赖的结实的温度下使得能够单性果实发育。

实施例2

2012突变的NGS辅助绘图

为了对突变绘图，选择批量分离方法(Michelmore等人1991)。深度测序在两个基因组文库上进行，一个来自2012 BC₁F₂单性结实同胞批次，另一个来自其非单性结实同胞。

2012单性结实的兼性性质连同与影响性状显示的其它EMS诱导的突变的似合理的相互作用可导致单性结实文库受到衍生自错误表型分型的非单性结实同胞的DNA污染。因此采取若干措施以尝试抵消该风险。首先，来自2012 BC₁F₂群体的105株植物在2011年晚夏在网棚中生长，因为通常从7月中旬到8月下旬温度足够高而严重损害小孢子发生，因此阻止受精依赖的果实发育。在2011年9月27日，将果实收获、检查，并将每一株植物表型分型。单性结实表型基于产生具有良好胶状物填充的好的单性果实确定(例如图1G)。除了结无籽果实(以及在一些植物中少籽果实)之外，将植物表型分型为“强单性结实”基于沿生长季节记录的另外的视觉参数，包括维持发育的果实周围的花瓣、开花后早熟的果实发育、每一株植物的果实数目、每一桁架的果实数目以及果实尺寸和性状。如果没有出现无籽正常尺寸的果实，则同胞植物表征为非单性结实(NP)(仅“坚果”，即小的不成形的无籽空心“胀大”果实，图1H)。在这些条件下，这两个BC₁F₂亚群体之间的果实重量和成熟阶段的差异非常显著(图1I)。

来自表征为“强单性结实”的20个BC₁F₂植物库的基因组文库命名为“2012文库”，而来自表征为“强非单性结实”的23个其同胞的另一个命名为“NP (非单性结实)文库”(如材料和方法中描述的)。将从两个测序文库的每一个衍生的过滤读数与M82基因组序列比对并分析2012文库中富含纯合突变的核苷酸同时仅包含约33%的NP文库读数的区域，在其它约66%的读数中应包含相应的WT核苷酸。生物信息学分析如材料和方法中所描述的进行。该分析的结果指向染色1中3.85百万核苷酸的区段，跨越SL2.5ch01:85115654- 88965277，作为可能的突变位置(表1)。分析显示在“2012文库”中在该区域9个纯合的突变SNPs，其在“NP文库”中为杂合子，即在该文库中仅42-24%的读数显示突变的等位基因，而其它包含预期的WT等位基因。有趣地，该区域中存在的两个突变的SNPs似乎源于颠换而非典型的EMS诱导的转换类型的点突变(Anderson 1995. Methods Cell Biol.;48:31-58.)。然而，EMS诱导的颠换在植物中以前报道过(例如Galpaz等人2013, Ghio等人2013)。

实施例3

标记辅助的2012突变的精细绘制

试图限制作为2012突变体基础的突变位置，沿提示为突变位置的染色体区间散布的6个SNPs (表1，第2列) 与单性结实表型的共分离在测交(TC)群体(如材料和方法中所描述的产生)中检查。该群体允许在热应激下在2013年晚夏结实。TC群体对于六个候选SNPs每一个的基因分型在表1第2列中说明，其作为服务由DYN R&D, Israel进行(参见材料和方法)。

表2概述该TC群体对6个点突变的表型分型和基因型分型结果。该分析表明SNPsNo. 1、5和6与突变无联系。另一方面，对于SNPs No. 2、3和4，尽管不绝对但紧密的联系存在于突变和表型之间(表2)。该分析表明这些SNPs无一位于造成2012突变的基因中，或者在一些植物的表型分型中存在问题，可能是由于可能掩盖单性结实表型的其它突变的拖延。无论如何，该分析的结果将突变位于的区域减小至小于700,000 nt，跨越SNP No. 2至No.4 (下表1、2)。

为了进一步放大突变的位置，相似地分析如材料和方法中所描述产生的2012BC₂F₂群体中具有突变形式的SNPs No. 2和3的单性结实表型的共分离。选择这些SNPs是因为在分析的TC群体中其显示比SNP No. 4更紧密一些的与性状的联系(下表2)。BC₂F₂群体携带比上述测交群体少的不相关的EMS诱导的突变，特别是较少的纯合突变SNPs，且在围绕2012突变的SNPs中应包括更多重组体。不像BC₁F₂和TC群体在极端高温下表型分型，为了促进分析，将BC₂F₂群体在几乎环境温度下在2014年春季检验，如材料和方法中所详述的。该分析的结果在表3中概述。该分析取消SNP No, 2作为候选，因为6个非单性结实植物对于其突变形式纯合。

单性结实表型和突变的SNP No. 3之间无完全联系这一事实提示突变可能位于SNP No. 3和No. 4之间。因此将突变的SNP No. 3纯合的植物也对于SNP No. 4基因分型。然而表型分型为非单性结实的三株植物也对于突变的SNP No. 4纯合这一发现(下表3)不支持该观念。将该“偏差”的遗传性在其子代，即在BC₂F₃群体中检验。将不是单性结实的SNPNo.3纯合的三株植物的子代在晚秋与显示明显的单性结实的4株BC₂F₂植物的子代并排种植，并允许在亚最佳温度下结果，如材料和方法中所描述的。在所有7个BC₂F₃家族中，所有植物结明显的单性果实。

总之，这些分析强烈表明突变的AGL6为单性结实突变2012潜在的基因。SlAGL6编码MADS框蛋白(图2A)，其属于MEF2 (肌细胞增强因子2)-样/MADS框蛋白II型亚家族(Smaczniak等人2012)。

实施例4

突变SlAGL6形式作为2012单性结实基因的基于CRISPR的验证

为了确认突变的AGL6为2012单性结实潜在的基因，利用CRISPR技术敲除SlAGL6基因Solyc01g093960。

合成的gRNA设计为靶向Solyc01g093960的第二个外显子(图2B)。将其引入CRISPR/Cas9敲除双元载体并转化入番茄系MP-1，如材料和方法中所详述的。检验R₀植物的突变形式的SlAGL6的存在情况，如材料和方法中所描述的。18株分析的R₀转基因植物中，11(61%)株在检验的扩增的DNA样品中的预期位点处携带突变的形式，如从在CAS9消化位点处通过非同源末端连接DNA修复所预期的(Lieber 2010)。果实从所有11株植物收集；其中3株确实仅结无籽果实，而其它确实结有籽和无籽果实二者。提供SlAGL6中的2012突变与CRISPR诱导的突变的等位性的最终证据，显示(图11) 2012突变的SlAGL6等位基因纯合的植物与sg1突变的等位基因纯合的植物之间的F₁杂种产生无籽果实，而同一2012植物与MP-1 (野生型SlAGL6等位基因纯合)之间的杂种仅产生有籽果实。

实施例5

CRISPR衍生的AGL6突变的R₁子代为单性结实

选择三株R₀植物(命名为sg1、sg4和sg5)的子代用于分析其结单性果实的能力，此三株R₀植物突变性质不同，但均导致提前终止密码子(表4)。由于这些突变导致提前终止密码子，从这些突变的基因转录的异常mRNA预期经由无义介导的降解(NMD) RNA监督机器被破坏(例如Chang等人2007; Drechsel等人2013; Degtiar等人2015)。

如果破坏不完全，突变的mRNA将翻译成下表4中所描绘的截短的AGL6蛋白。对于突变sg1，如果翻译，两个不同的产物预期待定，如果缺失内含子1的3’末端和内含子2的第一个nt，导致所有外显子2被剪接出，或如果截短的内含子1未剪接。将R₁幼苗基因分型以确定其为突变的等位基因纯合(m/m)或杂合子，或者对于WT (+/+)形式的AGL6等位基因纯合，以及基于靶位点两侧的PCR产物的AclI消化抗性和测序预期的Cas9靶两侧的PCR产物二者(参见材料和方法)。转基因Cas9的存在情况在每一R₁植物中经PCR测定(引物在材料和方法以及SEQ ID NOs. 19-20中详述)。发现植物sg4和sg5的几个R₁子代携带新的突变的等位基因，与表4B中说明的不同，或对于AGL6的二等位基因突变形式为突变的。这不意外，因为发现它们均仍包含CRISPR/Cas9盒。将基因分型为突变的AGL6杂合或纯合的植物在温室中与亲本系MP-1并排生长。将红色果实挑出、称重并在将其于赤道处横切之前和之后拍照，记录籽的存在或不存在情况。如表5中所概述的，杂合子子代确实仅结有籽果实，而SlAGL6的突变形式纯合或二等位基因的子代确实结单性果实，并且在许多情况下次有籽果实(结至多10个籽)和包含超过10个籽的果实(定义为有籽果实)。突变的兼性性质因此通过单性结实植物也产生有籽和次有籽果实的能力证明，如(图12)对于三个CRISPR衍生的突变系的每一个所显示的。因此与2012突变体相似，它们显示兼性单性结实表型。Cas9衍生的突变纯合或杂合的植物上发育的代表性的单性结实和有籽果实在图3A-F中呈现。

为了检查红色单性果实的胎座上见到的极小的籽样结构是否确实为扩大的胚珠而不是早期流产的胚，将花在开花前去雄，将从其发育的果实在成熟时分析。如表6中所显示的，R₁杂合子(+/m)子代或MP-1 (+/+)植物的去雄的花不结实，而约50%的去雄的纯合(m/m)花结实。以及如图4A、B中证明的，从自去雄的花发育的果实收集的流产的胚珠在尺寸和外观上与从在相同日期自同一植物挑选的非去雄的单性果实收集的那些相似。该观察结果表明突变的SlAGL6导致真“营养性单性结实”，而不是“刺激性”的单性结实(Varoquaux等人2000)。在2015年夏天期间盛行40天的非常极端的热应激下R₁单性结实植物继续结实而并排生长的不定型MP-1植物在这些条件下停止生产(数据未示出)，这一事实与突变的AGL6诱导的单性结实的营养性质一致。

最重要地，与亲本系MP-1相比，除了单性结实，缺乏Cas9盒的sg1子代在其生长习性、叶形状、到第一个花序的叶数目或花粉活力上不显示可检测的表型变化(图7A-C和7E-F)。并且果皮的外观及其细胞的形状与相似尺寸和重量的有籽WT果实不显示显著差异(图7G-J vs. 7K-N)。花中注意到的唯一的微妙差异为花瓣比WT苍白并且更窄和更长一些(图7D)。对花瓣颜色和其齿痕的微妙作用实际上在具有Phagl6突变的碧冬茄属中显著(Rijpkema等人2009)。

实施例6

估计突变的SlAGL6对生产参数的影响，提示无有害作用

作为评估AGL6突变对生产参数的可能害处的第一个步骤，其对果实重量的作用在三个不同的群体中检查：M82系背景中的分离的定型2012 BC₂F₂群体，大果实半定型品种Marmande和单性结实2012之间的分离F₂群体，和不定型MP-1系背景中的CRISPR/Cas9系sg1的R₁子代。在2012 BC₂F₂群体中，对总产量的影响也估计。

在2012 BC₂F₂群体中2012突变集中生产、增加果实重量而不减少生产潜能：突变对果实重量和生产潜能的作用在用于突变绘图的同一2012 BC₂F₂群体中评估(下表3)。该群体在对于受精依赖的结实近最佳的温度下生长。在2014年6月开始时，即在网棚中种植之后三个半月，将所有的红色、破色期和成熟绿色果实从携带下列三个替代的SlAGL6基因型的10-13株植物以及从8株M82植物收获：纯合 WT (+/+)等位基因、杂合子(+/m)或纯合突变的(m/m)等位基因，如材料和方法中所详述的。如图5A中所示，从突变的等位基因纯合的植物收获的生产潜能，表示为包括成熟绿色、破色期和红色果实的产量，与M82系，或对于SlAGL6等位基因的WT 纯合 (+/+)或杂合子(+/m)同胞无不同。此外，突变的等位基因纯合的植物特征在于极早的更集中的生产，表现在收获日期时显著更高的红色果实产量(图5B)。生产集中(yield concentration)的差异在图6A-F中清楚可见。如对于具有集中的生产的植物所预期的，在收获日期结许多红色果实的植物的树冠比M82或结较少红色果实的非单性结实同胞小很多。即更多的植物资源投入在可销售作物的生殖发育中而非投入在营养发育中。(m/m)植株上发育的红色果实的平均重量显著高于从亲本系M82或其(+/+)和(+/m)同胞收获的有籽红色果实(图5C)。如图8A-D中所证明的，各种单性结实BC₂F₂植物上发育的无籽果实通常具有完全或几乎完全的胶状物填充，并且在其许多中，在同一桁架上大量相似尺寸的果实同时达到完熟阶段(图8C)。

在从与大果实品种杂交衍生的F₂群体中2012突变的表达不减少平均果实重量：在许多情况下单性结实声称与有籽果实相比减少果实尺寸。为了开始评估2012突变也在引入大果实背景中时支持单性果实发育的潜能，将2012植物与中-大、多腔果实、半定型开放变种Marmande (www.rareseeds.com/marmande-tomato/)杂交，如材料和方法中所描述的。将该杂种的小群体F₂子代紧靠上述BC₂F₂群体生长在网棚中。植物对于SNP No. 3基因分型。果实仅从对于突变的SNP No.3等位基因基因分型为纯合的植物收集、称重并检查其结籽。即使在F₂，当平均果实重量总是与小果实亲本相似时(Perry 1915; Lippman和Tanksley2001)，在26个分析的植物中，具有最高的平均果实重量的5株植物中的两株显示非常强的单性结实表型，因为即使不是全部，多数其果实是无籽的(图9A-B)，另一个(#525, 图9A)确实结有籽和无籽果实二者。该初步评估表明突变不降低果实的平均重量，如果有的话，其可导致增加的重量。

Sg1子代的无籽果实的重量与亲本系MP-1无不同：意外地，发现植物sg1的13个检验的R₁子代中的12个缺乏转基因盒，而植物sg5和sg5的所有检验的子代包含转基因盒。这使得能够在sg1子代中评估AGL6突变本身对果实重量的作用。如图10中所示，在突变的AGL6纯合的8个子代中的6个中，无籽果实的重量与其有籽的杂合子同胞无显著不同，更重要地与亲本系MP-1的有籽果实无显著不同。在其中的两个中较低的平均重量最可能反映其经常比亲本系每桁架确实结更多果实并且那些通常比桁架上的第一个果实小这一事实。

AGL6诱导的单性结实的兼性性质的表现：一般而言，2012 BC₂F₂群体的纯合突变(m/m)植物上发育的多数果实为无籽的，即使在环境条件下发育。然而突变不是必然的单性结实，这对于从种子繁殖的作物如番茄将是严重的缺点。突变的植物中在受精许可条件下有利于结籽的准确条件尚待阐明。强烈的花序振动导致来自否则主要结无籽果实的植物的许多有籽果实(数据未示出)。不存在故意振动时，增强的趋势显然与两个参数相关。第一，在环境条件下在旧植物上发育的小果实经常结籽。这是例外的现象，因为公认的是，有籽果实比同一植株上发育的次有籽或单性果实大(例如Imanshi和Hiura 1975, Varga和Bruinsma. 1976, Carmi等人2003)。第二，在轻微低于最佳的温度结出的果实经常发现包含种子。在两种情况下种子产生据推测反应这样的条件，其减缓子房扩大成果实的速率从而允许花粉粒在花柱从否则迅速扩大的胚珠/果实分离之前完成胚珠萌发、延伸和受精。许多有籽果实也在2012 x Marmande杂种的(m/m) F₂子代上发育(图9A-B)。类似地，在环境条件下，在MP-1背景中从新突变的AGL6也使得能够无籽和有籽果实发育二者(表5，图12)。

实施例7

Slagl6改善热应激下的产量

在自然热应激条件下的产量通过比较MP-1和Slagl6纯合并且缺乏Cas9盒的sg1系(在R₂时)检查。将植物在2016年4月20日种植在网棚中，第一次收获在67天后进行。5月和6月期间日温非常高，包括三天长的一段(2016年5月14-16日)极端高温(最高日温38 ℃以上，图13H)。这些自然发生的热应激条件落入已知阻碍小孢子发生因此受精依赖的结实的“慢性温和热应激”的定义(参见Mesihovic等人, 2016，以及其中的参考文献)。如图13A中所证明的，在这些气候条件下，亲本系MP-1的红色果实产量显著低于系sg1 (低约85%)。该差异主要反映所产生的果实数目的显著差异(图13,B,F,G)，其在MP-1系中低83%，以及后者中显著更低的果实重量(图13C)，尽管仅低13%。与其它单性结实的突变体(例如Carmi等人, 2003;Casas Diaz等人, 1987)类似，完熟无籽果实的总可溶性固体(TSS)含量，表示为白利糖度，显著高于MP-1的有籽果实(图13D)，而果实的酸度(pH)保持相似(图13E)。

表1：染色体1中SNPs的描述，位于核苷酸85115654和88965277之间(SL2.50形式)，预测的2012突变位置。给出的为在两个测序文库的每一个中，该区域中9个SNPs的每一个中WT核苷酸的读数数目和突变的核苷酸的数目。所呈现的信息基于从每一文库两个泳道衍生的读数的生物信息学分析。SNPs II和VII代表颠换而非典型的EMS诱导的转换突变。

表2：2012突变测交群体的单性结实表型和表1中(第2列)说明的6个SNPs的每一个的共分离分析。群体在2013年晚夏生长和表征(细节参见结果部分)。m/m 突变SNP的纯合子，+/+ WT形式SNP的纯合子，+/m SNP杂合子。尽管对于所有6个SNPs，将96株植物表型分型并检验，但在几个案例中基因分型不产生明确的结果，因此对于一些SNPs呈现少于96个结果。

表3：在对于2012突变分离的BC₂F₂群体中单性结实表型和三个不同的SNPs No. 2和3基因型的共分离分析。检验的498株植物中，还分析突变形式的SNP No. 3纯合的126株植物中的SNP No. 4基因型。应注意突变的SNP No. 3纯合的3株非单性结实植物对于突变的SNP No. 4也纯合。群体在2014年晚春生长和表征(细节参加表1和结果部分)。m/m 突变SNP的纯合子，+/+ WT形式SNP的纯合子，+/m SNP的杂合子。

表4：研究的4个AGL6突变的描述：EMS诱导的2012突变和sg1、sg4、sg5，进一步研究的三个R₀ CRISPR诱导的突变。在B中，灰色阴影的AA与WT AGL6 蛋白的那些不同。

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A. 突变.

名称 序列变化

2012: C268/T

sg5 (R₀): 单个nt (T213)缺失

sg4^a (R₀): (1) 两个核苷酸(G213/T213)缺失，和(2) T213之后1个核苷酸添加

sg1 (R₀): 175个nt缺失，包括内含子1的最后98个nt，所有外显子2 (76 nt)和内含子2的第一个nt

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B. 检验的4个AGL6突变的假定翻译产物

SlAGL6^# MGRGRVELKRIENKINRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCEAEVALIIFSSRGKLYEFGSAGITKT LERYQRCCLNPQDNCGERETQSWYQEVSKLKAKFE……

2012 MGRGRVELKRIENKINRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCEAEVALIIFSSRGKLYEFGSAGITKTLERYQRCCLNPQDNCGERETQSWY*

sg4^a MGRGRVELKRIENKINRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCEAEVALIIFSSRGKLYEFGSAGITKTLERYQRLLP*

sg5 MGRGRVELKRIENKINRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCEAEVALIIFSSRGKLYEFGSAGITKTLERYQRVALILKTIVVKEKHRAGTKRSLN*

sg1a/sp^## MGRGRVELKRIENKINRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCEAEVALIIFSSRGKLYEFGSAELVPRGL*

sg1b/usp^& MGRGRVELKRIENKINRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCEAEVALIIFSSRGKLYEFGSAGYIHTYIYYLFFLYIYMKNVSSLLCMGS*

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^# 为了简化比对呈现，仅将WT AGL6蛋白的前100个AA呈现，下划线的为MADS框结构域(参见图5A)。

^## 如果从内含子1的5’完整末端至外显子2的完整3’末端剪接，预测的sg1产物。

^& 如果缺损的内含子1不剪接，预测的sg1产物。

* - 提前终止密码子

^a sg4分析提示在R₀已经二等位基因突变，呈现的突变在两株R₁植物中证实，其它R₁子代携带该等位基因和另一个突变的等位基因。分析的sg4-R₁植物无一携带WT等位基因。

表5：从番茄系MP-1背景中三株不同的R₀ CRISPR/cas9诱导的突变的AGL6植物衍生的R₁子代中单性果实的分析。注意发现所有检验的sg4子代为二等位基因突变体或突变形式的AGL6纯合子。仅称重超过8 g的果实包含在呈现的分析中。(+) WT等位基因，(m) –所有形式的CRISPR/cas9突变的AGL6等位基因。将果实分类为三个类别：(P)，如果完全不结籽，单性结实；(F)，仅结几个籽(≤10个籽)，(S) 有籽- 如果结10个以上的籽。

表6：从CRISPR/cas9突变的植物的去雄的花结实。在31.8.2015-8.9.2015之间，将花在开花前去雄并标记。将流产的花的标记收集并记录。在2015年9月24和30日将从去雄的花发育的完熟果实挑出并分析。

* m等位基因代表所有各种cas9突变形式的SlAGL6。

** 结实的去雄花的数目。

^## 从其收集数据的每一基因型的植物数目。

^# 流产的去雄花的数目。

^& 在亲本MP-1中，除了10个去雄的花之外，4个花在开花前未去雄标记，那些也由于热应激流产。

实施例8

产生兼性单性结实的茄子和辣椒

CaAGL6 (辣椒)或SmAGL6 (茄子)通过化学诱变种子突变，与如在番茄中描述的(在上文实施例1中)进行的相似，并且对于源于从诱变剂处理的种子生长的自交植物的M₁诱变家族，按照例如TILLING技术(Till等人2003)筛查其靶基因中的突变。将鉴定为在靶基因中携带突变的家族在受精限制条件(热应激或通过花去雄)下繁殖，并检验单性座果。或者，缺失在靶基因中通过利用例如CRISPR/Cas9技术基因编辑经由稳定转化产生，如对番茄进行的。

下列为可用作基于CRISPR的基因编辑的靶的示例性序列：

辣椒

>Capana01g00134基因靶，在核苷酸Chr01-44480416-44480435之间

GTATCACCAAAACCCTTGAG (SEQ ID NO: 17).

Capana01g00134 cDNA在核苷酸182-201之间靶向，切割经预测在核苷酸198-199之间发生。

茄子

>Sme2.5_06058.1靶，在核苷酸29543 – 29562 (负链)之间

GAGGATTAAGGCAACAACGT (SEQ ID NO: 18).

SME2.5 06058.1 cDNA在核苷酸204-229之间靶向，切割经预测在核苷酸212-213之间发生。

分析再生植物的靶位点中携带缺失的嵌合区段，如对于番茄所进行的，类似地筛查子代中的携带突变。将突变的AGL6等位基因纯合的子代对于单性结实经表型分析。

尽管已经结合其具体实施方案描述了本发明，但显然，多种供选方案、修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的。因此，意图包括所有落在随附权利要求书的精神和宽范围内的这类供选方案、修改和变化。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体结合到本说明书中，达到如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独指明通过引用并入本文的相同程度。

此外，在本申请中任何参考文献的引用或标识不应解释为承认所述参考文献可作为本发明的先有技术获得。就使用章节标题而言，不应解释为必然限制性的。

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Claims (30)

1.选自番茄、辣椒和茄子的茄科植物，其显示兼性单性结实并且在AGL6基因中包含功能缺失突变。

2.选自番茄、辣椒和茄子的茄科植物，其显示兼性单性结实和与相同遗传背景的非单性结实番茄至少大约相同的平均果实重量/植物。

3.权利要求1的茄科植物，进一步显示以下至少之一：

(i) 与相同遗传背景的非单性结实番茄在非单性结实番茄的受精许可条件下至少大约相同的果实产量/植物；

(ii) 与相同遗传背景的非单性结实番茄在非单性结实番茄的受精许可条件下至少大约相同的平均果实重量/植物；

(iii) 当所述茄科植物为番茄时包含胶状物填充；

(iv) 至少80%的果实产量缺乏同源异型畸变；和

(v) 无籽果实内从非受精子房发育的扩大的胚珠。

4.权利要求1-3中任一项的植物，其中所述果实产量为红色果实产量。

5.权利要求1-4中任一项的植物，其为番茄。

6.权利要求5的植物，其为加工番茄。

7.权利要求5的植物，其为定型番茄。

8.权利要求5的植物，其为不定型番茄。

9.权利要求5的植物，其为半定型番茄。

10.权利要求1-9中任一项的植物，其为良种系。

11.权利要求1-9中任一项的植物，其为转基因的。

12. 权利要求5-9中任一项的植物，其中所述番茄为选自普通番茄(Lycopersiconesculentum)、樱桃番茄(Lycopersicon cerasiforme)、醋栗番茄(Lycopersiconpimpinellifolium)、契斯曼尼番茄(Lycopersicon cheesmanii)、小花番茄(Lycopersiconparviflorum)、克梅留斯基番茄(Lycopersicon chmielewskii)、多毛番茄(Lycopersiconhirsutum)、潘那利番茄(Lycopersicon penellii)、秘鲁番茄(Lycopersiconperuvianum)、智利番茄(Lycopersicon chilense)和类番茄茄(Solanumlycopersicoides)的种类。

13.权利要求5-12中任一项的植物，其中所述番茄选自每桁架单果、分支番茄和樱桃番茄。

14.权利要求1-13中任一项的植物，其中所述兼性单性结实在热或冷应激下显示。

15.权利要求1-14中任一项的植物，其为自交系。

16.权利要求2-15中任一项的植物，其在AGL6基因中包含功能缺失突变。

17.权利要求1或权利要求16的植物，其中所述功能缺失突变为纯合子形式。

18.权利要求1-15中任一项的植物，其包含用于抑制AGL6基因表达的沉默剂。

19.权利要求16或权利要求17的植物，其外源表达选自大范围核酸酶、RNA引导的DNA内切核酸酶、锌指核酸酶和TALEN的核酸酶。

20.权利要求1-19中任一项的植物的果实。

21.权利要求1-19中任一项的植物的种子。

22.权利要求21的种子，其为杂种种子。

23.权利要求1-10中任一项的植物或果实的可食用加工产品。

24.权利要求23的加工产品，其选自番茄糊、番茄酱、番茄沙司、番茄汤、番茄汁、番茄粉、番茄切块、压碎的番茄、切碎的番茄和番茄浓缩物。

25.产生权利要求1-19中任一项的植物的方法，所述方法包括下调植物中AGL6基因的表达或活性。

26.权利要求25的方法，其中所述下调通过用诱变剂处理植物或其再生部分实现。

27.权利要求25的方法，其中所述下调通过用RNA沉默剂处理植物实现。

28.权利要求25的方法，其中所述下调通过用DNA编辑剂处理植物实现。

29.权利要求25-28中任一项的方法，使植物自交或杂交。

30.一种育种方法，包括使权利要求1-19中任一项的植物自交或杂交。