ES2910505T3 - Gen de regulación de la partenocarpia y uso del mismo - Google Patents
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Abstract
Un método para evaluar la partenocarpia de una planta solanácea, comprendiendo dicho método la etapa de: comprobar si la expresión de un gen regulador de la partenocarpia, que incluye un polinucleótido citado en cualquiera de (1) a (4) a continuación, se inhibe o no en la planta solanácea en comparación con la planta solanácea de tipo silvestre correspondiente; o comprobar si una función de un polipéptido, que está codificado por el gen regulador de partenocarpia, se inhibe o no en la planta solanácea, en donde la función del polipéptido se refiere a una actividad (actividad transferasa de grupos amino) para catalizar una reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un ácido indolpirúvico (IPyA), en comparación con la planta solanácea de tipo silvestre correspondiente, (1) Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1, (2) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una identidad de secuencia del 75 % o superior con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia, (3) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 98 aminoácidos se sustituyen en, se eliminan de, se insertan en y/o se añaden a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia, y (4) un polinucleótido que (i) se hibrida con un polinucleótido, que tiene una secuencia complementaria al polinucleótido mencionado en el anterior (1), en una condición rigurosa y (ii) codifica un polipéptido que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia.
Description
DESCRIPCIÓN
Gen de regulación de la partenocarpia y uso del mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un gen regulador de la partenocarpia y a un método para producir una planta con el uso del gen regulador de partenocarpia y similares.
Antecedentes de la técnica
En plantas solanáceas tal como la berenjena y el tomate, en general, la polinización normalmente se produce después de la antesis, y un fruto se agranda después de que se formen semillas en el fruto. Por otro lado, un rasgo con el que un fruto normalmente se agranda y madura sin polinización y formación de semillas se denomina partenocarpia. Este rasgo es significativamente ventajoso en los campos de agricultura, horticultura, y similares en cuanto a la cosecha de frutos sin realizar, por ejemplo, trabajos tales como la inducción de la polinización con el uso de insectos visitantes de flores o la inducción de la fructificación mediante la aplicación de fármacos hormonales.
De manera convencional, en cuanto a las solanáceas, se ha sabido que el cambio en la cantidad de auxina, que es una de las fitohormonas, en un ovario es uno de los factores para inducir la partenocarpia. Por ejemplo, se sabe que la partenocarpia se induce aplicando una auxina sintética a una flor de berenjena o similar (Nothmann et al. (1975) J. Hort. Sci. 50: 23-27).
Con respecto a un mecanismo de síntesis de ácido indolacético (en lo sucesivo en el presente documento, "IAA"), en una planta, que es una de las auxinas naturales, ha habido un estudio previo en el que se utiliza Arabidopsis como planta modelo experimental. En Arabidopsis, la existencia de una vía IPyA se conoce como vía biosintética. Además, se supone la existencia de una vía TAM, una vía IAM, y similares. Cada vez está más claro que muchos genes son relevantes para estas vías y, recientemente, no sólo se ha informado de un gen que codifica una enzima que funciona positivamente con respecto a la síntesis de IAA sino también de la existencia de un gen que codifica una enzima que funciona negativamente. Por ejemplo, Zheng et al. 2013 (Nature Chem. Biol. 9: 244-246) divulga VAS1 que cataliza la reacción para generar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de la metionina a un ácido indolpirúvico (IPyA, por sus siglas en inglés) en una vía de IPyA que es una de las vías de síntesis de IAA de Arabidopsis. Por lo tanto, VAS1 codifica una enzima que funciona negativamente con respecto a la síntesis de IAA.
Rotino et al. 1997 (Nature Biotechnology 15: 1398-1401) divulga que la partenocarpia se induce en la berenjena mediante la expresión específica de placenta y específica de óvulo de iaaM, que es una enzima de síntesis de IAA relevante para una vía de IAM que (i) es una de las vías de síntesis de IAA y (ii) existe en una bacteria. Obsérvese que se realizó un experimento en la bibliografía que no pertenece a patentes 3 con el uso de una planta en la que la expresión excesiva de iaaM de Pseudomonas derivada de bacterias se provocó con el control de un promotor derivado de boca de dragón.
Sumario de la invención
Problema técnico
Como se divulga en Nothmann et al. 1975 y Zheng et al. 2013, se conoce la existencia de genes relevantes para la síntesis de IAA. Sin embargo, el mecanismo de síntesis de IAA es una vía muy complicada y es predecible que muchos genes desconocidos desempeñen funciones importantes en la vía de síntesis de IAA. Adicionalmente, la aclaración de las funciones de los genes desconocidos en la síntesis de IAA puede dar lugar a una técnica muy útil en los campos de la agricultura, la horticultura y similares. Dependiendo de las condiciones de cultivo o de las líneas de cultivares, la expresión fenotípica de la partenocarpia puede volverse inestable y, por lo tanto, a veces es difícil evaluar la partenocarpia si la evaluación se basa solamente en la apariencia de una planta. Por otra parte, para evaluar la partenocarpia, se requiere mucha mano de obra y tiempo para la emasculación antes de la antesis, la evaluación del cuajado de los frutos, y similares.
La presente invención se realiza en vista de los problemas, y su objetivo es (i) identificar un gen nuevo que sea responsable de la partenocarpia y (ii) proporcionar el uso del gen nuevo.
Solución al problema
Para lograr este objetivo, la presente invención abarca el siguiente aspecto:
<1> Un método para evaluar la partenocarpia de una planta solanácea, incluyendo el método las etapas de: comprobar si la expresión de un gen regulador de la partenocarpia, que incluye un polinucleótido citado en cualquiera de (1) a (4) a continuación, se inhibe o no en la planta en comparación con la planta solanácea de tipo silvestre correspondiente; o comprobar si una función de un polipéptido, que está codificado por el gen regulador de partenocarpia, se inhibe o no en la planta solanácea, en donde la función del polipéptido se refiere a una actividad (actividad transferasa de
grupos amino) para catalizar una reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un ácido indolpirúvico (IPyA), en comparación con la planta solanácea de tipo silvestre correspondiente.
(1) Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1,
(2) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una identidad de secuencia del 75 % o superior con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia,
(3) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 98 aminoácidos se sustituyen en, se eliminan de, se insertan en y/o se añaden a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia, y
(4) un polinucleótido que (i) se hibrida con un polinucleótido, que tiene una secuencia complementaria al polinucleótido mencionado en el anterior (1), en una condición rigurosa y (ii) codifica un polipéptido que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia.
En el presente documento se describe un gen regulador de la partenocarpia que incluye un polinucleótido mencionado en cualquiera de (1) a (4) a continuación.
(1) Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1,
(2) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una identidad de secuencia del 75 % o superior con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia,
(3) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 98 aminoácidos se sustituyen en, se eliminan de, se insertan en y/o se añaden a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia, y
(4) un polinucleótido que (i) se hibrida con un polinucleótido, que tiene una secuencia complementaria al polinucleótido mencionado en el anterior (1), en una condición rigurosa y (ii) codifica un polipéptido que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia.
También se describe un polipéptido mencionado en cualquiera de (1) a (4) a continuación.
(1) Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1,
(2) un polipéptido (i) que tiene una identidad de secuencia del 75 % o más con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia, (3) un polipéptido (i) que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 98 aminoácidos se sustituyen en, se eliminan de, se insertan en y/o se añaden a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia, y
(4) un polipéptido que (i) está codificado por un polinucleótido que se hibrida, en condiciones rigurosas, con un polinucleótido que tiene una secuencia complementaria a un polinucleótido para codificar el polipéptido mencionado en (1) anterior y (ii) tiene una actividad reguladora de la partenocarpia.
También se describe en el presente documento una planta que es una planta partenocárpica y en la que (i) se inhibe la expresión de un gen regulador de la partenocarpia, que incluye un polinucleótido citado en cualquiera de (1) a (4) a continuación o (ii) se inhibe una función de un polipéptido, que está codificado por el gen regulador de partenocarpia, está inhibido.
(1) Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1,
(2) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una identidad de secuencia del 75 % o superior con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia,
(3) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 98 aminoácidos se sustituyen en, se eliminan de, se insertan en y/o se añaden a la secuencia de aminoácidos
representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia, y
(4) un polinucleótido que (i) se híbrida con un polinucleótido, que tiene una secuencia complementaria al polinucleótido mencionado en el anterior (1), en una condición rigurosa y (ii) codifica un polipéptido que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia.
Efectos ventajosos de la invención
Es posible evaluar la partenocarpia de una planta o producir una planta partenocárpica utilizando, como un indicador o una diana, un gen o un polipéptido codificado por el gen.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una vista que ilustra la partenocarpia de una línea de berenjena partenocárpica "PCSS" en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 2 es una vista que ilustra un mapa de ligamiento de una región en la que se localiza un gen A responsable de la partenocarpia en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 3 es una vista que ilustra una correspondencia entre un fenotipo (es decir, presencia/ausencia de partenocarpia) y un genotipo marcador en generaciones después del cruzamiento de una línea de berenjena partenocárpica PCSS y una línea de berenjena no partenocárpica TN-43 en el ejemplo 1 de la presente invención. La figura 4 es una vista que ilustra las cantidades de acumulación de ARNm en los genes A de los sitios de "Nakateshinkuro" en diferentes etapas de desarrollo, en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 5 es una vista que ilustra esquemáticamente una estructura de un gen A y una estructura de mutación de un gen A en una línea PCSS, en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 6(a) es una vista que ilustra esquemáticamente un vector que tiene una secuencia promotora de un gen A, en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 6(b) es una vista que ilustra esquemáticamente un vector construido durante la preparación de un vector de inducción de ARNi, en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 6(c) es una vista que ilustra esquemáticamente un vector construido durante la preparación de un vector de inducción de ARNi, en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 6(d) es una vista que ilustra esquemáticamente un vector de inducción de ARNi en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 7 es una vista que ilustra la partenocarpia de un transformante de berenjena en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 8 es una vista que ilustra una cantidad de acumulación de un transcrito del gen A partenocárpico en cada uno de los transformantes de berenjena en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 9 es una vista que ilustra una concentración de IAA endógeno en una línea PCSS de berenjena partenocárpica, en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 10 es una vista que ilustra una concentración de producto intermedio en una vía de síntesis de IAA endógeno o una concentración de metabolito de IAA en una línea PCSS de berenjena partenocárpica, en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 11 es una vista que ilustra una concentración de IAA endógeno en un transformante de berenjena, en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 12 es una vista que ilustra la actividad de transferasas de grupos amino, en el ejemplo 1 de la presente invención.
La figura 13(a) es una vista que ilustra esquemáticamente un vector construido durante la preparación de un vector de inducción de ARNi, en el ejemplo 2 de la presente invención.
La figura 13(b) es una vista que ilustra esquemáticamente un vector de inducción de ARNi, en el ejemplo 2 de la presente invención.
La figura 13(c) es una vista que ilustra esquemáticamente un vector que tiene una secuencia promotora de un gen tA, en el ejemplo 2 de la presente invención.
La figura 13(d) es una vista que ilustra esquemáticamente un vector de inducción de ARNi, en el ejemplo 2 de la presente invención.
La figura 14 es una vista que ilustra la partenocarpia de un transformante de tomate, en el ejemplo 2 de la presente invención.
La figura 15 es una vista que ilustra una cantidad de acumulación de un transcrito de un gen partenocárpico tA en un transformante de tomate, en el ejemplo 2 de la presente invención.
La figura 16 es una vista que ilustra una concentración de IAA endógeno en un transformante de tomate, en el ejemplo 2 de la presente invención.
La figura 17 es una vista que ilustra la partenocarpia de un pimiento mutante, en el ejemplo 3 de la presente invención.
La figura 18 es una vista que ilustra una concentración de IAA endógeno en un pimiento mutante, en el ejemplo 3 de la presente invención.
La figura 19 es una vista que ilustra el análisis del promotor de un gen A partenocárpico con el uso de un gen GUS (p-glucuronidasa), en el ejemplo 4 de la presente invención.
La figura 20 es una vista que ilustra la partenocarpia de un transformante de berenjena producido por separado del transformante de berenjena del ejemplo 1, en el ejemplo 4 de la presente invención.
La figura 21 es una vista que ilustra una cantidad de acumulación de un transcrito de un gen A partenocárpico y una concentración de IAA endógeno en un transformante de berenjena producido por separado del transformante de berenjena del ejemplo 1, en el ejemplo 4 de la presente invención.
La figura 22 es una vista que ilustra esquemáticamente un vector para preparar un transformante de berenjena, en el ejemplo 4 de la presente invención.
La figura 23 es una vista que ilustra la partenocarpia de un transformante de berenjena en una línea "M3A", en el ejemplo 4 de la presente invención.
La figura 24 es una vista que ilustra la concentración de IAA endógeno en un transformante de berenjena en una línea "M3A", en el ejemplo 4 de la presente invención.
La figura 25 es una vista que ilustra los pesos de un fruto producido a partir de una flor polinizada de forma normal y un fruto producido a partir de una flor cuya polinización se ha evitado eliminando su estigma en líneas casi isogénicas, en el ejemplo 4 de la presente invención.
La figura 26 es una vista que ilustra esquemáticamente un vector de expresión de E. coli de un gen A, en el ejemplo 4 de la presente invención.
La figura 27 es una vista que ilustra (i) el resultado de realizar una electroforesis en la proteína purificada de una proteína A que se ha expresado en E. coli y (ii) la actividad de transferasas de grupos amino de la proteína A de expresión en E. coli, en el ejemplo 4 de la presente invención.
Descripción de las realizaciones
La siguiente descripción analizará realizaciones de la presente invención.
[Definición de términos]
En la presente memoria descriptiva, "polinucleótido" puede reformularse como "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico", y pretende ser un polímero de nucleótidos. Por otra parte, "secuencia de bases" puede reformularse como "secuencia de ácidos nucleicos" o "secuencia de nucleótidos", y pretende ser una secuencia de desoxirribonucleótidos o una secuencia de ribonucleótidos, a menos que se indique lo contrario en particular.
En la presente memoria descriptiva, "polipéptido" se puede reformular como "proteína".
En la presente memoria descriptiva, "partenocarpia (partenocárpico/a)" pretende ser un rasgo de una planta cuyo fruto se agranda sin polinización.
En la presente memoria descriptiva, "heterocigoto (heterocigótico)" pretende ser un estado en el que genes alélicos diferentes se encuentran en los locus de genes correspondientes en los respectivos cromosomas homólogos, y "homocigoto (homocigótico)" pretende ser un estado en el que genes alélicos idénticos se encuentran en los locus de genes correspondientes en los respectivos cromosomas homólogos.
En la presente memoria descriptiva, "berenjena" es un concepto que engloba, en sentido amplio, las especies cultivadas "Solanum (en lo sucesivo en el presente documento, "S") melongena" y las especies silvestres "S. incanum", "S. torvum", "S. nigrum", "S. aethiopicum", "S. macrocarpon", y "S. quitoense", y pretende ser "S. melongena" en sentido estricto.
En la presente memoria descriptiva, "tomate" es un concepto que engloba, en sentido amplio, las especies cultivadas "S. lycopersicum" y las especies silvestres "S. cheesmaniae, S. chilense, S. chmielewskii, S. galapagense, S. habrochaites, S. lycopersicoides, S. neorickii, S. pennellii, S. peruvianum y S. pimpinellifolium", y pretende ser "S. lycopersicum" en sentido estricto.
En la presente memoria descriptiva, "pimiento" es un concepto que engloba, en sentido amplio, las especies cultivadas "Capsicum (en lo sucesivo en el presente documento, "C") annuum", y las especies silvestres "C. pubescens", "C. baccatum", "C. chinense" y "C. frutescens", y pretende ser "C. annuum" en sentido estricto. Por otra parte, "pimiento" es un concepto que engloba las plantas denominadas con nombres distintos de "pimiento", por ejemplo, cultivos hortícolas llamados "pimentón", "paprika" y "pimiento dulce".
En la presente memoria descriptiva, "A y/o B" es un concepto que incluye tanto "A y B" como "A o B", y puede reformularse como "al menos uno de A y B".
En la presente memoria descriptiva, una expresión "los polinucleótidos son complementarios entre sí" es sinónimo de "las secuencias de bases de los respectivos polinucleótidos son complementarias entre sí".
[1. Gen regulador de la partenocarpia]
Un gen regulador de la partenocarpia según la presente invención codifica un polipéptido que tiene una actividad (es decir, una actividad reguladora de la partenocarpia) para regular al menos la partenocarpia. El polipéptido "que tiene actividad para regular la partenocarpia" indica que la expresión de un rasgo, es decir, la partenocarpia se inhibe por la presencia del polipéptido, es decir, la partenocarpia está regulada negativamente. Por otra parte, en un caso en el que se inhiba la expresión del gen regulador de partenocarpia de la presente invención o se inhiba una actividad de un polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia, una planta muestra un rasgo de partenocarpia o tiene una predisposición al rasgo, aunque no se muestre partenocarpia.
Por otra parte, un ejemplo del gen regulador de la partenocarpia de la presente invención codifica una transferasa de grupos amino que cataliza la reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a IPyA. En un caso en el que la transferasa tenga actividad, se inhibe la expresión del rasgo de partenocarpia (es decir, tiene actividad reguladora de la partenocarpia), mientras que en un caso en el que se inhibe la actividad de la transferasa, una planta muestra un rasgo de partenocarpia o tiene una predisposición al rasgo, aunque no se muestre partenocarpia.
El gen regulador de la partenocarpia de la presente invención incluye cualquiera de los polinucleótidos descritos en los siguientes (1) a (4):
(1) Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1.
(2) Un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una identidad de secuencia del 75 % o superior con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia. Obsérvese que la identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos es preferentemente del 80 % o superior, más preferentemente 85 % o superior, más preferentemente 90 % o superior, incluso más preferentemente 95 % o superior, particularmente preferentemente 96 % o superior, 97 % o superior, 98 % o superior o 99 % o superior. Por ejemplo, un gen mutante derivado de berenjena y un gen homólogo derivado de una planta distinta de la berenjena están incluidos en este alcance.
(3) Un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 98 aminoácidos se sustituyen en, se eliminan de, se insertan en y/o se añaden a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia. Obsérvese que el número de aminoácidos que se sustituyen, eliminan, insertar y/o añaden es más preferentemente de 1 a 78, más preferentemente de 1 a 43, más preferentemente de 1 a 39, más preferentemente de 1 a 19, incluso más preferentemente, de 1 a 15, particularmente preferentemente de 1 a 11, de 1 a 5 o 6.
Obsérvese que la eliminación, sustitución y/o adición de aminoácidos puede, por ejemplo, (i) realizarse mediante la introducción artificial de una o más mutaciones mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio, tal como un método Kunkel (Kunkel et al. (1985): Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol. 82. p488-) o (ii) derivar de un polipéptido mutante similar de origen natural.
(4) Un polinucleótido que (i) se hibrida con un polinucleótido, que tiene una secuencia complementaria al polinucleótido descrito en el anterior (1), en una condición rigurosa y (ii) codifica un polipéptido que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia. Obsérvese que la condición rigurosa es, por ejemplo, una condición descrita en la bibliografía de referencia [Molecular cloning- a Laboratory manual 2nd edition (Sambrook et al., 1989)]. De manera específica, la condición estricta es, por ejemplo, una condición en la que el polinucleótido se hibrida al calentarse de manera constante, a 65 °C durante 8 a 16 horas junto con una sonda, en una solución que contiene 63 SSC (composición de 1 3 SSC: cloruro de sodio 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0), SDS al 0,5 %, 53 Solución de Denhardt y 100 mg/ml de ADN de esperma de arenque. Obsérvese que el polinucleótido preferentemente tiene una identidad de secuencia del 75 % o superior, más preferentemente tiene una identidad de secuencia del 80 % o superior, más preferentemente tiene una identidad de secuencia del 85 % o superior, incluso más preferentemente tiene una identidad de secuencia del 90 % o superior, particularmente preferentemente tiene una identidad de secuencia del 95 % o superior, 96 % o superior, 97 % o superior, 98 % o superior o 99 % o superior, con respecto a la secuencia de bases del polinucleótido descrito en el anterior (1).
El gen regulador de la partenocarpia de la presente invención puede existir en forma de ARN (por ejemplo, ARNm) o en forma de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico). El ADN puede ser bicatenario o monocatenario. La secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2, que es un ejemplo del polinucleótido de la presente invención, es un ADNc de longitud completa de un gen que codifica el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 1. El gen regulador de la partenocarpia de la presente invención puede incluir una secuencia adicional tal como una secuencia de una región no traducida (UTR, por sus siglas en inglés).
Un método para obtener (aislar) el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención no se limita a uno en particular y puede ser un método que incluya, por ejemplo, (i) preparar una sonda que se hibrida específicamente con una parte de la secuencia de bases del gen regulador de la partenocarpia y (ii) seleccionar una biblioteca de ADN genómico o una biblioteca de ADNc.
Como alternativa, el método para obtener el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención puede ser un método que utilice medios de amplificación tales como PCR. Por ejemplo, una gran cantidad de fragmentos de ADN, cada uno de los cuales contiene el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención, puede obtenerse (i) preparando cebadores a partir de las respectivas secuencias del extremo 5' y del extremo 3' (o secuencias complementarias de las mismas) en el ADNc del gen regulador de la partenocarpia, (ii) realizar una PCR o similar con el uso de cebadores y ADN genómico (o ADNc) o similar como plantilla y (iii) amplificar una región de ADN entre los cebadores.
Un origen del gen regulador de la partenocarpia de la presente invención no se limita a uno en particular, siempre que el origen sea una planta solanácea. Entre estos, el origen es preferentemente una planta solanácea tal como berenjena o tomate, o una planta de capsicum tal como pimiento, más preferentemente cualquiera de berenjena, tomate y pimiento, más preferentemente berenjena o tomate, particularmente preferentemente berenjena.
Obsérvese que si un gen candidato del gen regulador de partenocarpia aislado tiene o no una actividad reguladora de partenocarpia prevista puede evaluarse observando si la partenocarpia de la planta original se induce o no mediante la inhibición de la expresión del gen candidato en la planta original.
El gen regulador de la partenocarpia de la presente invención se puede usar para dilucidar un mecanismo de partenocarpia de una planta.
Los ejemplos del gen regulador de la partenocarpia de la presente invención abarcan un gen derivado de S. melongena que es berenjena (SEQ ID NO: 2, Se Q ID NO: 3 (incluyendo ORF), SEQ ID NO: 4 (desde un sitio de inicio de la transcripción hasta un sitio de finalización de la transcripción) y SEQ ID NO: 24 (una secuencia desde 2000 bases cadena arriba de un sitio de inicio de la transcripción hasta 1000 bases cadena abajo de un sitio de finalización de la transcripción)), un gen derivado de S. lycopersicum que es tomate (SEQ ID NO: 29), un gen derivado de S. pimpinellifolium que es una especie afín de tomate (SEQ ID NO: 31), un gen derivado de S. tuberosum phureja que es patata (especie diploide) (SEQ ID NO: 33), un gen derivado de Capsicum annuum que es pimiento (SEQ ID NO: 35), un gen derivado de Malus domestica que es manzana (SEQ ID NO: 37) y similares. Por otra parte, el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención abarca un gen que incluye nucleótidos que tienen una actividad reguladora de la partenocarpia y tienen una identidad de secuencia del 75 % o superior, 80 % o superior, 85 % o superior, 90 % o superior, 95 % o superior, 96 % o superior, 97 % o superior, 98 % o superior o 99 % o superior, con respecto a una secuencia de bases del polinucleótido ejemplificado anteriormente.
El gen regulador de la partenocarpia de la presente invención no se limita a un sitio de expresión particular y a una etapa de desarrollo particular en la que se produce la expresión. Por ejemplo, el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención se expresa en una yema antes de la antesis o en un ovario en la antesis.
[2. Polipéptido como proteína reguladora de la partenocarpia]
El polipéptido de la presente invención es un producto obtenido mediante la traducción del gen regulador de la partenocarpia descrito en la parte [1. Gen regulador de la partenocarpia] anterior y tiene al menos una actividad para regular la partenocarpia de una planta. Tal como se describe anteriormente, el polipéptido de la presente invención inhibe la aparición del rasgo de partenocarpia, es decir, regula negativamente la partenocarpia.
El polipéptido de la presente invención se puede aislar de un recurso natural o se puede sintetizar químicamente. De manera específica, el polipéptido abarca un producto obtenido mediante la purificación de una sustancia aislada de un recurso natural, un producto obtenido en un proceso de síntesis química, y un producto traducido obtenido de un hospedador procariota o de un hospedador eucariota (por ejemplo, célula bacteriana, célula de levadura, célula de vegetal superior, célula de insecto o célula de mamífero) mediante una técnica de recombinación.
De manera específica, el polipéptido de la presente invención es un polipéptido descrito en cualquiera de (1) a (4) a continuación. Obsérvese que el polipéptido es un producto traducido del gen regulador de la partenocarpia. Por consiguiente, un significado de expresiones tales como "hibridar en condiciones estrictas" puede entenderse con referencia a las descripciones en [1. Gen regulador de la partenocarpia] anterior.
(1) Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1.
(2) Un polipéptido (i) que tiene una identidad de secuencia del 75 % o superior con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia. Obsérvese que la identidad de secuencia es preferentemente del 80 % o superior, más preferentemente 85 % o superior, más preferentemente 90 % o superior, incluso más preferentemente 95 % o superior, particularmente preferentemente 96 % o superior, 97 % o superior, 98 % o superior o 99 % o superior.
(3) Un polipéptido (i) que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 98 aminoácidos se sustituyen en, se eliminan de, se insertan en y/o se añaden a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia. Obsérvese que el número de aminoácidos que se sustituyen, eliminan, insertar y/o añaden es más preferentemente de 1 a 78, más preferentemente de 1 a 43, más preferentemente de 1 a 39, más preferentemente de 1 a 19, incluso más preferentemente, de 1 a 15, particularmente preferentemente de 1 a 11, de 1 a 5 o 6.
(4) Un polipéptido que (i) está codificado por un polinucleótido que se hibrida, en condiciones rigurosas, con un polinucleótido que tiene una secuencia complementaria a un polinucleótido para codificar el polipéptido descrito en (1) anterior y (ii) tiene una actividad reguladora de la partenocarpia.
El polipéptido puede ser un polipéptido constituido por enlaces peptídicos de aminoácidos. Obsérvese, sin embargo, que el polipéptido no se limita a esto y puede contener una estructura distinta de una estructura polipeptídica. La estructura distinta del polipéptido puede ser una cadena de azúcares, un grupo isoprenoide y similares, pero sin limitación a estos en particular.
Por otra parte, el polipéptido de la presente invención es una transferasa de grupos amino. De manera más específica, el polipéptido de la presente invención tiene una función como proteína enzimática para catalizar una reacción para generar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino que se encuentra en un aminoácido a IPyA. Como otro aspecto, por ejemplo, el polipéptido de la presente invención tiene una función como proteína enzimática para catalizar una reacción para generar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino que se encuentra en una metionina a IPyA.
Obsérvese que los ejemplos del polipéptido de la presente invención como proteína reguladora de la partenocarpia abarcan un polipéptido derivado de S. melongena que es berenjena (SEQ ID NO: 1), un polipéptido derivado de S. lycopersicum que es tomate (SEQ ID NO: 28 ), un polipéptido derivado de S. pimpinellifolium que es una especie afín de tomate (SEQ ID NO: 30), un polipéptido derivado de S. tuberosum phureja que es patata (especie diploide) (SEQ ID NO: 32), un polipéptido derivado de Capsicum annuum que es pimienta (SEQ ID NO: 34), un polipéptido derivado de Malus domestica que es manzana (SEQ ID NO: 36), y similares.
[3. Transformante y vector de expresión recombinante]
También se describe en el presente documento (i) un vector de expresión recombinante en el que se incorpora el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención de manera que el gen regulador de la partenocarpia se puede expresar y (ii) un transformante en el que el vector de expresión recombinante o el gen regulador de la partenocarpia se introduce de manera que se pueda expresar el vector de expresión recombinante o el gen regulador de la partenocarpia.
Un tipo de vector para constituir el vector de expresión recombinante no se limita a uno en particular, y se puede
seleccionar un vector que pueda expresarse en una célula hospedadora según sea apropiado. Es decir, una secuencia promotora se selecciona de manera apropiada dependiendo de un tipo de célula hospedadora y un vector, en el que se incorporan la secuencia promotora y el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención, por ejemplo, se puede utilizar como un vector de expresión un plásmido, un fagémido, un cósmido, o similares.
Los ejemplos de la célula hospedadora en la que se introduce un vector de expresión abarcan una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula fúngica distinta de una célula de levadura, una célula eucariota superior, y similares. La célula bacteriana puede ser, por ejemplo, una célula de E. coli. Los ejemplos de la célula eucariota superior abarcan una célula vegetal y una célula animal. Los ejemplos de la célula vegetal abarcan una célula de dicotiledónea y una célula de monocotiledónea. La célula de dicotiledónea puede ser, por ejemplo, una célula cultivada en suspensión de una planta solanácea (por ejemplo, una cepa BY-2 de tabaco y una cepa Sly-1 de tomate), y la célula de monocotiledónea puede ser, por ejemplo, una cepa Oc que es una célula de arroz cultivada en suspensión. Los ejemplos de la célula animal abarcan una célula de insecto, una célula de anfibio, una célula de reptil, una célula de ave, una célula de pez, una célula de mamífero y similares.
El vector es, preferentemente, un vector de expresión. En el vector de expresión, el polinucleótido de la presente invención está unido funcionalmente con un elemento (por ejemplo, un promotor) que es necesario para la transcripción. Por otra parte, según se necesite, el polinucleótido de la presente invención se puede unir con un potenciador, un marcador de selección, una señal de corte y empalme, una señal de adición de poli A, una secuencia 5'-UTR, y/o similares. El promotor es una secuencia de ADN que muestra una actividad de transcripción en una célula hospedadora y puede seleccionarse apropiadamente según el tipo de hospedador.
Los ejemplos de una secuencia promotora que puede funcionar en una célula hospedadora abarcan un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, un promotor del gen de la nopalina sintetasa de Agrobacterium, un promotor del gen de la ubiquitina de arroz, y similares.
Es posible usar una secuencia de una región promotora en el polinucleótido para su uso en la presente invención como promotor de expresión recombinante de la presente invención.
En el vector de expresión, el polinucleótido para su uso en la presente invención se puede unir funcionalmente con un terminador adecuado (por ejemplo, un terminador NOS o un terminador 35S del virus del mosaico de la coliflor), según se necesite. Se puede seleccionar un tipo de terminador adecuado según sea apropiado según un tipo de célula hospedadora, siempre que el terminador sea una secuencia que pueda terminar la transcripción de un gen que se transcribe mediante el promotor descrito anteriormente. El potenciador se usa para potenciar la eficacia de la expresión de un gen deseado y puede ser, por ejemplo, una secuencia omega del virus del mosaico del tabaco.
El vector de expresión recombinante para su uso en la presente invención puede contener además un marcador de selección. El marcador de selección puede ser, por ejemplo, un gen de resistencia a un fármaco tal como ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina o espectinomicina.
En el vector de expresión recombinante, el polinucleótido de la presente invención se puede unir con una secuencia etiqueta adecuada para la purificación de proteínas o una secuencia espaciadora adecuada, según se necesite.
El transformante abarca un organismo, así como una célula, un tejido y un órgano en el que se introduce el vector de expresión recombinante o el gen regulador de la partenocarpia de manera que se pueda expresar el vector de expresión recombinante o el gen regulador de la partenocarpia. Una especie de transformante no se limita a una en particular y puede ser, por ejemplo, un microorganismo tal como E. coli, una planta, un animal o similares.
[4. Método para evaluar la partenocarpia de plantas solanáceas]
Un método de la presente invención para evaluar la partenocarpia incluye una etapa de comprobación (i) si se inhibe o no la expresión del gen regulador de la partenocarpia, que incluye un polinucleótido mencionado en cualquiera de (1) a (4), en la planta solanácea en comparación con la planta solanácea de tipo silvestre correspondiente o (ii) si se inhibe o no una función de un polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia en la planta solanácea, en donde la función del polipéptido se refiere a una actividad (actividad transferasa de grupos amino) para catalizar una reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un ácido indolpirúvico (IPyA), en comparación con la planta solanácea de tipo silvestre correspondiente.
En el presente caso, el "gen regulador de la partenocarpia" indica el gen regulador de la partenocarpia descrito en [1. Gen regulador de la partenocarpia] anterior, y el "polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia" indica el polipéptido descrito en [2. Polipéptido como proteína reguladora de la partenocarpia] anterior. Obsérvese que la inhibición de la expresión del gen regulador de la partenocarpia abarca la inhibición de la transcripción génica y la inhibición de la traducción a una proteína.
Por otra parte, el caso en el que "se inhibe la expresión del gen regulador de la partenocarpia" abarca tanto (i) un caso en el que se inhibe la expresión de un gen partenocárpico funcional que existe como (ii) un caso en el que un gen
partenocárpico en sí mismo que puede expresarse no tiene una función o solamente tiene una función incompleta. Entre estos, un caso de ejemplo en el que el gen partenocárpico no tiene una función puede ser un caso en el que se expresa un gen partenocárpico mutante cuya función es deficiente.
Adicionalmente, el caso en el que "se inhibe una función de un polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia" abarca tanto (i) un caso en el que se controla el nivel de expresión de un polipéptido que tiene una actividad y existe y (ii) un caso en el que un polipéptido mismo que se expresa no tiene actividad o solamente tiene una función incompleta.
Por otra parte, en la etapa de comprobación, se prefiere seleccionar, como planta candidata cuya partenocarpia está regulada, (i) una planta en la que se determina que la expresión del gen regulador de la partenocarpia está inhibida o (ii) una planta en la que se determina que la función del polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia está inhibida.
Un método para realizar la etapa de comprobación no se limita a uno en particular y puede ser, por ejemplo, un método genético, un método bioquímico y similares. Entre estos, los ejemplos del método genético abarcan la medición de un nivel de expresión de un gen regulador de la partenocarpia, el análisis de una secuencia de bases de un gen regulador de la partenocarpia, el análisis con el uso de una secuencia marcadora y similares. Los ejemplos del método bioquímico abarcan el análisis de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido, la medición de la actividad de un polipéptido, la determinación cuantitativa de un producto de reacción metabólica con el que se relaciona un polipéptido y similares. Las siguientes descripciones 1) a 6) analizarán los detalles de estos métodos. Obsérvese que, entre estos métodos, se prefiere el método de 1) o 2) en vista de la facilidad de trabajo.
1) Medición del nivel de expresión del gen regulador de la partenocarpia
Se mide un nivel de expresión del gen regulador de la partenocarpia en una planta diana y, si fuera necesario, en comparación con un nivel de expresión patrón y, por lo tanto, se comprueba si la expresión del gen regulador de la partenocarpia se inhibe o no. El nivel de expresión del gen se puede medir, por ejemplo, (i) midiendo una cantidad de un transcrito con un método tal como RT-PCR cuantitativa o hibridación Northern o (ii) midiendo una cantidad de un producto traducido con un método tal como transferencia Western cuantitativa. El nivel de expresión patrón indica, por ejemplo, un nivel de expresión del gen regulador de partenocarpia en una planta coespecífica que no muestra partenocarpia (por ejemplo, un individuo que tiene el gen regulador de partenocarpia como homocigoto). Obsérvese que, en un caso en el que la transcripción o traducción del gen regulador de la partenocarpia se inhiba sustancialmente por completo con el uso de un método tal como la alteración del gen o ARNi, puede ser innecesaria la comparación con el nivel de expresión patrón.
Con respecto al nivel de expresión del gen regulador de la partenocarpia, se prefiere medir un nivel de expresión específico de sitio particular en una etapa de desarrollo particular. El sitio particular puede ser un ovario o una yema floral completa y la etapa de desarrollo puede ser una etapa antes de la antesis o una etapa en la antesis.
2) Análisis de la secuencia de bases del gen regulador de la partenocarpia
Se analiza una secuencia de bases de un gen regulador de la partenocarpia (ADN genómico, ARNm o ADNc) de una planta diana. A continuación, en caso de que se encuentre una o más mutaciones que influyan en una función del polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia como resultado del análisis, se determina que la función del polipéptido está inhibida. Las una o más mutaciones que influyen en la función del polipéptido pueden ser, por ejemplo, eliminación de varias decenas a varios miles de pares de bases de nucleótidos, incluida una región codificante del gen regulador de la partenocarpia, preferentemente la eliminación de al menos 4000 pb a 5000 pb de nucleótidos.
Otro ejemplo de la una o más mutaciones que influyen en la función del polipéptido puede ser la duplicación de varias decenas a varios miles de pares de bases de nucleótidos, incluida una región codificante del gen regulador de la partenocarpia, preferentemente la duplicación de al menos 200 pb a 300 pb de nucleótidos.
Otro ejemplo de la una o más mutaciones que influyen en la función del polipéptido puede ser una mutación en el gen regulador de la partenocarpia, cuya mutación provoca una denominada mutación sin sentido o mutación de desplazamiento de marco de lectura. Tal mutación puede estar causada por 1 pb o más de mutación en la región codificante.
Por otra parte, esas mutaciones se producen, por ejemplo, en una región o en una pluralidad de regiones. En un caso donde las mutaciones se producen en la pluralidad de regiones, los diferentes tipos de mutaciones descritos anteriormente pueden producirse en regiones de mutación correspondientes.
Obsérvese que dicha una o más mutaciones pueden producirse en al menos uno de los dos genes reguladores de la partenocarpia (es decir, un par de genes reguladores de la partenocarpia) en un cromosoma homólogo, y se prefiere que la una o más mutaciones se produzcan en los dos genes reguladores de la partenocarpia (es decir, homocigoto recesivo).
3) Análisis usando la secuencia marcadora
En caso de que se utilice una secuencia marcadora que muestre una unión con la una o más mutaciones en el gen regulador de la partenocarpia, la secuencia de bases del gen regulador de la partenocarpia puede comprobarse directa o indirectamente. La secuencia marcadora se ubica, por ejemplo, a aproximadamente 20 cm (es decir, aproximadamente 20 cm a 0 cm), preferentemente se ubica a aproximadamente 10 cm, más preferentemente se ubica a aproximadamente 1 cm, más preferentemente se ubica a aproximadamente 0,1 cm, de una ubicación del gen regulador de la partenocarpia. Obsérvese que, por supuesto, es posible utilizar la una o más mutaciones en el gen regulador de la partenocarpia como secuencia marcadora.
4) Análisis de la secuencia de aminoácidos del polipéptido
Un polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia se aísla de una planta diana y se analiza una secuencia de aminoácidos del polipéptido. A continuación, en un caso en el que se observan una o más mutaciones (por ejemplo, generación de un cuerpo truncado que provoca la eliminación de varias decenas o más de aminoácidos), que influyen en una función del polipéptido, como resultado del análisis, se determina que la función del polipéptido está inhibida.
5) Medición de la actividad del polipéptido
De una planta diana, se aísla un polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia. Como alternativa, un clon del gen regulador de la partenocarpia en la planta diana se introduce en un vector de expresión y a continuación, el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora y, por lo tanto, se expresa de forma transitoria un polipéptido. La célula hospedadora que expresa el polipéptido se cultiva, el polipéptido se extrae y purifica a partir de la célula hospedadora y a continuación, se usa para comprobar la presencia/ausencia de una actividad transferasa de grupos amino que cataliza la síntesis de triptófano en la que se utilizan como sustrato IPyA y aminoácidos. En caso de que la actividad transferasa de grupos amino no exista o sea inferior a la de una planta normal, se determina que la función del polipéptido está inhibida. En un aspecto, se comprueba la presencia/ausencia de una actividad transferasa de grupos amino que cataliza la síntesis de triptófano en la que se utiliza IPyA y metionina como sustratos, y en el caso en el que la actividad transferasa de grupos amino no exista o sea inferior a la de una planta normal, se determina que la función del polipéptido está inhibida.
Como vector de expresión para expresar el péptido anterior, se utiliza de manera adecuada el vector de expresión descrito en [3. Vector de expresión recombinante y transformante].
Por otra parte, como célula hospedadora, se utiliza de manera adecuada la célula hospedadora descrita en [3. Vector de expresión recombinante y transformante].
Los métodos de síntesis, la extracción y la purificación de un polipéptido no se limitan a unos concretos, y se pueden utilizar adecuadamente métodos conocidos. Los ejemplos del método para sintetizar el polipéptido abarcan (i) un método en el que un polipéptido se expresa transitoriamente en una hoja de tabaco o similar a través de Agrobacterium y (ii) un método en el que un polipéptido se expresa mediante la transformación de un vector de expresión de un polipéptido en E. coli y el cultivo de E. coli.
El método para medir la actividad transferasa de grupos amino que cataliza la síntesis de triptófano en el que se utilizan IPyA y aminoácidos como sustratos puede ser, por ejemplo, un método en el que se prepara una solución de reacción incubando una mezcla de (i) el polipéptido obtenido por el método descrito anteriormente, (ii) una solución mixta de aminoácidos (Arg, Gln, Cys, Asp, Gly, Met, Phe y Glu) y (iii) IPyA, y después, la solución de reacción se purifica y se somete a análisis LC/MS/MS. En otro aspecto, se emplea un método en el que se prepara una solución de reacción incubando una mezcla del polipéptido obtenido por el método descrito anteriormente, metionina (por ejemplo, L-Met) e IPyA, y después la solución de reacción se purifica y se somete a análisis LC/MS/MS. Por otra parte, se prefiere realizar la comprobación de 6) a continuación además del análisis de 4) o 5) para comprobar, en el método de evaluación de partenocarpia de la presente invención, si se inhibe o no una función del polipéptido de la presente invención.
6) Medición de cantidades de ácido indolacético (IAA) endógeno y un ácido indolpirúvico (IPyA) endógeno
De una planta diana, se extrae una solución que contiene al menos uno de ácido indol acético (IAA) endógeno y un ácido indol pirúvico (IPyA) endógeno y se comprueba la cantidad de al menos una de estas sustancias. A continuación, en caso de que la cantidad de sustancias sea significativamente mayor que la de una planta normal como resultado de la comprobación, se determina que se inhibe una función del polipéptido. Obsérvese que la cantidad significativamente mayor de sustancias no se limita a una en particular, y es preferentemente una cantidad (concentración) que es dos veces o más, más preferentemente tres veces o más.
Por otra parte, la cantidad de al menos una de las sustancias es preferentemente una cantidad específica de sitio
comprobada en una etapa de desarrollo particular. El sitio particular puede ser un ovario o una yema floral completa y la etapa de desarrollo puede ser una etapa antes de la antesis o una etapa en la antesis. Es decir, se prefiere más medir una concentración de IAA o IPyA que es un precursor de IAA en un ovario o una yema floral antes de la antesis o en la antesis.
Los ejemplos del método para medir la cantidad de la sustancia abarcan la medición con el uso de un espectrómetro de masas, medición con el uso de HPLC, ELISA y similares. Entre estos, en vista de la excelente sensibilidad y precisión, se prefiere el método de medición con el uso de un espectrómetro de masas. El espectrómetro de masas utilizado en la medición puede ser LC/MS/MS, GC/MS, o similares.
El tipo de planta al que se aplica el método de evaluación de la presente invención es una planta solanácea. Entre estas, la planta es preferentemente una planta solanácea tal como berenjena o tomate, o una planta de capsicum tal como pimiento, más preferentemente cualquiera de berenjena, tomate y pimiento, más preferentemente berenjena o tomate, particularmente preferentemente berenjena. Por otra parte, los ejemplos de una planta a la que se aplica el método de evaluación abarcan un material de fitomejoramiento (planta progenitora, es decir, progenitor del polen o progenitor de la semilla) y la descendencia obtenida por fitomejoramiento. Obsérvese que el término "fitomejoramiento" indica un concepto que abarca (i) un método que utiliza el cruzamiento y (ii) un método de ingeniería genética.
La expresión fenotípica de la partenocarpia a veces se vuelve inestable según las condiciones de cultivo o la línea de cultivares y, por lo tanto, con frecuencia es difícil llevar a cabo una evaluación basada únicamente en la apariencia de una planta. Por otra parte, vale la pena usar una planta en la que el gen regulador de la partenocarpia es heterocigoto como material de fitomejoramiento o similar, pero, en particular, cuando el gen regulador de la partenocarpia es heterocigoto, a veces es imposible evaluar claramente solamente a partir de la apariencia si se puede mostrar o no la partenocarpia. El método de la presente invención para evaluar la partenocarpia se realiza a nivel de gen y, por lo tanto, la evaluación de rasgos se puede realizar sin convertir genes en homocigotos. Por ejemplo, esto hace posible mejorar significativamente la eficacia en la selección para fitomejoramiento. Adicionalmente, se ha identificado el gen regulador de la partenocarpia, por lo que es posible descartar, con el uso de una técnica de ingeniería genética o similar, la unión con un rasgo desfavorable que se ha cosegregado naturalmente con el gen regulador de la partenocarpia.
[5. Método para producir plantas solanáceas con partenocarpia regulada y plantas solanáceas producidas]
Una forma (en lo sucesivo, en el presente documento, denominada "forma 1") de un método de la presente invención para producir una planta solanácea con partenocarpia regulada es un método que incluye una etapa de selección de una planta solanácea con partenocarpia regulada mediante la realización del método de evaluación descrito en [4. Método para evaluar la partenocarpia de plantas solanáceas] anterior.
Como alternativa, otra forma (en lo sucesivo, en el presente documento, denominada "forma 2") del método de la presente invención para producir una planta solanácea con partenocarpia regulada es un método que incluye una etapa de inhibición de la expresión del gen regulador de la partenocarpia en la planta o una etapa de inhibición de una función de un polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia en la planta. En el presente caso, el "gen regulador de la partenocarpia" es el descrito en [1. Gen regulador de la partenocarpia] anterior, y el "polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia" es el descrito en [2. Polipéptido como proteína reguladora de la partenocarpia] anterior.
Obsérvese que, en la forma 2, se prefiere inhibir la expresión del gen regulador de la partenocarpia alterando el gen regulador de la partenocarpia o introduciendo, en la planta, un polinucleótido que inhibe la expresión del gen regulador de la partenocarpia. Obsérvese que la expresión "inhibir la expresión del gen regulador de la partenocarpia" abarca (i) la inhibición de la transcripción de un gen y (ii) la inhibición de la traducción en proteína. El método para inhibir la expresión del gen regulador de la partenocarpia alterando el gen regulador de la partenocarpia o introduciendo, en la planta, un polinucleótido que inhibe la expresión del gen regulador de la partenocarpia es un método de ingeniería genética.
Un método para alterar el gen regulador de la partenocarpia no se limita a uno en particular. Por ejemplo, como el método de ingeniería genética, es posible emplear (i) un método en el que la inducción de mutaciones génicas se realiza mediante tratamiento con EMS (sulfonato de etil metano), (ii) un método en el que se introduce un codón de terminación en la mitad del gen regulador de la partenocarpia mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio, o (iii) un método en el que una parte de un gen se altera físicamente irradiando la parte del gen con un haz de iones pesados o similar.
Por otra parte, el método para introducir, en la planta, un polinucleótido que inhibe la expresión del gen regulador de la partenocarpia no se limita a uno en particular y puede ser, por ejemplo, un método tal como ARN de interferencia o a Rn antisentido. Un método para introducir, en la planta, un casete de expresión (por ejemplo, un vector) que contiene el polinucleótido no se limita a uno en particular, y es posible emplear, según sea adecuado, un método que utiliza polietilenglicol, electroporación, un método a través de Agrobacterium, o un método usando una pistola de partículas. Obsérvese que el casete de expresión que contiene el polinucleótido se puede introducir en una célula vegetal, un
callo, un tejido vegetal, o un individuo vegetal.
Obsérvese que la expresión del gen regulador de la partenocarpia se puede inhibir mediante la introducción de una o más mutaciones, que inhiben la expresión génica, a una secuencia de ajuste de la expresión (por ejemplo, una secuencia promotora o una secuencia potenciadora) que regula la expresión del gen regulador de la partenocarpia.
También se describe en el presente documento una planta solanácea con partenocarpia regulada, que se ha producido por el método de producción descrito anteriormente. La expresión "planta con partenocarpia regulada" indica un concepto que abarca (i) una planta en la que se muestra el rasgo de partenocarpia y (ii) una planta en la que no se muestra el rasgo de partenocarpia pero que tiene una predisposición a la partenocarpia.
El tipo de planta que se produce mediante el método de la presente invención es una planta solanácea. Entre estas, la planta es preferentemente una planta solanácea tal como berenjena o tomate, o una planta de capsicum tal como pimiento, más preferentemente cualquiera de berenjena, tomate y pimiento, más preferentemente berenjena o tomate, particularmente preferentemente berenjena.
Un aspecto de la planta solanácea producida por el método de la presente invención abarca una planta que muestra partenocarpia debido a que el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención tiene una mutación génica idéntica a la de una planta (berenjena) especificada por un número de registro de FERM BP-22257 descrito en [6. Planta con partenocarpia regulada] a continuación o una planta descendiente de la misma.
Otro aspecto de la planta solanácea producida por el método de la presente invención abarca una planta (i) en la que el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención tiene mutación génica y (ii) que por lo tanto muestra una partenocarpia idéntica a la de una planta (berenjena) especificada por un número de registro de FERM BP-22257 descrita en [6. Planta con partenocarpia regulada] a continuación o una planta descendiente de la misma.
[6. Planta solanácea con partenocarpia regulada]
En el presente documento se describe una nueva planta solanácea que muestra partenocarpia. La planta es una planta partenocárpica en la que (i) se inhibe la expresión de un gen regulador de la partenocarpia (es decir, el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención), que incluye un polinucleótido citado en cualquiera de (1) a (4) a continuación, o (ii) se inhibe una función de un polipéptido (es decir, el polipéptido de la presente invención), que está codificado por el gen regulador de partenocarpia.
(1) Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1,
(2) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una identidad de secuencia del 75 % o superior con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia,
(3) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 98 aminoácidos se sustituyen en, se eliminan de, se insertan en y/o se añaden a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia, y
(4) un polinucleótido que (i) se hibrida con un polinucleótido, que tiene una secuencia complementaria al polinucleótido mencionado en el anterior (1), en una condición rigurosa y (ii) codifica un polipéptido que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia.
En un ejemplo de la nueva planta partenocárpica, en función del polipéptido, se disminuye o es defectuosa una actividad (actividad transferasa de grupos amino) para catalizar una reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de los aminoácidos a un ácido indolpirúvico (IPyA), en comparación con una de tipo silvestre. En otro ejemplo de la planta partenocárpica, en función del polipéptido, se disminuye o es defectuosa una actividad (actividad transferasa de grupos amino) para catalizar una reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de metionina a un ácido indolpirúvico (IPyA), en comparación con una de tipo silvestre. Es decir, se describe una planta en la que, en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, se produce la sustitución, eliminación, inserción y/o adición de un aminoácido para provocar una disminución o un defecto de la actividad transferasa de grupos amino. Un ejemplo más específico de una planta de este tipo es una planta (berenjena) especificada por el número de registro de FERM BP-22257 o una planta descendiente de la misma (véanse también los ejemplos). Obsérvese que la planta está depositada en el National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary (2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818) tal como el número de registro de FERM BP-22257 (fecha de depósito: 11 de septiembre de 2013). Un ejemplo más específico de la planta de la descendencia puede ser la berenjena que (i) se obtiene mediante cruzamiento simple o cruzamiento doble de la línea de berenjena especificada por el número de registro de FERM BP-22257 con otra línea de berenjena o con una planta especificada por el número de registro de FERM BP-22257 y (ii) muestra partenocarpia debido a que el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención tiene una mutación génica idéntica a la de la planta especificada
por el número de registro de FERM BP-22257.
Otro ejemplo de la planta partenocárpica puede ser una planta (i) que tiene una mutación en una secuencia de bases del gen regulador de la partenocarpia de la presente invención en comparación con una de tipo silvestre, (ii) en la que se controla una cantidad de acumulación de ARNm en el gen regulador de la partenocarpia en un ovario no polinizado en la antesis, y (iii) que muestra partenocarpia.
Otro ejemplo más de la planta partenocárpica puede ser una planta (i) que tiene una mutación en una secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención en comparación con una de tipo silvestre, (ii) en la que, en función del polipéptido, se disminuye o es defectuosa una actividad transferasa de grupos amino en un ovario no polinizado en la antesis y (iii) que muestra partenocarpia. Por otra parte, otro ejemplo más específico de la planta partenocárpica puede ser una planta partenocárpica (i) en la que la actividad transferasa de grupos amino en función del polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia de la presente invención en el ovario no polinizado en la antesis es una actividad para catalizar una reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de metionina a un ácido indolpirúvico (IPyA), (ii) que tiene una mutación en una secuencia de aminoácidos del polipéptido en comparación con una de tipo silvestre, y (iii) en la que se disminuye o es defectuosa la actividad para catalizar una reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de metionina a un ácido indolpirúvico ( IPyA).
Por otra parte, otro ejemplo más de la planta partenocárpica puede ser una planta (i) que tiene una mutación en una secuencia de bases del gen regulador de la partenocarpia de la presente invención en comparación con una de tipo silvestre, (ii) en la que se aumenta una cantidad endógena de auxina (o IAA o IPyA) en un ovario no polinizado en la antesis y (iii) que muestra partenocarpia.
Otro ejemplo de la planta partenocárpica abarca una planta en la que se muestra el rasgo de la partenocarpia, entre plantas con partenocarpia regulada producidas por el método de producción descrito en [5. Método para producir plantas solanáceas con partenocarpia regulada y plantas producidas] anterior. La planta partenocárpica es preferentemente una planta solanácea tal como berenjena o tomate, o una planta de capsicum tal como pimiento, más preferentemente cualquiera de berenjena, tomate y pimiento, más preferentemente berenjena o tomate, particularmente preferentemente berenjena. Por otra parte, la planta partenocárpica abarca una planta descendiente de la planta partenocárpica. Obsérvese que la planta es un concepto que abarca un cuerpo de la planta en sí mismo, una parte del cuerpo de la planta, una semilla y similares. Adicionalmente, la planta partenocárpica abarca una planta que produce, a partir de una flor que no se ha polinizado, un fruto que tiene un peso de fruto equivalente al de un fruto que normalmente se produce a partir de una flor que normalmente se ha polinizado en las mismas condiciones de cultivo.
La presente invención no se limita a las realizaciones, pero se pueden modificar de diversas formas por un experto en la materia dentro del alcance de las reivindicaciones. Es decir, una realización derivada de una combinación apropiada de medios técnicos apropiadamente modificados dentro del alcance de las reivindicaciones también está incluida en el alcance técnico de la presente invención.
[Ejemplos]
[Ejemplo 1: Gen A de partenocarpia derivado de berenjena]
(1. Identificación y análisis del gen A responsable de la partenocarpia derivado de berenjena)
<Descubrimiento de la línea de berenjena partenocárpica "PCSS">
La siguiente descripción se dará con referencia a la figura 1. La figura 1 es una vista que ilustra la partenocarpia de una línea de berenjena partenocárpica "PCSS" según el ejemplo 1 de la presente invención. (a) de la figura 1 ilustra un fruto de berenjena, en una línea de berenjena partenocárpica "PCSS", cuyo estigma se cortó en un estado de yema antes de la antesis para evitar la polinización. (b) de la figura 1 ilustra (i) un fruto (izquierda) de berenjena en la línea de berenjena partenocárpica "PCSS" y (ii) un fruto (derecha) de berenjena "Senryo-nigo", que es de un cultivar común no partenocárpico. Cada estigma de la berenjena en la línea de berenjena partenocárpica "PCSS" y la berenjena "Senryo-nigo" se cortó en una etapa de yema antes de la antesis para evitar la polinización.
La línea PCSS es una línea fija autofecundada de berenjena partenocárpica (Solanum melongena). Esta línea se encontró en el proceso de fitomejoramiento realizado con el uso de descendencia debido al cruzamiento entre las líneas de plantas madre de mejoramiento "línea 1" y "línea 2" de berenjena que se crio únicamente por los inventores.
En un caso en el que se cortó el estigma en la etapa de yema antes de la antesis para evitar la polinización, el fruto de la berenjena "Senryo-nigo", que es de un cultivar común no partenocárpico, apenas estaba agrandado (véase (b) de la figura 1), mientras que el fruto de la berenjena en la línea PCSS normalmente estaba agrandado ((a) y (b) de la figura 1).
Un análisis posterior aclaró lo siguiente:
(1) ni la "línea 1" ni la "línea 2", cada una de los cuales se utilizó como línea progenitora para el fitomejoramiento, tenía partenocarpia; (2) de un gran número de líneas hermanas autofecundadas obtenidas de la descendencia debido al cruzamiento entre esas dos líneas, ninguna línea tenía partenocarpia, excepto la línea PCSS; (3) entre la descendencia autofecundada de la línea PCSS, todos los individuos tenían partenocarpia; y (4) entre la descendencia debido al cruzamiento entre la línea PCSS y una línea no partenocárpica, los individuos que tenían partenocarpia similar a la de la línea PCSS aparecieron con una frecuencia dada.
En vista de los resultados anteriores, se concluyó que la partenocarpia de la línea PCSS se atribuía a una nueva mutación génica provocada por una mutación natural en el proceso de cruzamiento. Como tal, la línea PCSS se registró con el número de registro "FERM BP-22257" como una línea de berenjena partenocárpica.
<Mapeo detallado de la partenocarpia>
La primera generación filial obtenida del cruzamiento de la línea de berenjena partenocárpica PCSS con una línea de berenjena no partenocárpica TN-43 (criada por TAKII & CO., LTD.) se autofecundó para obtener la segunda generación filial (F2). 93 individuos en esta generación F2 se cultivaron y evaluaron en términos de partenocarpia. Como resultado, de los 93 individuos, 23 individuos tenían partenocarpia, mientras que 70 individuos no tenían partenocarpia. Como tal, una relación de segregación fue de aproximadamente 1:3. Esto sugirió que la partenocarpia de la línea PCSS estaba bajo el control de un único gen recesivo. El ADN genómico se extrajo de esos individuos F2 y los genotipos marcadores del ADN genómico se determinaron con el uso de 64 marcadores de ADN distribuidos en todo el genoma de la berenjena (Bibliografía de referencia: Fukuoka et al. (2012) Theor. Appl. Genet. 125: 47-56). Se calculó una ubicación cromosómica, en un mapa de unión de marcadores, de un gen responsable de la partenocarpia con el uso de Mapmaker/EXP (Bibliografía de referencia: Lander et al., 1987, Genomics 1: 174-181) según la información sobre los genotipos marcadores, y se dedujo la ubicación cromosómica del gen. La figura 2 ilustra un mapa de unión de una región en la que se dedujo que estaba ubicado un gen A responsable de la partenocarpia. Como se ilustra en la figura 2, se dedujo que el gen estaba ubicado en una región de aproximadamente 20 cM, intercalado entre dos marcadores de ADN SOL7214 y eme07D02, del tercer cromosoma.
Adicionalmente, por comparación directa entre los genotipos y fenotipos marcadores, se intentó determinar la región en la que estaba ubicado el gen. Un resultado de la determinación se ilustra en la figura 3. La figura 3 es una vista que ilustra la correspondencia entre los fenotipos y los genotipos marcadores de cada generación después del cruzamiento de la línea de berenjena partenocárpica PCSs con la línea de berenjena no partenocárpica TN-43. (a) de la figura 3 es una vista que ilustra la correspondencia entre fenotipos y genotipos marcadores de una generación F2.
Como se ilustra en (a) de la figura 3, un individuo 24 y un individuo 44 no tenían partenocarpia y un individuo 30 y un individuo 45 tenían partenocarpia. Esto reveló que el gen estaba ubicado en una región intercalada entre est_smfl28j21 y eme07D02. Obsérvese aquí que se informa que, en una vecindad de esta región que está presente en el tercer grupo de unión de la berenjena, el orden de disposición de los genes está altamente conservado, en comparación con un cromosoma de tomate (synteny) (Bibliografías de referencia: Wu et al. (2009) Theor. Appl. Genet. 118: 927-935, Fukuoka et al. (2012) Theor. Appl. Genet. 125: 47-56). En vista de esto, se desarrollaron nuevos marcadores de ADN con el uso de una secuencia genómica de tomate para reducir la ubicación cromosómica del gen. De dos marcadores de ADN que definieron los extremos correspondientes de la región en la que se dedujo que se ubicaba el gen, est_smfl28j21 se desarrolló basándose una secuencia SmFL28J21 expresada en berenjena (Bibliografía de referencia: Fukuoka et al. (2010) Gene 450: 76-84), y se observó, por búsqueda con BLASTN con respecto a una secuencia genómica completa de tomate (SL2.40ch, Bibliografía de referencia: The Tomato Genome Consortium (2012) Nature 485: 635-641), que tenía una identidad de secuencia extremadamente alta con un gen predicho Solyc03g118430.2.1 que estaba presente en una región del número de nucleótido 61358472 al número de nucleótido 61373773 de un tercer cromosoma de tomate. Por otro lado, eme07D02 es un marcador SSR genómico que utiliza secuencias repetidas dispersas en un genoma de berenjena. Debido a que había sido difícil predecir correctamente la correspondencia entre eme07D02 y la secuencia genómica de tomate, se avanzó el desarrollo de un marcador según una secuencia de SOL8369 ubicada fuera de eme07D02 (es decir, opuesto a est_smfl28j21). La secuencia de berenjena SmFL14B23 expresada, derivada de SOL8369, tenía una identidad de secuencia extremadamente alta con un gen predicho Solyc03g123840.2.1 predicho en una región del número de nucleótido 64597421 al número de nucleótido 64602015 del tercer cromosoma de tomate. Es decir, se dedujo que la región en la que se ubicaba el gen responsable de la partenocarpia de la línea PCSS correspondía, según el genoma del tomate, a una región de aproximadamente 3,24 Mb desde el nucleótido número 61358472 hasta el nucleótido número 64602015 del tercer cromosoma en el genoma de tomate. Asimismo, con el uso de secuencias EST de berenjena descifradas de forma exclusiva (43.250 secuencias en total) como secuencias de consulta, se realizó una búsqueda BLAST con respecto a la secuencia genómica de tomate para comprobar una identidad de secuencia. Como resultado, se encontraron 427 EST de berenjena que correspondían al gen predicho presente en la región de 3,24 Mb en el genoma de tomate. En vista de esto, se diseñó un cebador de PCR según las 427 secuencias EST de berenjena, después se amplificó el ADN genómico de cada línea PCSS y de la línea TN-43, y se comprobó el polimorfismo del ADN genómico. Por lo tanto, fue posible organizar nueve marcadores SNP y un marcador SSR entre est_smfl28j21 y SOL8369. Con el uso de esos marcadores, se compararon los fenotipos (es decir, presencia/ausencia de partenocarpia) y los genotipos marcadores de cada individuo en una generación F3 y en generaciones posteriores. En primer lugar, con respecto a
una región intercalada entre est_smfl28j21 y SOL8369, los individuos F2 que tenían una región derivada de PCSS para convertirse en heterocigotos y una región derivada de TN-43 se autofecundaron, y se seleccionó un individuo que tenía recombinación entre las dos regiones entre la descendencia de los individuos F2 con el uso de marcadores de ADN. A continuación, el individuo se autofecundó para reproducir una línea homocigota recombinante. La línea homocigota recombinante se estudió en términos de presencia/ausencia de partenocarpia, y se repitió el desarrollo de nuevos marcadores SNP para identificar una parte recombinante. Los resultados se ilustran en (b) de la figura 3. (b) de la figura 3 es una vista que ilustra la correspondencia entre los fenotipos y los genotipos marcadores de la generación F3 y las generaciones posteriores. Como se ilustra en (b) de la figura 3, una posible región genómica en la que estaba presente el gen responsable de la partenocarpia podría reducirse a lo largo de generaciones, es decir, la posible región genómica se redujo a una región intercalada entre ec3110A y ec3077F en la generación F3, a una región intercalada entre SSR03 y ec3087X en una generación F5 cuya región estaba ubicada en un lado interno de la región intercalada entre ec3110A y ec3077F, y a una región intercalada entre SSR03 y PaSeq128 en una generación F8 cuya región estaba ubicada en un lado interno de la región intercalada entre SSR03 y ec3087X.
(2. Aislamiento del gen A responsable de la partenocarpia)
<Aislamiento y determinación de la secuencia del ADNc de longitud completa del gen A>
Mediante exploración de una biblioteca BAC de berenjena (línea AE-P03, mejorada por la agencia administrativa incorporada National Agriculture and Food Research Organization) con el uso de un cebador de PCR que amplifica PaSeq123, se aisló un clon BAC 08K19 que incluía dicha región. Se creó una biblioteca indiscriminada de este clon y se determinó una secuencia de bases con respecto a la longitud total del inserto. Como resultado, se reveló que, según la línea AE-P03, existía una distancia física entre SSR03 y PaSeq128 de 31.484 pb. En un caso en el que se determinaron las secuencias de bases tanto de la línea PCSS como de la línea TN-43 en la región, se reveló que la línea PCSS tenía una mutación estructural característica que no se encontró en la línea TN-43 ni en la línea AE-P03. En un caso en el que se analizó con más detalle una estructura de la mutación estructural, se reveló que la línea PCSS tenía una eliminación de 4558 pb y una duplicación de 227 pb en una región entre SSR03 y PaSeq123.
Con respecto a la región intercalada entre SSR03 y PaSeq128, un gen estructural fue predicho por un programa de predicción de genes GenScan (Bibliografía de referencia: Burge, C. y Karlin, S. (1997) J. Mol. Biol. 268: 78-94) con el uso de una secuencia de tipo silvestre (AE-P03). Como resultado, se sugirió la presencia de cuatro genes estructurales. Se dedujo que uno (gen A) de los cuatro genes estructurales estaba presente en una parte en la que se producía la mutación estructural, específica de la línea PCSS, y que, según la línea PCSS, una región génica que incluía una región codificante de proteína estaba eliminada parcialmente debido a la eliminación de 4558 pb.
En vista de esto, el ADNc de longitud completa del gen A se clonó mediante el método RACE para confirmar que el gen predicho por el programa de predicción de genes estaba realmente presente. La clonación se realizó con el uso de (i) cebadores de PCR diseñados según una secuencia de bases de dicho gen predicho y (ii) como material, el ARN total extraído de una yema de berenjena no partenocárpica "Nakateshinkuro", que es de cultivar patrón.
En primer lugar, el ARN total se extrajo, por el método Trizol, de un ovario extraído de una yema de berenjena "Nakateshinkuro" aproximadamente 3 días antes de la antesis, y se sintetizó ADNc con el uso del kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Takara Bio Inc.). Con el uso de (i) el ADNc como plantilla y (ii) los polinucleótidos representados por la SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40 como cebadores específicos de genes, se intentó la amplificación del ADNc, incluido un sitio de inicio de la transcripción y un sitio de inicio de la traducción del ARNm, mediante el método 5'-RACE anidado. Los productos amplificados resultantes se clonaron en un vector de expresión de E. coli y las secuencias de los productos amplificados en los clones se determinaron mediante el método de Sanger. A efectos de eliminar un efecto de una mutación de secuencia que se produce a baja frecuencia por PCR, tales secuencias de bases de los clones se determinaron de forma independiente. Como resultado, se obtuvo una secuencia de 394 pb en el extremo 5' del ADNc de longitud completa. De manera similar, se intentó la amplificación del ADNc, incluido un sitio final de la traducción y un sitio de poliadenilación, mediante un método 3'-RACE anidado con el uso de polinucleótidos representados por la SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 como cebadores específicos de genes. A continuación, (i) se intentó la clonación del producto amplificado en un vector de E. coli y (ii) la determinación de las secuencias. Como resultado, se obtuvo una secuencia de 1247 pb en el extremo 3' del ADNc de longitud completa. En lo sucesivo, se obtuvo una secuencia de 1625 pb cuya secuencia estaba representada por la SEQ ID NO: 2 combinando la secuencia en el extremo 5' con la secuencia en el extremo 3' según la superposición de esas dos secuencias. La secuencia así obtenida se determinó como una secuencia de ADNc de longitud completa del gen A responsable de la partenocarpia.
<Análisis del nivel de expresión del gen A en cada sitio del cuerpo de la planta en cada etapa de desarrollo>
Tomando como base estos resultados, los fragmentos de ADN, cada uno de los cuales incluía la totalidad de los códigos de proteína del gen A, se clonó mediante PCR con el uso de los polinucleótidos representados por las SEQ ID NO: 43 y 44 como cebadores. Como plantilla de la PCR, se usó ADNc que se sintetizó a partir de ARN total de berenjena "Nakateshinkuro" con el uso del kit de síntesis de ADNc Transcriptor First Strand (Roche Diagnostics K.K.). Los fragmentos amplificados así obtenidos se digirieron por las enzimas Xmal y Sacl, y se insertaron en un sitio XmalSacl de un vector de clonación pUC19 (Takara Bio Inc.). Con respecto a los clones así obtenidos, se determinaron las secuencias de bases de dichos fragmentos insertados y se seleccionó un clon que no tenía una mutación en comparación con una secuencia de ADNc de longitud completa representada por la s Eq ID NO: 2. Una secuencia del clon está representada por la SEQ ID NO: 3.
Adicionalmente, el ARN se extrajo de los ovarios, extraídos de las yemas antes de la antesis (yemas en las 6 etapas correspondientes, es decir, yemas con longitudes correspondientes de 4 mm, 8 mm, 10 mm y 14 mm y yemas de 5 días y 2 días antes de la antesis) y de flores en la antesis, y frutos inmaduros en desarrollo (en 3 etapas de 3 días, 7 días y 14 días después de la antesis) de berenjena "Nakateshinkuro". Con el uso de dicho ARN como plantilla, el ADNc se sintetizó con el uso del kit de síntesis de ADNc Superscript VILO (Life Technologies Corporation). Con el uso de este ADNc como plantilla, se midió una cantidad de acumulación de ARNm del gen A mediante PCR cuantitativa con el uso de oligonucleótidos representados por las SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 como cebadores. El gen de expresión constitutiva de berenjena 20F01A, que se encontró exclusivamente por los inventores, se usó como un gen patrón interno para normalizar un valor cuantitativo. Se realizó un experimento con el uso de pares de cebadores representados por la SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48 como cebadores para amplificar el gen patrón interno. Asimismo, las cantidades de acumulación de ARNm se midieron de manera similar con respecto a una parte aérea y una raíz de un germen (28 días después de la siembra), una hoja madura y un tallo del cuerpo de una planta 3 meses después de la siembra, y anteras y pétalos de una yema (que tiene una yema de 14 mm de largo) antes de la antesis y una flor en la antesis del cultivar de berenjena "Nakateshinkuro". Los resultados de dicha determinación cuantitativa se ilustran en la figura 4. La figura 4 ilustra las cantidades de acumulación de ARNm del gen A de los sitios de "Nakateshinkuro" en diferentes etapas de desarrollo. Como está claro a partir de la figura 4, se aclaró que la expresión del gen A se incrementó en los ovarios a medida que se desarrollaban las yemas, después estuvo en el nivel más alto en la antesis y fue disminuyendo a medida que se desarrollaban los frutos. Como resultado, se confirmó que el gen A era un gen que se expresaba en patrones de expresión específicos para etapas de desarrollo de una flor de berenjena no partenocárpica general.
<Análisis detallado de la estructura del gen A y mutación de la línea PCSS>
Se aclaró por comparación entre el ADNc de longitud completa y una secuencia de ADN genómico que el gen A estaba formado por nueve exones y ocho intrones y tenía 6528 pb entre un sitio de inicio de la transcripción y un sitio de finalización de la transcripción. Esta secuencia está representada por la SEQ ID NO: 4. Adicionalmente, las secuencias del primer al noveno exón del gen A están representadas por la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, respectivamente. Por otra parte, las secuencias del primer al octavo intrones están representadas por la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20, respectivamente. Además, 2000 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción y 1000 bases cadena abajo del sitio de finalización de la transcripción están representadas por la SEQ ID NO: 22 y la SEQ ID NO: 23, respectivamente. Esas secuencias están integradas, y la secuencia resultante de 9.528 bases desde las 2000 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen A hasta las 1000 bases cadena abajo del sitio de finalización de la transcripción del gen A están representadas por la SEQ ID NO: 24 como una región del gen A. El número de la primera base de la secuencia es "1" y el número de la última base de la secuencia es "9528".
En un caso en el que se verificó la correspondencia entre (i) el gen A y (ii) una región de eliminación y una región de duplicación de la línea PCSS, se eliminó una región (una secuencia representada por la SEQ ID NO: 25) correspondiente a bases desde el nucleótido número 3963 de la SEQ ID NO: 24 hasta el nucleótido número 8520 de la SEQ ID NO: 24 en dicha una región del gen A de tipo mutante de la línea PCSS. Esta región es una región de 4558 pares de bases que incluye (i) todas las bases desde la base 45a en el cuarto intrón hasta el sitio de finalización de la traducción en el noveno exón y (ii) una región posterior no traducida de 235 bases en un extremo 3'. Por otra parte, se aclaró que una secuencia (SEQ ID NO: 26) de 227 pares de bases correspondientes a bases desde el nucleótido número 8599 de la SEQ ID n O: 24 hasta el nucleótido número 8825 de la SEQ ID NO: 24 estaba duplicada e insertada en lugar de la región de 4558 pares de bases cuya región se eliminó.
Por otra parte, una región de un gen de tipo silvestre cuya región varió desde un sitio de inicio del cuarto exón hasta 1000 pares de bases cadena abajo de un sitio de finalización de la transcripción, es decir, una secuencia de 5670 bases desde el nucleótido número 3859 hasta el nucleótido número 9528 de la SEQ ID NO: 24 se convirtió en, en la línea PCSS, una secuencia que tiene una estructura representada por la SEQ ID NO: 27 y que tiene una longitud de 1339 bases. Basándose en los resultados del análisis anterior, se creó un diagrama esquemático que ilustra una estructura del gen A y una estructura de mutación del gen A de la PSCC como se ilustra en la figura 5.
Como está claro a partir de la figura 5, se aclaró que el gen A de la línea PCSS tenía una gran mutación de estructura en comparación con el gen de tipo silvestre. Por consiguiente, se sugirió fuertemente que el ARNm normal y una proteína normal no se producían y, en consecuencia, se perdía por completo una función del gen A. En vista de esto, se realizaron los siguientes experimentos asumiendo que esta mutación por eliminación se atribuía a la partenocarpia.
<Búsqueda de mutación por eliminación del gen A en línea de germoplasma de berenjena>
Se realizó PCR con el uso de (i) como plantilla, el ADN total extraído aproximadamente de una planta por el método de Edwards (Bibliografía de referencia: Edwards et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 1349), que es un método de extracción de ADN muy conocido en este campo técnico y (ii) cuatro cebadores representados por las SEQ ID NO: 49 a 52. Según un tipo de eliminación, se amplificó una banda clara de aproximadamente 1 kpb. Según un tipo silvestre, se amplificó una banda clara de aproximadamente 700 pb. La presencia y ausencia de esta eliminación y un heterocigoto podrían determinarse claramente. Con el uso de este conjunto de cebadores, se comprobaron 269 elementos en líneas de germoplasma de berenjena recogidas de todo el mundo (de 269 elementos, 48 elementos eran especies silvestres afines o no identificadas) en términos de presencia y ausencia de la eliminación. Como resultado, no se encontró ninguna línea que tuviera tal eliminación. En vista de esto, se concluyó que la mutación por eliminación era una mutación natural que se produjo recientemente en el proceso de cruzamiento anterior.
<Análisis de la secuencia de aminoácidos deducida del producto del gen A y búsqueda de secuencia homóloga>
Una secuencia de aminoácidos deducida de una proteína (en lo sucesivo en el presente documento denominada proteína A) codificada por el gen A está representada por la SEQ ID NO: 1. En un caso en el que esta secuencia de aminoácidos se analizó realizando una búsqueda BLASt (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) a través de una base de datos RefSeq, se aclaró que la secuencia de aminoácidos tenía un nivel determinado de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de una transferasa de grupos amino dependiente del ácido piridoxal-5-fosfórico (PLP) (incluida una secuencia deducida mediante un estudio de desciframiento genómico) que se ha informado en varias especies. En vista de esto, se obtuvieron genes, cada uno de los cuales se esperaba, por búsqueda de identidad de secuencia, que codificara una proteína que tiene una alta identidad de secuencia con la proteína A a partir de bases de datos de genes de (i) tomate, (ii) S. pimpinellifolium, que es una especie afín al tomate, (iii) S. tuberosum phureja, que es patata, (iv) Capsicum annuum, que es pimiento, y (v) Malus x domestica, que es manzana.
Las secuencias que tenían la mayor identidad de secuencia con el gen A eran las siguientes. Es decir, en un caso de tomate, Solyc03g120450.1.1 (nombre del conjunto de datos: ITAG2.30, http://solgenomics.net) tenía la identidad de secuencia más alta con el gen A. En un caso de la especie afín al tomate S. pimpinellifolium, una parte homóloga (nombre del conjunto de datos: S. pimpinellifolium WGS Contigs, sitio web: http://solgenomics.net) tenía la identidad de secuencia más alta con el gen A. En un caso de patata, Sotub03g036610.1.1 (nombre del conjunto de datos: Potato ITAG Release 1, sitio web: http://solgenomics.net) tenía la identidad de secuencia más alta con el gen A. En un caso de pimiento, TC19330 (nombre del conjunto de datos: DFCI Pepper Gene Index ver. 4.0, bibliografía de referencia: Quackenbuch et al., 2001, Nucl. Acid. Res. 29: 159-164, sitio web: http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html) tenía la identidad de secuencia más alta con el gen A. En un caso de manzana, MDP0000310976 (nombre del conjunto de datos: Malus x domestica Genome v1.0, bibliografía de referencia: Velasco et al., 2010, Nature Genetics 42: 833-839, sitio web: http://www.rosaceae.org) tenía la identidad de secuencia más alta con el gen A. Una secuencia de bases de una región codificante de un gen derivado de tomate está representada por la SEQ ID NO: 29, y una secuencia de aminoácidos deducida del gen el gen derivado de tomate está representado por la SEQ ID NO: 28. Una secuencia de bases de una región codificante de un gen derivado de la especie S. pimpinellifolium afín al tomate está representada por la SEQ ID NO: 31, y una secuencia de aminoácidos deducida del gen derivado de la especie S. pimpinellifolium afín al tomate está representada por la SEQ ID NO: 30. Una secuencia de bases de una región codificante de un gen derivado de patata está representada por la SEQ ID NO: 33, y una secuencia de aminoácidos deducida del gen derivado de patata está representada por la SEQ ID NO: 32. Una secuencia de bases de una región codificante de un gen derivado de pimiento está representada por la SEQ ID NO: 35, y una secuencia de aminoácidos deducida del gen derivado de pimiento está representada por la SEQ ID NO: 34. Una secuencia de bases de una región codificante de un gen derivado de manzana está representada por la SEQ ID NO: 37, y una secuencia de aminoácidos deducida del gen derivado de manzana está representada por la SEQ ID NO: 36.
La identidad de secuencia de cada una de las secuencias de aminoácidos deducidas con la proteína A de berenjena fue la siguiente. Es decir, en el caso del gen derivado del tomate, la secuencia de aminoácidos deducida tenía una identidad de secuencia del 94,9 % con la proteína A. En el caso del gen derivado de la especie afín al tomate S. pimpinellifolium, la secuencia de aminoácidos deducida tenía una identidad de secuencia del 94,9 % con la proteína A. En el caso del gen derivado de patata, la secuencia de aminoácidos deducida tenía una identidad de secuencia del 95,7 % con la proteína A. En el caso del gen derivado de pimiento, la secuencia de aminoácidos deducida tenía una identidad de secuencia del 90,1 % con la proteína A. En el caso del gen derivado de manzana, la secuencia de aminoácidos deducida tenía una identidad de secuencia del 80,5 % con la proteína A. Según Arabidopsis, ninguna secuencia de aminoácidos deducida tenía una identidad de secuencia del 70 % o más con la proteína A.
<Análisis de la estructura del transcrito del gen A en PCSS>
Se analizó una estructura de un transcrito del gen A de tipo mutante mediante el método 5'-RACE anidado y el método 3'-RACE anidado con el uso de (i) ARN total extraído de un ovario de la línea PCSS y ( ii) cebadores representados por la SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 42 como en el caso de los métodos anteriores. Como resultado, se aclara lo siguiente. Es decir, un sitio de corte y empalme entre el cuarto exón y el cuarto intrón era normal, pero un sitio final del cuarto intrón estaba cadena abajo de un sitio de finalización de la transcripción de un gen de tipo normal. En consecuencia, un transcrito de tipo PCSS era completamente diferente del producto génico de tipo normal en términos de secuencias en el cuarto exón y después del mismo en un extremo 3'. Asimismo, el transcrito de tipo PCSS tenía
un gran número de codones de terminación de la traducción cuyos marcos de lectura no habían cambiado. Una secuencia de aminoácidos deducida de una proteína traducida del transcrito de tipo PCSS está representada por la SEQ ID NO: 38. (Obsérvese que la secuencia completa de la secuencia de aminoácidos representada por la s Eq ID NO: 38 es
MGSFGMLARRAVLTDTPVMVQIQELIRGNKDCISLAQGVVYWQPPAQALEKV
KEIIWEPSVSRYGADEGLPELREALMQKLGHENNLHKSSVMVTAGANQVNEG
VQLKVNCLGNYMPLHTYYEERKFSNLSFN*AYGSNYKISSYCP*KIHGCMHCT
TAKAAGSETRSADRFQHGNPQGEEQESSTYFLCGEEMPASA'GCHKSMLQH
FKWRLP*RYQSPKEEEDHSSWKQLNKCV*SDHFSRL*SVSISSQVTTKE*P*SQ
LLRQEVP*TTRKDKRNQRFSKKRHS*ESYL*CGTININKVGRHRH*F*SKGSTTM
QSICL*YI*EFTGCGAN*KAAIKFHGNAPARYHTKYAGNPCRLDCGGKLVFIPN.
El signo en la secuencia indica una señal de terminación de la traducción dada por un codón de terminación.) Estos resultados sugieren fuertemente que, según la línea PCSS, (i) el transcrito del gen A tenía una estructura muy diferente a la del gen de tipo normal, (ii) una proteína A de tipo mutante traducida a partir del transcrito del gen A tenía estructuralmente un gran déficit en comparación con una proteína de tipo normal, y (iii) por lo tanto, se había perdido por completo una función de la proteína A.
<Aislamiento del promotor del gen A>
A partir de una secuencia del clon BAC 08K19, fue posible obtener una secuencia de una región cadena arriba de la secuencia de ADNc de gen A de longitud completa. Se dedujo que una secuencia genómica de la región cadena arriba era una región promotora relacionada con el control de la expresión del gen A. En vista de esto, se sintetizaron cebadores de PCR (SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54) que amplifican la región promotora, la PCR se realizó con el uso de (i) los cebadores de PCR y (ii) como plantilla, el ADN genómico del cultivar de berenjena "Nakateshinkuro", y después se amplificó un fragmento de 2173 pares de bases representado por la SEQ ID NO: 55. El fragmento incluía, en su extremo 3', (i) una región no traducida del extremo 5' de 197 pares de bases de la secuencia de ADNc de longitud completa y (ii) una región codificante de proteínas de 26 pares de bases. Puesto que es una ADN polimerasa resistente al calor se utilizó KOD-plus-NEO (Toyobo Co., Ltd.), que es una ADN polimerasa resistente al calor que tiene una fuerte actividad exonucleasa 3'-5', en la PCR, ambos extremos de un fragmento amplificado resultante eran extremos alineados. Después, un producto de PCR resultante se digirió con Xmal, que es isosquizómero de Smal, para preparar un fragmento cuyo extremo 5' era un extremo alineado y cuyo extremo 3' era un extremo adherente de tipo protuberante 5' debido a Xmal. Al mismo tiempo, pUC198AA-CGN se digirió con Hindll, se provocó que tuviera extremos alineados con el uso de una ADN polimerasa KOD (Toyobo Co., Ltd.) y después se digirió adicionalmente con Xmal. Obsérvese que pUC198AA-CGN es un vector obtenido mediante la introducción de pBI221 (DDBJ/GenBank/EMBL n.° de registro AF502128) promotor CaMV35S::GUS::casete de terminación NOS a un sitio Hindll-EcoRI de un vector de clonación pUC198AA (bibliografía de referencia:
Kuroda et al., 2010, Biosci. Biotechnol. Biochem. 74: 2348-2351). Por tanto, se cortó un fragmento del promotor CaMV35S de pUC198AA-CGN, y el fragmento amplificado anterior se insertó en la parte de pUC198AA-CGN de la que se había eliminado el fragmento del promotor CaMV35S. Un plásmido recombinante resultante se transformó en E. coli y el plásmido recombinante se extrajo de una colonia resultante. Se comprobó una secuencia de bases del plásmido recombinante para seleccionar un clon que no tuviera una mutación de secuencia provocada por la amplificación por PCR. La región promotora (en lo sucesivo en el presente documento denominada promotor A) del gen A se clonó así y se usó para la siguiente construcción de plásmido recombinante. Una estructura de un vector resultante (en lo sucesivo en el presente documento, denominado pUC198AA-PgeneAGN) se ilustra en (a) de la figura 6. Obsérvese que, en vistas esquemáticas de vectores en la figura 6, la región del promotor A se muestra como Pgene_A. Adicionalmente, en vistas esquemáticas de vectores en las figuras 6 y 13, una región terminadora NOS se muestra como Tnos, un promotor NOS se muestra como Pnos, y una región promotora CaMV35S se muestra como P35S.
(3. Producción de transformante de berenjena partenocárpica por mutación del gen A)
<Construcción de vector para inducir ARNi (ARN de interferencia) del gen A>
Un fragmento de ADN, representado por la SEQ ID NO: 58, de 522 pb se obtuvo con el uso de (i) ADNc, representado por la SEQ ID NO: 3, del gen A como plantilla y (ii) cebadores representados respectivamente por la SEQ ID NO: 56
y la SEQ ID NO: 57. Este fragmento tenía (i) un sitio de reconocimiento Xmal y un sitio de reconocimiento Hindll en su extremo 5' y (ii) un sitio de reconocimiento Sacl y un sitio de reconocimiento XhiO en su extremo 3'. El fragmento se insertó en un vector de clonación pTY262 (DDBJ/Gen-Bank/EMBL n.° de registro AB736152) para construir un gen quimérico de inducción de ARNi para el gen A. Este vector pTY262 tiene un casete de expresión que incluye un promotor CaMV35S y un terminador NOS. En el vector pTY262, los sitios de clonación de una secuencia exógena están dispuestos de forma que intercalan el primer intrón de un gen de tubulina de tomate.
En primer lugar, el fragmento de 522 pb (SEQ ID NO: 58) se digirió con HindlII y Sacl, y después se insertó delante del terminador NOS. Después, un vector resultante se digirió con Xhol, se provocó que tuviera extremos romos con el uso de una ADN polimerasa KOD (Toyobo Co., Ltd.) y después se digirió con Xmal. El fragmento de 522 pb se digirió con Sacl, de manera similar se provocó que tuviera extremos alineados con el uso de una ADN polimerasa KOD (Toyobo Co., Ltd.), y después se digirió con Xmal. A continuación, se insertó el fragmento de 522 pb delante del promotor CaMV35S del vector lineal anterior. Un gen quimérico de inducción de ARNi resultante tenía una estructura en la que el fragmento sustancialmente completo de 522 pb representado por la SEQ ID NO: 58 se dispuso en una secuencia de repetición invertida en la que se insertó el primer intrón del gen de tubulina de tomate. La expresión del gen quimérico de inducción de ARNi se indujo por el promotor CaMV35S que induce la expresión constitutiva de plantas generales (véase (b) de la figura 6). Obsérvese que, en la vista esquemática de los vectores en la figura 6, el fragmento de ADN de 522 pb del gen A se muestra como RNAi-A. Obsérvese también que, en las vistas esquemáticas de los vectores en las figuras 6 y 13, una región del primer intrón de un gen de tubulina de tomate se muestra como TUA6_intron. A continuación, la secuencia de repetición invertida completa de este vector pTY262-CgeneA-RNAiN después (i) se digirió con una enzima de restricción Kpnl, (ii) se provocó que tuviera extremos alineados, (iii) se cortó mediante un proceso con Sacl, y (iv) se insertó en un sitio del que se cortó un gen GUS del vector pUC198AA-PgeneAGN mediante un proceso con Smal y un proceso con Sacl. Así se construyó un gen quimérico de inducción de ARNi. Un gen quimérico de inducción de ARNi resultante pUC198AA-PgeneA-RNAiN tenía una secuencia de repetición invertida idéntica, en estructura, a la del vector pTY262-CgeneA-RNAiN. La expresión del gen quimérico de inducción de ARNi pUC198AA-PgeneA-RNAiN se indujo mediante el promotor A (véase (c) de la figura 6). Este gen quimérico se cortó mediante una enzima de restricción Ascl y se insertó en un sitio de reconocimiento de Ascl de un vector binario pZK3BGFP que se había construido de forma exclusiva introduciendo un promotor CaMV35S::sGFP::casete de expresión del terminador NOS (Bibliografía de referencia: Chiu et al., 1993, Curr. Biol. 6: 325-330) en un vector binario pZK3 (Bibliografía de referencia: Kuroda et al., 2010, Biosci. Biotechnol. Biochem. 74: 2348-2351). De este modo se construyó un vector binario pZK3BGFP-PgeneA-RNAiN (véase (d) de la figura 6).
< Producción de transformante de berenjena mediante ARNi>
Se produjo un transformante de berenjena al que se introdujo el vector binario para la interferencia con ARNi. Un método concreto para producir el transformante de berenjena fue el siguiente. En primer lugar, con el método con Agrobacterium (Bibliografía de referencia: Billings, S et al., 1997, J Amer. Hort. Sci 122: 158-162), un cotiledón del cultivar de berenjena "Nakateshinkuro" se infectó con Agrobacterium que tenía un vector binario, se cultivó en un medio que contenía kanamicina y se seleccionó. Se obtuvo así una planta rediferenciada. Se evaluó si la transferencia génica de la planta rediferenciada tuvo éxito o no mediante la expresión de fluorescencia mediante un gen marcador GFP y comprobando mediante PCR de un transgén, y se obtuvo una planta transgénica en la generación original de transformación. Asimismo, entre la primera generación autofecundada de la planta transgénica, (i) un individuo que tenía un transgén como homocigoto y (ii) un individuo que no tenía transgén debido a la segregación genética se seleccionaron por PCR cuantitativa.
<Estudio de partenocarpia de transformante de berenjena>
Se cultivó un individuo (12012-1_homozygote) que era del transformante de berenjena y se había seleccionado como se indica anteriormente, y se comprobó su partenocarpia observando el crecimiento (agrandamiento) de un ovario, cuyo estigma se había eliminado antes de la antesis, a un fruto. De manera simultánea, (i) un cultivar original "Nakateshinkuro" (control) que no era transformante y (ii) un individuo (12012-1_null) que había derivado de un transformante, pero perdió un transgén por segregación genética, se cultivaron y se observaron, como controles, en términos de crecimiento (agrandamiento) de un fruto que se había sometido a un tratamiento similar y a polinización abierta normal. La figura 7 muestra los resultados de esto. Como se muestra en la figura 7, incluso en el caso de que se hubiera evitado la polinización eliminando el estigma antes de la antesis, el fruto del individuo 12012-1_homozygote que era un transformante que tenía un transgén como homocigoto mostró un crecimiento evidente (agrandamiento), y por lo tanto mostró partenocarpia ((a) de la figura 7). Por otra parte, se confirmó que no se formaron semillas en el individuo 12012-1_homozygote porque el 12012-1_homozygote no se polinizó ((d) de la figura 7). Por otro lado, en el individuo 12012-1_null ((b) de la figura 7), el fruto apenas se agrandó, como ocurrió con el control ((c) de la figura 7). Con respecto al individuo 12012-1_null y el control, (e) y (f) de la figura 7 muestran respectivamente estados de frutos que no estaban lo suficientemente agrandados debido a la falta de polinización.
Se extrajeron todos los ARN, en la antesis, de ovarios del transformante de berenjena (individuo 12012-1_homozygote), el no transformante (control) del cultivar original "Nakateshinkuro" y el individuo (12012-1_null) que había perdido un transgén, y se sintetizó ADNc con el uso de del kit de síntesis de ADNc Superscript VILO (Life Technologies Corporation), utilizando todos los ARN como plantillas. Utilizando el ADNc obtenido como plantilla, se
midió una cantidad de acumulación de ARNm del gen A mediante PCR cuantitativa con el uso de, como cebadores, oligonucleótidos representados por la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO: 46, respectivamente. La figura 8 muestra los resultados de esto. Como se muestra en la figura 8, en el transformante (12012-1_homozygote), la expresión del gen A en el ovario en la antesis se inhibió en gran medida. Por otra parte, el individuo 12012-1_null que había perdido el transgén y no mostraba partenocarpia en absoluto tenía un nivel de expresión del gen A que era sustancialmente idéntico al del control (no transformante), así como con el estado de crecimiento (agrandamiento) del fruto.
A partir de los resultados anteriores, se aclaró que la partenocarpia se inducía en berenjena mediante la inhibición de la expresión del gen A.
(4. Determinación cuantitativa de la concentración de ácido indol acético (IAA) y la concentración de metabolitos de IAA en la línea de berenjena partenocárpica PCSS)
<Determinación cuantitativa de la concentración de ácido indol acético (IAA) y la concentración de metabolitos de IAA en la línea de berenjena partenocárpica PCSS, mediante análisis LC/MS/MS>
Para determinar cuantitativamente una cantidad de IAA y una cantidad de metabolitos de IAA en la línea de berenjena partenocárpica PCSS, el análisis LC/MS/MS se realizó en la línea PCSS sirviendo como material experimental.
En el caso de que se realice un análisis LC/MS/MS en un metabolito de auxina o similar mientras se usa Arabidopsis como material, se extrae un extracto del cuerpo de una planta con el uso de un tampón de fosfato de sodio. Se dice que el metabolito de auxina o similar se puede analizar mientras se usa una solución, en la que el extracto se purifica mediante una columna OASIS HLB (Nihon Waters K.K.), como muestra (Bibliografía de referencia: Novak et al., 2012, Plant Journal. 72: 523-536). Sin embargo, en un caso en que se utilizó un ovario de berenjena, fue muy difícil realizar, con el uso de LC/MS/MS, el análisis de una muestra obtenida por el método de purificación anterior, debido a la influencia de la supresión de iones por impurezas. En estas circunstancias, un eluato por OASIS HLB se separó en (i) una fracción mixta de una sustancia ácida y una sustancia neutra y (ii) una fracción de sustancia básica por una columna OASIS MCX (Nihon Waters K.K.). Adicionalmente, la fracción mixta obtenida de una sustancia ácida y una sustancia neutra se separó en la sustancia ácida y la sustancia neutra mediante una columna OASIS WAX (Nihon Waters K.K.), y las muestras así obtenidas se sometieron a análisis LC/MS/MS. Mediante el uso de las muestras purificadas por el método de purificación, fue posible realizar análisis LC/MS/MS sobre el ácido indol acético (IAA) que era una sustancia activa que se encontraba en cada una de las muestras. Por otra parte, por este método de análisis, fue posible realizar análisis LC/MS/MS sobre una pequeña cantidad de una muestra que se obtuvo de un ovario de berenjena. Al mismo tiempo, un ácido indolpirúvico (IPyA) que es un precursor de IAA era una sustancia altamente inestable y, por lo tanto, se derivatizó un extracto con cisteamina y se analizó después de la purificación mediante OASIS HLB. La sustancia purificada así obtenida se analizó mediante LC/MS/MS (espectrómetro de masas) (3200 QTRAP, AB SCIEX). La separación por HPLC de LC/MS/MS se realizó mediante una columna Shim-pack XR-ODS (Shimadzu Corporation) y la sustancia separada se ionizó por ESI (ionización por pulverización de electrones) y se introdujo en MS/MS. A continuación, se realizó la detección de iones moleculares y fragmentos de iones generados en un modo MRM (monitorización de reacciones múltiples).
Con respecto a los ovarios y anteras de yemas (de aproximadamente 5 días antes de la antesis, antes de la coloración de los pétalos y aproximadamente 2 días antes de la antesis, en la coloración de los pétalos) de la línea de berenjena partenocárpica PCSS y un ovario, una antera, un entrenudo y un ápice de brote de la línea PCSS en la antesis, las concentraciones de IAA endógeno se midieron realizando un análisis cuantitativo por el método descrito anteriormente. Por otra parte, a efectos de comparación, una línea autofecundada NP de berenjena no partenocárpica se midió de manera similar como control. La línea autofecundada NP de la berenjena no partenocárpica era una línea no partenocárpica obtenida mediante una combinación de cruzamientos idéntica a la de la línea PCSS. La figura 9 muestra los resultados. Como se muestra en la figura 9, no se observó ninguna diferencia en la cantidad de IAA endógeno entre la línea PCSS y la línea NP en el ápice del brote ni en el entrenudo.
Al mismo tiempo, en el ovario y la antera, se observaron concentraciones endógenas de IAA que eran aproximadamente de 2,6 a 4,6 veces más altas que las de la línea NP en la línea PCSS en todas las etapas de desarrollo medidas (es decir, antes de la coloración de los pétalos, en la coloración de los pétalos y en la antesis).
Adicionalmente, un ovario de la línea PCSS en la antesis se analizó en términos de metabolitos de IAA y similares mediante un método similar. La figura 10 muestra los resultados de esto. Se aclaró que IPyA e IAA se acumulaban en la línea PCSS con una concentración notablemente alta, en comparación con la línea NP. Al mismo tiempo, la línea PCSS y la línea NP no fueron notablemente diferentes entre sí en términos de acumulación de IAM, TAM, oxIAA, lAAsp y lAGIu, cada uno de los cuales era un producto intermedio en otra vía de síntesis de IAA o un metabolito de IAA.
<Determinación cuantitativa de la concentración de ácido indol acético (IAA) en la línea de berenjena transgénica inhibida por el gen A 12012-1_homozygote, mediante análisis LC/MS/MS>
Después, se extrajo IAA de un ovario de una línea de berenjena transgénica inhibida con el gen A 120121_homozygote, y se realizó un análisis cuantitativo con un método similar al que se utilizó en el caso de la línea PCSS. La figura 11 muestra los resultados. Como resultado, como se muestra en la Figura 11, se observó una concentración de AIA endógeno, que fue aproximadamente 4 veces en promedio mayor que la del no transformante (cultivar "Nakateshinkuro"), en un ovario de un transformante de berenjena en el que se inhibió la expresión del gen A.
A partir de los resultados anteriores, se sugirió que el gen A partenocárpico codificaba una transferasa de grupos amino. Adicionalmente, se sugirió que la transferasa de grupos amino era una transferasa de grupos amino que tenía una actividad enzimática similar a la de VAS1 de Arabidopsis para sintetizar triptófano mientras se usaba IPyA como sustancia base. Adicionalmente, se sugirió encarecidamente que (i) la concentración de AIA endógeno podría aumentarse en un órgano floral de un producto solanáceo hasta un nivel en el que se induzca la partenocarpia práctica, inhibiendo la expresión del gen y (ii) en consecuencia, una planta solanácea que comprende tomate y berenjena mostró partenocarpia.
(5. Medición de la actividad de la proteína A codificada por el gen A)
<Análisis de la función de la proteína A codificada por el gen A, con uso de proteína transgénica expresada transitoriamente en especies silvestres de tabaco>
Se añadió un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 69) formado por 24 bases delante de un codón de terminación de una secuencia de ADNc del gen A para que no se cambiara un marco de lectura, y así se construyó un gen quimérico a partir del cual se produce un producto génico en el que una secuencia Strep-tag II, es decir, Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys (Bibliografía de referencia: Schmidt et al., 1996, J. Mol. Biol. 255: 753-766) se añade a un extremo C de la proteína A codificada por el gen A. Se produjo una construcción de expresión sustituyendo este gen con un gen GUS de pUC198AA-CGN, y además se produjo un vector binario de transformación introduciendo la construcción de expresión en un vector binario pZK3BGFP. Se inyectó una suspensión de Agrobacterium que conservaba el vector en el interior del tejido de una hoja a través de los estomas de una hoja desdoblada de Nicotiana benthamiana (que es una especie silvestre de tabaco) de manera que el gen se expresara transitoriamente en la hoja de tabaco y, por lo tanto, se sintetizó la proteína A transgénica que tenía la secuencia Streptag en el extremo C. Al tercer día del tratamiento de inyección, se extrajo una proteína cruda de la hoja tratada con un tampón de ácido fosfórico, y la proteína A transgénica se purificó por cromatografía con el uso de la columna Strep-Tactin Sepharose (IBA GmbH). Por otra parte, como control, se construyó un gen GUS en el que se añadió una secuencia Strep-tag II a un extremo C de un gen GUS derivado de E. coli, y se purificó una proteína GUS transgénica con procedimientos similares.
A cada una de las soluciones de las correspondientes proteínas así obtenidas (2 mg/ml), se añadieron una solución mixta de aminoácidos (Arg, Gln, Cys, Asp, Gly, Met, Phe y Glu) (concentración de cada aminoácido en la solución: 5 mM), fosfato de piridoxal e IPyA (500 mM) y cada una de las mezclas se hizo reaccionar en un tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,4) a 30 °C durante 2 horas. A continuación, cada una de las soluciones de reacción se purificó mediante una columna OASIS HLB y se analizó con el uso de LC/MS/MS. Los resultados se muestran en la figura 12. Como se muestra en (a) de la figura 12, se produjo triptófano en función de la proteína A transgénica. Obsérvese que no se detectó triptófano en un caso en el que se utilizó la proteína GUS transgénica (véase (b) de la figura 12). A partir de esto, está claro que la producción de triptófano a partir del tejido de la hoja de N. benthamiana (especie silvestre de tabaco) de la que se extrajo la proteína no supera un límite de detección.
A partir de los resultados anteriores, se confirmó que la proteína A codificada por el gen A era una transferasa de grupos amino que cataliza la reacción para sintetizar triptófano utilizando IPyA y aminoácidos como sustratos.
[Ejemplo 2: Gen tA partenocárpico derivado de tomate]
(1. Identificación y análisis del gen tA responsable de la partenocarpia derivado de tomate)
<Preparación de fragmento de ADNc de tomate homólogo del gen A de berenjena>
Realizando una búsqueda BLASTP en la base de datos de secuencias de aminoácidos deducidas (nombre de la base de datos: ITAG2.30, página web http://www.solgenomics.net) de genes estructurales deducidos de una secuencia genómica de tomate (Bibliografía de referencia: The Tomato Genome Consortium 2012, Nature 485: 635-641) estableciendo una secuencia de aminoácidos deducida de la proteína A como secuencia de consulta, se obtuvo un gen tA homólogo de tomate que se dedujo que codificaba una proteína que tiene una identidad de secuencia del 95 % con respecto al gen A. El gen tA homólogo de tomate tenía una secuencia de bases que era la secuencia representada por la SEQ ID NO: 29 descrita en <Análisis de la secuencia de aminoácidos deducida del producto del gen A y búsqueda de la secuencia homóloga> anterior. Basándose en la secuencia de bases, se sintetizó un par de cebadores (SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60) para amplificar una parte de la secuencia de bases. De todos los ARN extraídos de una flor y una yema de un cultivar de tomate "Shugyoku", el ADNc se sintetizó con el uso de un kit de síntesis de ADNc de la primera cadena transcriptora (Roche Diagnostics K.K.) Al usar el ADNc como plantilla, se realizó PCR con el uso del par de cebadores, y así se obtuvo un fragmento de ADN de 523 pb representado por la SEQ ID NO: 61. En el fragmento, (i) se añade un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción Xmal y una enzima de restricción Clal al extremo 5' de una secuencia derivada de ADNc de 496 pb y (ii) se añade un sitio de reconocimiento para una
enzima de restricción Sacl y una enzima de restricción Xhol añadido a un extremo 3' de la secuencia derivada de ADNc. El fragmento se trató con Clal y Sacl y después se introdujo en pTY262, y el fragmento descrito anteriormente se trató con Xhol y Xmal y después se introdujo en un plásmido del pTY262. Por lo tanto, se construyó un gen quimérico de inducción de ARNi que tenía una estructura de secuencia de repetición invertida. La ausencia de mutación de la secuencia de bases del fragmento introducido se confirmó mediante secuenciación y, por lo tanto, se seleccionó un clon que tenía una secuencia correcta. En la figura 13(a) se ilustra una estructura de este vector pTY262-Cgene_tA-RNAiN. El vector pTY262-Cgene_tA-RNAiN se trata adicionalmente con Ascl, y se insertó un casete de expresión de un gen tA recortado en un sitio Ascl de pZK3BGFP. En la figura 13(b) se ilustra una estructura de un vector binario pZK3BGFP-CtARNAiN así obtenido. Obsérvese que, en las vistas esquemáticas de vectores en la figura 13, el fragmento de ADN de 523 pb en el gen tA se indica con "RNAi-tA".
<Aislamiento del promotor del gen tA homólogo de tomate>
Con referencia a una secuencia genómica de tomate, se amplificaron 1908 pares de bases de un fragmento genómico (SEQ ID NO: 62) que incluye 1870 pb en una parte cadena arriba de un sitio de inicio de la traducción del gen tA y 29 pb de una región codificante de proteínas cadena abajo del sitio de inicio de la traducción a partir de un ADN genómico del cultivar de tomate "Shugyoku" con el uso de un par de cebadores representados por la SEQ ID NO: 63 y la SEQ ID NO: 64. En la reacción de PCR se usó KOD-plus-NEO (Toyobo Co., Ltd.), que es ADN polimerasa resistente al calor con una fuerte actividad de exonucleasa 3'-5' y, por lo tanto, ambos extremos del fragmento amplificado eran extremos alineados. Por otra parte, el fragmento tenía un sitio de reconocimiento de Xmal derivado del cebador (SEQ ID NO: 64) en el extremo 3'. Un vector de clonación pHSG398 (Takara Bio Inc.) (i) se trató con una enzima de restricción BamHI, (ii) se preparó para tener extremos alineados con el uso de ADN polimerasa KOD (Toyobo Co., Ltd.), (iii) se mezcló con el fragmento anterior, (iv) se trató con una enzima de restricción Xmal, y después (v) se unió con el uso de ADN ligasa de T4 (Promega Corporation), y (vi) se introdujo en E. coli. Por lo tanto, se clonó una región promotora (en lo sucesivo en el presente documento denominada "promotor tA") del gen tA homólogo de tomate. Adicionalmente, se seleccionó por secuenciación un clon pHSG398-PtA que no tenía mutación. La figura 13(c) ilustra una estructura del clon pHSG398-PtA. Obsérvese que, en las vistas esquemáticas de vectores en la figura 13, una región del promotor tA está indicada por "Pgene_tA". Adicionalmente, el pHSG398-PtA se trató con Smal y Xbal y se cortó un fragmento del promotor tA. A continuación, un casete de expresión en una estructura de un plásmido pTY262-Pgene_tA-RNAiN, en el que el fragmento del promotor tA cortado se sustituyó con un promotor CaMV35S del pTY262-Cgene_tA-RNAiN, se insertó en un sitio Ascl de pZK3BGFP. En la figura 13(d) se ilustra una estructura del vector binario pZK3BGFP-PtARNAiN así obtenido.
<Producción de transformante de tomate en el que se inhibe la expresión del gen tA, mediante ARNi>
Con el uso de los vectores binarios pZK3BGFP-PtARNAiN y pZK3BGFP-CtARNAiN construidos mediante los procedimientos anteriores, se produjo un transformante de tomate con un método con Agrobacterium. De manera específica, con el uso del método con Agrobacterium (Bibliografía de referencia: Sun et al., 2006, Plant Cell Physiol.
47: 426-431), se infectó un cotiledón de un cultivo de tomate "Ailsa Craig" con Agrobacterium que tenía un vector binario y se cultivó en un medio que contenía kanamicina. A continuación, se realizó la selección y así se obtuvo una planta rediferenciada. Se evaluó si la transferencia génica de la planta rediferenciada tuvo éxito o no mediante la expresión de fluorescencia mediante un gen marcador GFP y comprobando mediante PCR de un transgén, y se obtuvo una planta transgénica en la generación original de transformación.
<Estudio de partenocarpia de transformante de tomate>
Se cultivó un individuo del transformante de tomate obtenido por la selección anterior, se eliminó un estigma del individuo antes de la antesis y se comprobó la partenocarpia del individuo. Por otra parte, simultáneamente se cultivó un no transformante (control) de un cultivar original de tomate "Ailsa Craig", y se eliminó de manera similar un estigma del mismo. Por lo tanto, el no transformante se usó como control. Adicionalmente, con respecto al transformante de tomate, se observó un estado de crecimiento/maduración de un fruto que se había sometido a polinización abierta normal. La figura 14 muestra los resultados de esto. Como se muestra en la figura 14, una fruto agrandada no se formó en absoluto a partir del cultivar de tomate "Ailsa Craig", es decir, el no transformante del que se había eliminado el estigma. Por otro lado, con respecto al transformante (individuo n.° 1220-4) en el que se inhibió la expresión del gen tA mediante la inducción de ARNi con el uso del promotor CaMV35S, el fruto al que se le quitó el estigma se agrandó de manera similar a un fruto que se había sometido a polinización abierta y había formado semillas, y así se obtuvo un fruto maduro sin semilla. Por otra parte, también con respecto al caso (individuo n.° 0716-18) donde se utilizó un promotor del gen tA, el fruto sin estigma se agrandó (es decir, creció) y, por lo tanto, se convirtió en un fruto maduro. Lo anterior aclaró que se le puede proporcionar partenocarpia al tomate induciendo artificialmente la inhibición de la expresión del gen tA.
Todos los ARN se extrajeron de yemas florales del transformante de tomate (individuo n.° 1220-4) y del no transformante (control) del cultivar original "Ailsa Craig" antes de la antesis, y el ADNc se sintetizó con el uso del kit de síntesis de ADNc Superscript VILO (Life Technologies Corporation), utilizando todos los ARN como plantillas. Utilizando el ADNc obtenido como plantilla, se midió una cantidad de acumulación de ARNm del gen tA mediante PCR cuantitativa con el uso de, como cebadores, oligonucleótidos representados por la SEQ ID NO: 65 y la SEQ ID NO:
66. Para normalizar los valores cuantitativos, también se realizó la determinación cuantitativa de un gen patrón interno utilizando de manera similar el ADNc como plantilla. Como el gen patrón interno, se utilizó un gen de tomate Solyc04g049180.2.1 (nombre del conjunto de datos: ITAG2.30, sitio web: http://solgenomics.net). Este gen es un gen que los inventores descubrieron que se expresaba constitutivamente en tomate. Adicionalmente, como cebadores para amplificar el gen patrón interno, se utilizaron cebadores representados por la SEQ ID NO: 67 y la SEQ ID NO: 68. La figura 15 muestra los resultados de esto. Como se muestra en la figura 15, se confirmó que, en el transformante, la expresión del gen tA en la yema floral antes de la antesis se inhibió en gran medida, en comparación con el no transformante del cultivar original Ailsa Craig.
<Determinación cuantitativa de la concentración de ácido indol acético (IAA) en la línea de tomate transgénico 1220 4 con el gen tA inhibido, mediante análisis LC/MS/MS>
Después, se extrajo IAA de una yema floral de un transformante 1220-4 de tomate con el gen tA inhibido y se realizó un análisis cuantitativo. Obsérvese que la extracción, la purificación y el análisis de lAA se realizaron con métodos similares a los del caso de la berenjena en el ejemplo 1 anterior. La figura 16 muestra los resultados de esto. En el transformante inhibido, se observó una concentración de IAA endógeno que era aproximadamente 3 veces mayor que la del no transformante (cultivar "Ailsa Craig").
Del resultado anterior, se aclaró que la partenocarpia también se inducía en tomate mediante la inhibición de la expresión del gen tA de tomate, que es un homólogo del gen A partenocárpico de berenjena.
[Ejemplo 3: Gen pA responsable de la partenocarpia derivado de pimiento]
(1. Identificación y análisis del gen pA responsable de la partenocarpia derivado de pimiento)
<Producción del mutante deficiente en la función del gen pA mediante tratamiento con EMS
Como se describe en <Análisis de la secuencia de aminoácidos deducida del producto del gen A y búsqueda de la secuencia homóloga> del ejemplo 1 anterior, TC19330 (nombre del conjunto de datos: DFCI Pepper Gene Index ver.
4.0, Bibliografía de referencia: Quackenbuch et al. (2001) Nucl. Acid. Res. 29: 159-164, sitio web http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html) se encontró un gen homólogo de pimiento (SEQ ID NO: 35) que tiene la identidad de secuencia más alta con respecto al gen A. En lo sucesivo en el presente documento, este gen se denomina "gen pA". El tratamiento de inducción de mutaciones se realizó sumergiendo una semilla (cultivar "Maor") de pimiento (Capsicum annuum) en una solución acuosa de EMS (sulfonato de etil metano) que es un mutágeno químico de uso general, y así se indujo una mutación artificial del gen pA. A continuación, se realizó la exploración del mutante. La exploración se realizó con el método de punto clave (Bibliografía de referencia: Rigola et al., 2009, PLoS One 4: e4761.) En el método de punto clave, se siembran semillas en la generación original del tratamiento de inducción de mutaciones y, con el uso de una muestra de ADN extraída de un cuerpo vegetal injertado, una muestra en la que se mezcló multidimensionalmente el ADN genómico de una pluralidad de muestras se analizó mediante un secuenciador de segunda generación para detectar una mutación, y así se busca un individuo que tiene una mutación en una región codificante del gen pA. Como resultado, se descubrieron un mutante 1 y un mutante 2, cada uno de los cuales tenía una denominada mutación sin sentido (es decir, se provocó un codón de terminación con un marco de lectura sin cambios) en la región codificante del gen pA. En comparación con una secuencia de tipo silvestre de SEQ ID NO: 35, la base 125a en el mutante 1 se mutó de G a A, y el codón 42° se mutó de TGG que codifica Trp a un codón de terminación TAG. Por otra parte, en el mutante 2, la base 127a se mutó de C a T, y el codón 43° se mutó de CAA que codifica Gln a un codón de terminación TAA. Por consiguiente, en el mutante 1 y el mutante 2, se produjo una mutación en el gen pA que codifica una proteína compuesta por 394 aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 34, y parecía que se producía una proteína incompleta compuesta por 41 aminoácidos o 42 aminoácidos en el extremo N.
<Estudio de la partenocarpia del mutante deficiente en la función del gen pA de pimiento>
Cada uno del mutante 1 y el mutante 2, es decir, las mutaciones inducidas obtenidas en la generación original tenían el gen mutante como heterocigoto y, por lo tanto, se obtuvieron semillas de sus segundas generaciones autofecundadas y se realizó el análisis de las semillas así obtenidas. En la segunda generación autofecundada, se cultivaron un individuo que mostraba un homocigoto de tipo silvestre en un sitio de mutación y un individuo que mostraba un homocigoto de tipo mutante. Se eliminó una antera de cada uno de los individuos antes de la antesis y se comprobó la partenocarpia de los individuos. De manera simultánea, también se cultivaron un mutante de pimiento deficiente en la función del gen pA que muestra un homocigoto de tipo mutante en un sitio de mutación y un individuo que muestra un homocigoto de tipo silvestre, habiéndose sometido el mutante y el individuo a polinización abierta normal, y se usaron como controles realizando un tratamiento similar y observando el estado de maduración de un fruto. La figura 17 muestra los resultados de esto. Como se muestra en la figura 17, en la segunda generación autofecundada del mutante 1 y el mutante 2, el individuo que tenía el homocigoto de tipo silvestre y se había sometido a emasculación produjo un fruto que no se agrandó en absoluto, tal como con el pimiento general. Por otro lado, cada uno de los individuos, que se había obtenido de las correspondientes segundas generaciones autofecundadas del mutante 1 y el mutante 2 y tenía el homocigoto de tipo mutante, produjo un fruto que se observó claramente agrandado
incluso en el caso de que la emasculación hubiera evitado la polinización.
Por otra parte, con respecto al individuo que tiene el homocigoto de tipo mutante, las semillas no se formaron en absoluto en el fruto agrandado producido a partir de la flor emasculada. Por otro lado, con respecto a los individuos que tienen cualquiera de los homocigotos de tipo silvestre y los homocigotos de tipo mutante, se produjeron frutos agrandados que tenían semillas normales a partir de flores que se habían autopolinizado.
A partir de esto, se confirmó que el fruto agrandado producido a partir del individuo que tenía el homocigoto mutante se formó debido a la partenocarpia.
A partir de los resultados anteriores, se aclaró que la partenocarpia evidente también se inducía en el pimiento por la deficiencia de la función del gen pA del pimiento, que es un homólogo del gen A partenocárpico de la berenjena. Además, se demostró que el cuerpo de la planta que muestra partenocarpia podría obtenerse seleccionando (i) un individuo en el que el gen A tiene una mutación o (ii) un individuo en el que un gen homólogo del gen A tiene una mutación.
(3. Determinación cuantitativa de la concentración de IAA endógeno del mutante del gen pA derivado de pimiento)
De la segunda generación autofecundada del mutante 1 de pimiento, se seleccionaron y cultivaron los individuos 355-1P y 355-8P, y los individuos 355-1W y 355-8W. Cada uno de los individuos 355-1P y 355-8P mostró partenocarpia, y su sitio de mutación sin sentido encontrado en el gen pA era un homocigoto de tipo mutante. Ninguno de los individuos 355-1W y 355-8W mostró partenocarpia, y su sitio de mutación sin sentido encontrado en el gen pA era un homocigoto de tipo silvestre. En el presente caso, los individuos 355-1P y 355-1W eran individuos hermanos derivados de individuos de primera generación autofecundados del mismo mutante 1, y los individuos 355-8P y 355-8W eran individuos hermanos derivados de individuos de primera generación autofecundados del mismo mutante 1. De manera similar, de la segunda generación autofecundada del mutante 2 de pimiento, se seleccionaron y cultivaron un individuo 356-3P y un individuo 356-2W. El individuo 356-3P mostró partenocarpia, y su sitio de mutación sin sentido encontrado en el gen pA era un homocigoto de tipo mutante. El individuo 356-2W no mostró partenocarpia, y su sitio de mutación sin sentido encontrado en el gen pA era un homocigoto de tipo silvestre. En el presente caso, los individuos 356-3P y 356-2W derivaron de diferentes individuos de primera generación autofecundados del mutante 2. Se recogieron yemas inmediatamente antes de la antesis de los correspondientes individuos y se midieron las concentraciones de AIA endógeno en los ovarios. La figura 18 muestra los resultados de esto. Como se muestra en la figura 18, se aclaró que, en los individuos de tipo mutante del gen pA, el IAA endógeno se acumuló a una concentración notablemente más alta que en los individuos de tipo silvestre. Con respecto al mutante 1, los individuos homocigotos de tipo mutante (355-1P y 355-8P) mostraron un aumento en la cantidad de IAA endógeno que fue aproximadamente tres veces mayor que la de los homocigotos de tipo silvestre correspondientes (355-1W y 355-8W) que eran individuos hermanos. Con respecto al mutante 2, el homocigoto mutante (356-3P) mostró un aumento en la cantidad de IAA endógeno que fue aproximadamente 1,8 veces mayor que la del homocigoto de tipo silvestre (356-2W). A partir de ellos, se aclaró que, incluso en una línea partenocárpica inducida por una mutación sin sentido del gen pA del pimiento que era un homólogo del gen A partenocárpico de la berenjena, el contenido de AIA endógeno en el ovario se incrementó notablemente como en el caso de la berenjena, y el gen pA regulaba la partenocarpia del pimiento basándose en una función fisiológica idéntica a la del gen A de berenjena.
[Ejemplo 4: Análisis detallado del gen A partenocárpico de berenjena]
(1. Análisis del promotor del gen A partenocárpico con uso del gen GUS (p-glucuronidasa))
Se construyó un vector binario pZK3BGFP-PgeneAGN insertando un casete de expresión PgeneAGN ilustrado en la figura 6(a) en un sitio de reconocimiento de Ascl de un vector binario pZK3BGFP, y después se introdujo el vector binario pZK3BGFP-PgeneAGN en un cultivar de berenjena "Nakateshinkuro" con el método con Agrobacterium. Por lo tanto, se obtuvo una planta transgénica. Adicionalmente, se seleccionó un individuo que tenía un transgén como homocigoto de individuos en la primera generación autofecundada del transformante. Se recogió una flor producida a partir del individuo seleccionado (12023-3_homozygote) del transformante de berenjena 2 días antes de la antesis, y se detectó histoquímicamente la actividad de un gen indicador (GUS) según con un método de Kosugi et al. (Bibliografía de referencia: Kosugi et al. (1990) Plant Sci. 70: 133-40) utilizando X-Gluc como sustancia base. Como resultado, como se muestra en la Figura 19, se observó una actividad evidente de GUS en un tejido de ovario completo, una antera, un estilo y una base de pétalos. En el presente caso, como una aplicación artificial de auxina, se sabe que la auxina induce el agrandamiento de un fruto. Por otra parte, tal como se describe anteriormente, el gen A parece tener una función que afecta negativamente a la biosíntesis de IAA. Teniendo esto en cuenta, el hecho de que el gen A se exprese en todo el tejido del ovario sugiere fuertemente que (i) el gen A tiene la función de inhibir el agrandamiento de un fruto manteniendo baja la concentración de IAA en el tejido del ovario y (ii) la deficiencia de la función para inhibir el agrandamiento de un fruto, cuya deficiencia se debe a un defecto del gen A, provoca la inducción de la partenocarpia.
(2. Estudio de la partenocarpia del transformante de berenjena producido por separado del transformante de berenjena del ejemplo 1)
Con un método similar al método descrito en <Producción de transformante de berenjena mediante ARNi> del ejemplo 1 anterior, se produjeron nuevamente transformantes 12012-4_homozygote y 12014-10_homozygote, en los que se inhibió la expresión del gen A, y se mejoraron en un sistema experimental independiente del transformante de berenjena (12012-1 _homozygote) obtenido en el ejemplo 1. Por otra parte, se produjeron y mejoraron individuos hermanos 12012-4_null y 12014-10_null, cada uno de los cuales había perdido un transgén por segregación genética. La partenocarpia de estos transformantes se estudió con un método similar al método descrito en <Estudio de partenocarpia de transformante de berenjena> del ejemplo 1 anterior. Es decir, todos los transformantes (i) se cultivaron simultáneamente, (ii) se trataron de la misma manera, (iii) se observaron en términos de agrandamiento/crecimiento de frutos, y (iv) se compararon entre sí. La figura 20 muestra los resultados. Como se muestra en (a) y (c) de la figura 20, incluso en un caso en el que se evitó la polinización eliminando un estigma antes de la antesis, los frutos producidos a partir de los dos individuos transferidos genéticamente mostraron partenocarpia y no se formaron semillas dentro de los frutos. Por otro lado, como se muestra en (b) y (d) de la figura 20, con respecto a cada una de las dos líneas nulas 12012-4_null y 12014-10_null que habían perdido un transgén, no se formó ningún fruto agrandado a partir de un órgano floral cuyo estigma se había eliminado antes de la antesis. A partir de los resultados anteriores, se confirmó que se inducía partenocarpia evidente en tres líneas transformantes diferentes que se habían producido y mejorado mediante eventos de transformación diferentes e independientes, además de los resultados de los transformantes en el ejemplo 1.
Por otra parte, con un método similar al método descrito en <Estudio de partenocarpia de transformante de berenjena> en el ejemplo 1, se midió una cantidad de acumulación de ARNm del gen A en cada uno de los dos transformantes 12012-4_homozygote y 12014-10_homozygote recién obtenidos en el ejemplo 4. (a) de la figura 21 muestra los resultados. Como se muestra en (a) de la figura 21, en los transformantes 12012-4_homozygote y 12014-10_homozygote, cada uno de los cuales mostró partenocarpia, la expresión del gen A en un ovario en la antesis se inhibió en gran medida, es decir, la expresión del gen A fue de aproximadamente 1/4 a 1/6 en comparación con las de dos líneas nulas, cada una de las cuales había perdido un transgén.
Adicionalmente, en el transformante 12012-4_homozygote, se midió una cantidad de IAA endógeno en un ovario en la antesis. La medición se realizó con un método similar al método descrito en (4. Determinación cuantitativa de la concentración de ácido indol acético (IAA) y la concentración de metabolitos de IAA en la línea de berenjena partenocárpica PCSS) del ejemplo 1. (b) de la figura 21 muestra los resultados. Como se muestra en (b) de la figura 21, en el transformante 12012-4_homozygote que tenía un transgén como homocigoto y en el que se inhibió la expresión del gen A, se confirmó un aumento notable en la concentración de IAA que era más de tres veces mayor que en la línea hermana 12012-4_null que había perdido un transgén y en la que no se inhibía la expresión del gen A. Los resultados anteriores sugirieron fuertemente que la partenocarpia se induce en una planta solanácea mediante la inhibición de la expresión de una función génica del gen A partenocárpico.
(3. Prueba de complementación sobre la función del gen A mediante la introducción del gen A de tipo silvestre)
<Producción de la línea de berenjena partenocárpica "M3A">
A partir de la generación F5 de una línea PCSS y una línea de berenjena no partenocárpica TN-45 que se habían mejorado mediante los procedimientos descritos en <Mapeo detallado de la partenocarpia> del ejemplo 1 y la figura 3, se seleccionó P34F3_497_55_139 y su descendencia autofecundada se denominó "línea M3A". En la "línea M3A", los genotipos de 96 marcadores de polimorfismos de un solo nucleótido (Bibliografía de referencia: Hirakawa et al. (2014) DNA Res. 21: 649-660) distribuidos en un genoma completo eran todos homocigotos. Por otra parte, mediante PCR con el uso de cuatro cebadores representados por las respectivas SEQ ID NO: 49 a SEQ ID NO: 52 anteriores, se confirmó que la "línea M3A" tenía, en homocigosis, un gen que era un tipo mutante del gen A derivado de la línea PCSS (no ilustrado). A partir de los anterior, se determinó que la "línea M3Á' era una línea genéticamente pura.
Con el uso de la "línea M3A", se produjo un transformante de berenjena y se realizó un análisis funcional detallado del gen A como se indica a continuación.
<Producción de transformante de berenjena en una línea M3A>
Una secuencia que incluye una parte de una región promotora, un primer exón y un primer intrón del gen A en un genoma de un cultivar de berenjena "Nakateshinkuro" se amplificó mediante PCR utilizando (i) cebadores representados por la SEQ ID NO: 70 y la SEQ ID NO: 71 y (ii) ) un ADN genómico de "Nakateshinkuro" como plantilla, y así se obtuvo un fragmento que incluía 2313 pares de bases representado por la SEQ ID NO: 72. Este fragmento tenía (i) un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción Xbal en una parte de la 3a base a la 8a base desde un extremo 5' y (ii) un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción Xmal en una parte de la 3a base a la 8a base desde un extremo 3'. Obsérvese que este fragmento tiene un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción Bsml en un primer exón en la 14a base cadena abajo de un sitio de inicio de la traducción. El fragmento se insertó en un sitio Xbal-Xmal de un vector plasmídico pHSG398 (Takara Bio Inc.) y se realizó la clonación. Se confirmó una secuencia de bases de un clon así obtenido para seleccionar un clon pHSG398-PgeneAex1int1 que (i) no tenía una mutación derivada de la amplificación por PCR en la secuencia de bases y (ii) tenía una secuencia de bases deseada. El clon pHSG398-PgeneAex1int1 se digirió completamente por una enzima restricción Xbal y se suavizó con el uso
del kit Blunting high (Toyobo Co., Ltd.), y después se digirió completamente por Xmal. Por lo tanto, se cortó un fragmento clonado previsto. Al mismo tiempo, el pUC198AA-CGN descrito en <Aislamiento del promotor del gen A> del ejemplo 1 se digirió completamente por una enzima de restricción HindIII y de manera similar se suavizó y después se digirió completamente por Xmal. Por lo tanto, se cortó un promotor CaMV35S, y el fragmento cortado de pHSG398-PgeneAex1int1 se insertó en la parte de la que se había cortado el promotor CaMV35S. Un clon así obtenido se digirió completamente por Bsml y Sacl, y se cortó un fragmento que incluía (i) una parte cadena abajo de un sitio de reconocimiento de Bsml de un primer exón del gen A, (ii) una parte de un primer intrón, y (iii) un gen GUS derivado de pUC198AA-CGN. Se preparó otro fragmento digiriendo, mediante Bsml y Sacl, un clon que incluye un código de proteína completo del gen A obtenido con un método similar al método descrito en <Análisis del nivel de expresión del gen A en cada sitio del cuerpo de la planta en cada etapa de desarrollo> del ejemplo 1, y este otro fragmento se insertó en la parte de la que se había cortado el fragmento anterior. Un clon obtenido por el método anterior tenía un casete de expresión de un gen A de tipo silvestre (configurado por (i) una secuencia de ADNc que incluía un código completo del gen A de una región promotora del gen A a través de un sitio de inicio de la traducción y (ii) ) una secuencia de terminador NOS derivada de pUC198-CGN)). El casete de expresión se cortó mediante una enzima de restricción Ascl y se insertó en un sitio de reconocimiento de Ascl de un vector binario pZK3BGFP y, por lo tanto, se construyó un vector binario pZK3BGFP-PgeneA-ORFgeneAN. En la figura 22 se muestra una estructura del vector binario pZK3BGFP-PgeneA-ORFgeneAN. Este vector binario se introdujo en la "línea M3A" con un método similar al método descrito en <Producción de transformante de berenjena mediante ARNi> del ejemplo 1, y así se produjo un individuo 13011-3 con transformación. Adicionalmente, de una primera generación autofecundada del individuo 13011-3 con transformación, se seleccionaron un individuo 13011-3_homozygote que tenía un transgén A como homocigoto y un individuo 13011-3_null que había perdido un transgén A por segregación genética.
<Estudio de partenocarpia de transformante de línea M3A>
Los individuos obtenidos mediante la selección anterior se cultivaron simultáneamente con la línea original "M3A", que era una no transformante que servía como control. Con un método similar al método descrito en <Estudio de partenocarpia de transformante de berenjena> del ejemplo 1, la polinización se evitó eliminando un estigma de una flor antes de la antesis, y la partenocarpia se evaluó observando el agrandamiento del fruto después de eso. La figura 23 muestra los resultados. Como se muestra en (a) de la figura 23, la línea original M3A que era la no transformante mostró partenocarpia evidente mientras que, como se muestra en (b) de la figura 23, el agrandamiento del fruto del individuo 13011-3_homozygote se inhibió de manera notable por la eliminación del estigma antes de la antesis, y se perdió la partenocarpia que tenía la línea original M3A. Al mismo tiempo, como se muestra en (c) de la figura 23, el individuo 13011-3-null que había perdido un transgén mostró partenocarpia evidente, como la línea M3A que era una línea original. Por otra parte, se confirmó que el agrandamiento del fruto observado estaba causado por partenocarpia, por el hecho de que no se formaron semillas dentro de los frutos.
<Determinación cuantitativa de la cantidad de ácido indolacético (IAA) endógeno en el transformante de la línea M3A>
Para determinar cuantitativamente una cantidad de IAA endógeno en un transformante de la línea M3A, se midió una concentración de IAA endógeno en un ovario aproximadamente dos días antes de la antesis. La medición se realizó con un método similar al método descrito en (4. Determinación cuantitativa de la concentración de ácido indol acético (IAA) y la concentración de metabolitos de IAA en la línea de berenjena partenocárpica PCSS) del ejemplo 1. La figura 24 muestra los resultados. Como se muestra en la figura 24, se observó una disminución notable en la concentración de IAA endógeno en el individuo 13011-3_homozygote, en comparación con la línea original M3A. Por otra parte, se aclaró en el individuo 13011-3-null, que había perdido un transgén, que la concentración de IAA endógeno se reestableció a una concentración sustancialmente igual a la de la línea M3A.
A partir de los resultados anteriores, se aclaró que (i) se reestableció una no partenocarpia similar a la de un tipo silvestre y (ii) se redujo de manera notable una alta concentración de AIA endógeno que se observa de manera característica en un ovario de una línea partenocárpica porque se perdió la partenocarpia de la línea M3A expresando un gen A normal de tipo silvestre mediante un promotor del gen A. Como tal, la partenocarpia derivada de la línea PCSS se perdió y se reestableció un rasgo del tipo silvestre mediante la expresión del gen A de tipo silvestre, y esto demostró además claramente que la deficiencia de la función del gen A era la causa de la partenocarpia de la línea PCSS.
(4. Prueba detallada de partenocarpia de berenjena con el uso de una línea casi isogénica)
<Medición del peso dl fruto con el uso de una línea casi isogénica>
Los individuos P43F3_316_7_31_F_E10_10 y P43F3_316_7_31_F_E10_04 en la generación F8 que se mejoraron mediante los procedimientos descritos en <Mapeo detallado de la partenocarpia> del ejemplo 1 y la figura 3 eran dos individuos entre hermanos obtenidos por autofecundación de un solo individuo de la generación F7 P43F3_316_7_31_F_E10. Con respecto a los individuos hermanos, se comprobaron los genotipos de 96 marcadores de polimorfismos de un solo nucleótido distribuidos en un genoma completo con el método descrito en <Producción de la línea de berenjena partenocárpica "M3A"> en el ejemplo 4, y se mejoraron una "línea 039" y una "línea 089", en cada una de las cuales todos los locus de genes marcadores comprobados se fijaron en un genotipo alelo idéntico al
de la otra línea. Adicionalmente, la línea 039 tenía, como homocigoto, un tipo mutante del gen A derivado de la línea PCSS, y la línea 089 tenía, como homocigoto, un tipo silvestre del gen A derivado de la línea TN-43. Por consiguiente, ambas líneas parecían ser líneas casi isogénicas en las que solamente el gen A era del tipo mutante o del tipo silvestre y las otras regiones genómicas estaban fijadas a fondos genómicos sustancialmente idénticos. La línea 039 y la línea 089 se cultivaron simultáneamente, y cada una de las líneas 039 y 089 se sometió a polinización abierta normal y eliminación del estigma antes de la antesis. Los frutos se recogieron 30 días después de la antesis y se midieron los pesos de los frutos. La figura 25 muestra los resultados. Como se ilustra en la figura 25, en la línea 039 que tiene un gen A de tipo mutante idéntico al de la línea PCSS, se produjeron frutos normalmente agrandados que tenían un peso de aproximadamente 300 g tanto de una flor que se había polinizado de manera normal como de una flor cuya polinización se había evitado eliminando el estigma. Por otro lado, en la línea 089, se produjo un fruto normalmente agrandado con un peso (aproximadamente 300 g) equivalente al de la línea 039 a partir de una flor que se había polinizado de manera normal, pero, de una flor cuya polinización se había evitado al eliminar el estigma, solamente se produjo un fruto que se agrandó de manera defectuosa y tenía un peso de 50 g o menos, y no se producía en absoluto un fruto que se agrandara de manera normal. En el presente caso, tal como se describe anteriormente, la línea 089 era una línea casi isogénica de la línea 039, es decir, la línea 089 tenía un fondo genómico idéntico al de la línea 039 pero el gen A no era de tipo mutante sino de tipo silvestre. A partir de los resultados anteriores, se demostró que la expresión de la partenocarpia estaba controlada solo por una diferencia entre tener un gen A de tipo mutante como homocigoto y tener un gen A de tipo silvestre como homocigoto, y no estaba influenciada por otros factores genéticos. Adicionalmente, quedó claramente demostrado que, en el caso de tener el gen a de tipo mutante como homocigoto, se producía un fruto normalmente agrandado que tenía un peso equivalente al que tendría en el caso de una polinización normal, aunque se hubiera evitado la polinización.
(5. Medición de la actividad de la proteína del gen A expresada por E. coli)
<Construcción del vector para la expresión del gen A por E. coli>
La SEQ ID NO: 3 representa 1185 bases desde el nucleótido número 82 hasta el nucleótido número 1266 en una secuencia de ADNc del gen A, y las 1185 bases incluyen una secuencia de código de un producto del gen A representado por la SEQ ID NO: 1 y un codón de terminación. Se insertó una secuencia (SEQ ID NO: 69) que incluía 24 bases para codificar una secuencia Strep-tagll delante del codón de terminación de la secuencia de las 1185 bases manteniendo un marco de lectura como con el método descrito en (5. Medición de la actividad de la proteína A codificada por el gen A) <Análisis de la función de la proteína A codificada por el gen A, con el uso de la proteína transgénica> del ejemplo 1, y así se prepararon los datos de secuencia (SEQ ID NO: 73). La secuencia en los datos de secuencia (es decir, datos de secuencia de entrada) se convirtió mediante el uso de un programa de optimización "GENEius" (Eurofins Genomics K.K.) para tener un uso de codones que fuera óptimo para expresar el gen A por E. coli. Una secuencia de ADN así convertida está representada por la SEQ ID NO: 74. Una secuencia de aminoácidos deducida codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 74 es idéntica a una secuencia en la que la secuencia Strep-tagll se añade al extremo C de la secuencia de aminoácidos deducida del producto del gen A representado por la SEQ ID NO: 1. Adicionalmente, para la ejecución de la clonación, se añadió una secuencia de 16 pb representada por la SEQ ID NO: 75 al extremo 5' de una secuencia representada por la SEQ ID NO: 74, y se añadió una secuencia de 17 pb representada por la SEQ ID NO: 76 al extremo 3' de la secuencia representada por la SEQ ID NO: 74. Por lo tanto, se sintetizó un fragmento de ADN cuya longitud completa era de 1.242 pb mediante subcontratación (Eurofins Genomics K.K.). El fragmento de ADN (SEQ ID NO: 77) se mezcló con un vector de expresión de E. coli pPAL7 (BioRad Laboratories, Inc.), que se había tratado con las enzimas de restricción BamHI y Notl, de modo que el fragmento de ADN (SEQ ID NO: 77) se insertó en el vector de expresión pPAL7 de E. coli mediante clonación In-Fusion (Clontech Laboratories, Inc.) utilizando la homología de los extremos de ambos fragmentos. La figura 26 muestra una estructura de un vector recombinante pPAL7-geneA_strep_ec así obtenido. En una célula de E. coli en la que se ha introducido el vector, la expresión de un gen cadena abajo se induce mediante un promotor T7/lac y se produce un producto del gen A (proteína A) que tiene una etiqueta Profinity eXact en su extremo N y una etiqueta Strep-tag II en su extremo C.
<Expresión de proteína A en E. coli>
El vector obtenido con el método anterior se transformó en una cepa de E. coli BL21 (DE3), y el clon obtenido se cultivó a 20 °C durante 16 horas en un medio LB que contenía 0,3 mM de IPTG. Después de eso, se realizó la recogida y se extrajo una proteína en bruto con el uso de una solución de extracción de proteínas B-PER (Thermo Fisher Scientific Inc.). (a) y (b) de la figura 27 muestran fracciones durante la purificación de una proteína después de la extracción de la proteína en bruto, (a) de la figura 27 muestra un resultado de electroforesis realizada con el uso de gel TGX Stain Free (Bio-Rad Laboratories, Inc.). (b) de la figura 27 muestra un resultado de la transferencia Western realizada, con el uso de un anticuerpo contra Strep-tag II, en un gel idéntico al gel que se muestra en (a) de la figura 27. En las siguientes descripciones, las anotaciones en los números de los carriles son comunes para (a) de la figura 27 y (b) de la figura 27. En primer lugar, la proteína en bruto se separó en una fracción insoluble y una fracción soluble. Un carril 1 indica un resultado de la fracción soluble en la proteína en bruto extraída. Un carril 2 indica un resultado de la fracción insoluble. Después, la fracción soluble se pasó a través de una columna Profinity eXact Mini Spin (Bio-Rad Laboratories, Inc.) (columna en la que el ligando funcional es subtilisina proteasa), y después la columna se lavó dos veces con un tampón de lavado. Un carril 3 indica un resultado de una fracción que pasó a través de la columna sin unirse a la columna. Un carril 4 indica un resultado de una fracción de lavado de columna del primer lavado. Un carril
5 indica un resultado de una fracción de lavado de columna del segundo lavado. Después, eluyendo la fracción soluble con el uso de un eluato que contiene fluoruro de sodio, se cortó una etiqueta Profinity eXact que era un prodominio de subtilisina proteasa y se eluyó de la columna una proteína A que era una proteína prevista. Un carril 6 indica un resultado de la fracción eluida que contiene la proteína A. En este caso, la proteína A así obtenida tenía, en su extremo N, una secuencia espaciadora que incluía 7 restos de aminoácidos derivados de pPAL7 y representados por la SEQ ID NO: 78. Como lo indica el carril 6 en (a) y (b) de la figura 27, la proteína purificada obtenida se detectó como una banda sustancialmente única mediante (i) detección por fluorescencia en todas las proteínas mediante electroforesis con el uso de gel TGX Stain Free (Bio-Rad Laboratories, Inc.) ((a) de la figura 27) y (ii) detección mediante transferencia de Western específica de proteína transgénica con el uso de un anticuerpo contra Strep-tag II ((b) de la figura 27). A partir de estas, se confirmó que la proteína purificada obtenida se había purificado con alta pureza.
Por otra parte, como control, se preparó una estructura de vector que incluía un gen GUS derivado de E. coli en lugar del gen A. Es decir, como con el gen A, el gen GUS derivado de E. coli se incorporó en pPAL7 para expresarse mientras se fusiona una etiqueta Profinity eXact a su extremo N y se fusiona una etiqueta Strep-tag II a su extremo C, y se preparó una proteína transgénica con similares procedimientos. Una proteína GUS así obtenida y en la que se cortó la etiqueta Profinity eXact tenía, en el extremo N, una secuencia espaciadora que incluía 7 restos de aminoácidos representados por la SEQ ID NO: 78, como en el caso de la proteína A. También se confirmó que la proteína GUS transgénica obtenida con el método, mediante electroforesis en gel y transferencia Western, se había purificado con alta pureza (no ilustrado), como en el caso de la proteína A.
<Medición de la actividad de la proteína A de expresión en E. coli>
A las soluciones de la proteína A transgénica y la proteína GUS transgénica obtenidas anteriormente (cada una de las cuales era 0,5 mg/ml), se añadieron L-metionina (50 mM), fosfato de piridoxal e IPyA (1 mM) y la mezcla se hizo reaccionar a 37 °C durante una hora en tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 8,5). A continuación, la solución de reacción se purificó mediante una columna OASIS HLB y se analizó con el uso de LC/MS/MS. Como resultado, como se muestra en (c) de la figura 27, se aclaró que la proteína A transgénica tenía una actividad para producir 9,7 ng de triptófano por hora por cada microgramo mediante transaminación de metionina a IPyA. Por otro lado, en el experimento de control en el que se utilizó la proteína GUS transgénica en lugar de la proteína A transgénica, una actividad para producir triptófano no fue superior a un límite de detección (N.D.) Esto sugiere fuertemente que (i) la producción de triptófano depende de la proteína A transgénica y (ii) la secuencia espaciadora en el extremo N y la secuencia Strep-tag II en el extremo C son irrelevantes para la actividad de síntesis de triptófano en la que el IPyA incluido en la proteína A transgénica se utiliza como sustancia fundamental, es decir, la secuencia espaciadora en el extremo N y la secuencia Strep-tag II en el extremo C no influyen en la actividad de síntesis de triptófano.
Además de los resultados descritos en (5. Medición de la actividad de la proteína A codificada por el gen A) del ejemplo 1, los resultados anteriores demostraron además que la proteína A codificada por el gen A era una transferasa de grupos amino y tenía actividad para sintetizar triptófano utilizando, como sustancia de base, IPyA que era un precursor de IAA. Por otra parte, en este caso, se demostró que la proteína A podría al menos catalizar la transaminación de metionina a IPyA.
Basándose en los resultados anteriores, se pueden obtener las siguientes conclusiones:
La partenocarpia de la línea de berenjena PCSS está causada por una mutación por eliminación del gen A. El gen A es un gen que codifica la transferasa de grupos amino que sintetiza triptófano utilizando, como sustancia de base, IPyA que es un precursor de IAA. En el presente caso, la transferasa de grupos amino cataliza la reacción para sintetizar triptófano transfiriendo un grupo amino de un aminoácido a un ácido indolpirúvico (IPyA). El gen A de la presente invención puede al menos catalizar la reacción para sintetizar triptófano transfiriendo un grupo amino de metionina a un ácido indolpirúvico (IPyA). Adicionalmente, la expresión aumenta como un ovario de una yema antes de que se desarrolle la antesis, y la cantidad de endogenia de IAA aumenta notablemente debido a la deficiencia de la función del gen. A partir de estas, parece que el gen A sirve para inhibir el contenido de IAA endógeno en el ovario hasta una cierta cantidad o menos. Esta deficiencia de la función del gen A provoca un aumento en la cantidad de acumulación de IAA en el ovario alrededor de la antesis, y este aumento en la cantidad de acumulación de IAA desencadena una partenocarpia que se encuentra a un nivel práctico en términos de producción agrícola. El aumento en la cantidad de IAA endógeno no se observa en un tallo (entrenudo) o en el ápice de un brote, pero se observa específicamente en un ovario o una antera.
Adicionalmente, como con la berenjena, la partenocarpia se puede inducir en tomate inhibiendo, mediante la inducción de ARNi, la expresión y una función del gen tA homólogo de tomate que tiene una identidad de secuencia del 90 % o más de una secuencia de aminoácidos con el gen A. Además, como con la berenjena y el tomate, la partenocarpia se puede inducir en pimiento por una mutación deficiente en la función causada por el tratamiento con EMS en el gen pA homólogo de pimiento que tiene un 90 % o más de identidad de secuencia de una secuencia de aminoácidos con el gen A. Además, con respecto al tomate y pimiento, se ha descubierto que, como en el caso de la berenjena, la cantidad de endogenia de IAA aumenta notablemente por la deficiencia de la función de cada uno del gen tA homólogo de tomate y del gen pA homólogo de pimiento. Como tal, se concluye que el gen tA de tomate y el gen pA de pimiento inducen partenocarpia mediante mecanismos similares al gen A de berenjena.
Claims (12)
1. Un método para evaluar la partenocarpia de una planta solanácea, comprendiendo dicho método la etapa de:
comprobar si la expresión de un gen regulador de la partenocarpia, que incluye un polinucleótido citado en cualquiera de (1) a (4) a continuación, se inhibe o no en la planta solanácea en comparación con la planta solanácea de tipo silvestre correspondiente; o
comprobar si una función de un polipéptido, que está codificado por el gen regulador de partenocarpia, se inhibe o no en la planta solanácea, en donde la función del polipéptido se refiere a una actividad (actividad transferasa de grupos amino) para catalizar una reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un ácido indolpirúvico (IPyA), en comparación con la planta solanácea de tipo silvestre correspondiente,
(1) Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1,
(2) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una identidad de secuencia del 75 % o superior con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia,
(3) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 98 aminoácidos se sustituyen en, se eliminan de, se insertan en y/o se añaden a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia, y
(4) un polinucleótido que (i) se hibrida con un polinucleótido, que tiene una secuencia complementaria al polinucleótido mencionado en el anterior (1), en una condición rigurosa y (ii) codifica un polipéptido que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia.
2. El método según la reivindicación 1, en donde:
en la etapa de comprobación, se comprueba (i) una secuencia del polipéptido que tiene la actividad reguladora de la partenocarpia, (ii) una secuencia de bases del gen regulador de la partenocarpia, (iii) un nivel de expresión del gen regulador de la partenocarpia, o (iv) una cantidad de un transcrito del gen regulador de la partenocarpia.
3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde:
en la etapa de comprobación, la planta en la que se inhibe la expresión del gen regulador de la partenocarpia en comparación con la planta de tipo silvestre correspondiente o la planta en la que se inhibe la función del polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia en comparación con la planta de tipo silvestre correspondiente, en donde la función del polipéptido se refiere a una actividad (actividad transferasa de grupos amino) para catalizar una reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un ácido indolpirúvico (IPyA), se selecciona como una planta partenocárpica.
4. Un método para seleccionar una planta partenocárpica mediante la realización de un método descrito en la reivindicación 3.
5. Un método para producir una planta solanácea con partenocarpia regulada, comprendiendo dicho método la etapa de:
inhibir, en una planta solanácea, la expresión de un gen regulador de la partenocarpia que incluye un polinucleótido enumerado en cualquiera de (1) a (4) a continuación; o
inhibir, en una planta solanácea, una función de un polipéptido codificado por el gen regulador de la partenocarpia, en donde la función del polipéptido se refiere a una actividad (actividad transferasa de grupos amino) para catalizar una reacción para sintetizar triptófano mediante la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un ácido indolpirúvico (IPyA),
en donde la inhibición se realiza mediante un método de ingeniería genética seleccionado entre (i) la introducción por transformación de un polinucleótido, que inhibe la expresión del gen regulador de la partenocarpia en la planta o (ii) la alteración del gen regulador de la partenocarpia,
(1) Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1,
(2) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una identidad de secuencia del 75 % o superior con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia,
(3) un polinucleótido que codifica un polipéptido (i) que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 98 aminoácidos se sustituyen en, se eliminan de, se insertan en y/o se añaden a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y (ii) que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia, y
(4) un polinucleótido que (i) se hibrida con un polinucleótido, que tiene una secuencia complementaria al polinucleótido mencionado en el anterior (1), en una condición rigurosa y (ii) codifica un polipéptido que tiene una actividad reguladora de la partenocarpia.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde
la planta es berenjena.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde
la planta es berenjena, y
el gen regulador de la partenocarpia es un gen de berenjena.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde
la planta es tomate, y
el gen regulador de la partenocarpia es un gen de tomate.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde
la planta es pimiento, y
el gen regulador de la partenocarpia es un gen de pimiento.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en donde la identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 es del 85 % o superior.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en donde la identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 es del 90 % o superior.
12. El método según las reivindicaciones 5 o 6, en donde la alteración del gen regulador de la partenocarpia se realiza por al menos uno seleccionado del grupo que consiste en el uso de un tratamiento con mutágenos químicos, uso de mutagénesis dirigida al sitio y tratamiento con mutágenos físicos.
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