JP6874956B2 - セシウム吸収を制御する遺伝子およびセシウム低吸収性植物 - Google Patents
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Description
また、イネを含む種々の植物において、高親和性カリウム(high affinity K+, HAK)トランスポーターの遺伝子ファミリーの存在が知られており、系統解析や機能的な相違等が検討されてきている(非特許文献3)
[1]下記の(a)〜(f)のいずれか一のポリヌクレオチドからなる遺伝子を利用する、植物のセシウム吸収を抑制する方法:
(a)配列番号9の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号9の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号9の塩基配列と90%以上の同一性を有し、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(d)配列番号11のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号11のアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド。
[2]ポリヌクレオチドからなる遺伝子の利用が、該ポリヌクレオチドからなる遺伝子または該遺伝子にコードされるタンパク質の機能を低下させることである、1に記載の方法。
[3]ポリヌクレオチドからなる遺伝子の利用が、該ポリヌクレオチドからなる遺伝子のエキソン部分に変異を生じさせることである、1または2に記載の方法。
[4]1に定義された(a)〜(f)のいずれか一のポリヌクレオチドからなる遺伝子の機能が抑制されている、セシウム低吸収性植物体またはその一部。
[5]イネ属植物である、4に記載の植物体またはその一部。
[6]1に定義された(a)〜(f)のいずれか一のポリヌクレオチドからなる遺伝子の機能が抑制されている、セシウム低吸収性植物品種。
[7]植物が、イネである、6に記載の品種。
[8]6または7に記載の品種の繁殖材料。
[9]4もしくは5に記載の植物体またはその一部、または6もしくは7に記載の品種を利用することにより得られる、収穫物またはその加工品。
[10]1に定義された(a)〜(f)のいずれか一のポリヌクレオチドの、セシウム低吸収性のマーカーとしての使用。
本発明により、植物のセシウムの吸収を抑制する方法が提供される。
本発明により、セシウム低吸収性の、植物体、植物品種、その繁殖材料、その収穫物、その加工品が提供される。
本発明者らは、イネにおいてセシウムの吸収の吸収を制御する遺伝子は、TIGR locus Os04g32920、Gene name OSJNBb0012E08.7のKUP/HAK/KT familyに属するOsHAK1遺伝子であると結論付けた。本発明は、植物においてセシウムの吸収を制御する遺伝子のまたはそのホモログ、すなわち下記の(a)〜(f)のポリヌクレオチドを提供する。
(a)配列番号9の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号9の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号9の塩基配列と高い同一性を有し、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(d)配列番号11のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号11のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド。
(D)配列番号11のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(E)配列番号11のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するタンパク質;
(F)配列番号11のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するタンパク質。
本発明はまた、上記(a)〜(f)のいずれか一のポリヌクレオチドからなる遺伝子を利用する、植物のセシウム吸収を抑制する方法を提供する。
本発明はまた、請求項1に定義された(a)〜(f)のいずれか一のポリヌクレオチドに変異を有し、該ポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列からなるタンパク質の機能が抑制されている、セシウム低吸収性植物体またはその一部を提供する。
本発明はまた、野生型のセシウム吸収制御遺伝子と変異型セシウム吸収制御遺伝子との塩基配列の違いに基づき、植物体を識別することにも関する。識別は、例えば次のように行う。コシヒカリ等の従来のイネ品種の植物体と、セシウム低吸収性イネの植物体それぞれから抽出したゲノムDNAを鋳型とし、予め準備した標的配列(変異を含む部分)を増幅できるプライマーセットを用い、PCRにより標的配列を増幅する。得られた増幅産物を制限酵素で処理した後、電気泳動し泳動パターンの比較により両者を識別する。
(1)突然変異の誘発
突然変異の誘発方法としてアジ化ナトリウムとMNUの2種類の化学変異源を使用した。アジ化ナトリウム処理はあきたこまち種子を1.5 mMアジ化ナトリウム溶液(pH3.0 リン酸緩衝液)中でエアレーションを行いながら6時間処理を行った。またあきたこまちの受精卵処理は、開花した花に印をつけ、開花当日の夜12時に1.5mMのMNU溶液に開花した花を穂ごと1時間浸漬することで、突然変異誘発処理を行った。処理後の穂は約10時間流水で洗浄し、その後通常の栽培管理を行い、M1種子を収穫した。それぞれの処理によるM1種子は圃場で栽培し、M2世代種子はバルクで収穫し、突然変異集団とした。
M3世代種子を育苗後、土壌中の水溶性セシウム(安定同位体133Cs)濃度が高い圃場に定植して、8027系統をそれぞれの個体を分けて収穫し、各個体の玄米を硝酸分解し、玄米Cs濃度をICP-MS(ThermoFisher Scientific co, XシリーズII)により分析した。
2014年度に選抜した3系統を秋田県南秋田郡大潟村の水田と秋田県山本郡藤里町の水田で栽培した。その結果、大潟村で栽培した各系統の玄米Cs濃度は、コントロールのあきたこまちが7.5μg/kgと比較して0.36、0.70、0.31μg/kgといずれも10%以下と低く、藤里町で栽培した玄米Cs濃度もコントロールのあきたこまちのCs濃度が12.66μg/kgに対し、2.49、3.41、2.61μg/kgと約20〜27%程度と低く抑えられていた(図2)。
Cs吸収制御遺伝子の特定やその制御遺伝子の交配や遺伝子組み換えによる他の栽培品種への導入にはCs吸収の変異を持つ系統の簡便な同定法が要求される。3系統のCs吸収変異系統の自殖種子を2週間水耕栽培で育てた幼植物のCs吸収特性を調べた。具体的には自殖種子を種子消毒後3日間浸種したのち、28℃ 明期16時間/暗期8時間のグロースチャンバー内で水耕栽培を開始し、発芽3日後に植え替えを行いその後2週間栽培した。水耕液には木村氏B液の組成を一部改変したものを通常のカリウム濃度のものを用いた(表1)。2週間栽培後、数段階に異なるカリウム濃度に調整した木村氏B液(表2)にCs(塩化セシウム)を10ppbとなるように添加したものに幼植物を移し、5日後まで経時的に植物体をサンプリングし、地下部のCs濃度を分析した。
(1)対立性試験
3系統得られたCs低吸収突然変異体同士を交配させたF1世代およびF2世代について、前述の水耕栽培法により、Cs吸収特性を調べた。その結果、F1世代およびF2世代のいずれもが、もとの3系統の突然変異体とほぼ同じCsの低吸収性を示した(図5,6)。このことから3系統のCs吸収制御遺伝子は同じものであることが明らかとなった。
遺伝子のマッピングに用いられるインディカ系統のカサラスの前述の水耕栽培法によりCs吸収性を分析したところ、カサラスはあきたこまちと同じくCs高吸収性であった。Cs低吸収系統とカサラスとの交配を実施し、F2世代について水耕栽培法により根へのCs吸収量を分析し、Cs低吸収個体をホモ個体として選抜した。これらの植物体からゲノムDNAの抽出、ラフマッピングを行い、Cs吸収制御遺伝子の染色体および染色体上の位置の絞り込みを行った。
3系統の突然変異系統を各10個体ずつ木村氏B液で2週間水耕栽培した。これらの3系統の幼植物からゲノムDNAを抽出した。コントロールとして親品種であるあきたこまちからも同様にDNAを抽出した。全ゲノム配列は,HiSeq1000(イルミナ社)を用いて、リード長100 bp、両末端解析の条件で取得した。全ゲノム解析には、各突然変異系統は1/3レーン分、あきたこまちは1レーン分のリード配列を用いた。リード配列はリファレンス配列(IRGSP1.0)に対してBWAの初期条件でアライメントした。遺伝子マッピングで明らかにされた染色体領域について、IGVで可視化して、突然変異系統とあきたこまちの塩基配列を比較しながら原因遺伝子の特定を行った。
3系統変異体のcDNAを鋳型としてOsHAK1の遺伝子領域をサンガーシーケンスにより配列解析した結果、いずれの系統もエキソン部分に1塩基置換の変異が検出された。2系統(D10-23およびF5-136)は同じ塩基が置換され、アミノ酸配列の1カ所のアミノ酸の置換(GlyがAspに置換)が生じ、残りの1系統(E10-4)は途中でストップコドンに置換されたものであった(図8)。
日本晴を木村氏B液で2週間水耕栽培し、根よりNucleoSpin(R) RNA Midi(マッハライ・ナーゲル社)を用いてTotal RNAを抽出した。その後SuperScript(R) III First-Strand Synthesis SuperMix(ThermoFisher Scientific co.,)を用い、Oligo dTプライマーでmRNAからcDNAを合成した。その後、以下のプライマーセット:
HAK1_5primeF CCAGCCGGCGAGAGAGAGC (SEQ ID NO.: 1)
HAK1_3primeR AGCATGGACAACACACCACCAGTG (SEQ ID NO.: 2)
によりOsHAK1遺伝子の全長をKOD -Plus- Neo(TOYOBO)を用いたPCRにより増幅した。
Hind3-HAK1_5prime_F AAGCTTCCAGCCGGCGAGAGAGA (SEQ ID NO.: 3)
HAK1_3prime_R-Hind3 AAGCTTAGCATGGACAACACACCACCAGTG (SEQ ID NO.: 4)
とKOD -Plus- Neo(TOYOBO)を用いたPCRにより増幅し、PCR産物の両端にHindIIIの制限酵素部位を付加した。増幅産物は、TArget CloneTM -Plus-キット(TOYOBO)を用い、平滑末端の両端にA付加反応後、pTA2ベクターにTAクローニングにより挿入した。このベクターを大腸菌(DH-5α)に導入し、培養後、プラスミドを抽出し、HindIIIによる制限酵素処理後、アガロースゲルで電気泳動し挿入配列の切り出し、精製を行った。HindIIIで切断、アルカリフォスファターゼ処理を行ったpBUH3ベクターに、このDNA断片をライゲーションにより挿入し、大腸菌に導入し、培養後プラスミドを抽出した。このプラスミドはユビキチンプロモーターでOsHAK1遺伝子を強制発現させることができる。
SEQ ID NO.:2 PCR primer HAK1_3primeR
SEQ ID NO.:3 PCR primer Hind3-HAK1_5prime_F
SEQ ID NO.:4 PCR primer HAK1_3prime_R-Hind3
SEQ ID NO.:5 PCR primer HAK1N2 P1
SEQ ID NO.:6 PCR primer HAK1N2 P2
SEQ ID NO.:7 PCR primer HAK1N13 P1
SEQ ID NO.:8 PCR primer HAK1N13 P2
SEQ ID NO.:9 OsHAK1 gDNA
SEQ ID NO.:10 OsHAK1 cDNA
SEQ ID NO.:11 deduced protein OsHAK1
Claims (10)
- 下記の(a)〜(f)のいずれか一のポリヌクレオチドからなる遺伝子を利用する、植物のセシウム吸収を抑制する方法:
(a)配列番号9の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号9の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号9の塩基配列と90%以上の同一性を有し、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(d)配列番号11のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号11のアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド;
(f)配列番号11のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ植物のセシウム吸収を制御する機能を有するポリヌクレオチド。 - ポリヌクレオチドからなる遺伝子の利用が、該ポリヌクレオチドからなる遺伝子または該遺伝子にコードされるタンパク質の機能を低下させることである、請求項1に記載の方法。
- ポリヌクレオチドからなる遺伝子の利用が、該ポリヌクレオチドからなる遺伝子のエキソン部分に変異を生じさせることである、請求項1または2に記載の方法。
- 請求項1に定義された(a)〜(f)のいずれか一のポリヌクレオチドからなる遺伝子の機能が抑制されている、セシウム低吸収性植物体またはその一部。
- イネ属植物である、請求項4に記載の植物体またはその一部。
- 請求項1に定義された(a)〜(f)のいずれか一のポリヌクレオチドからなる遺伝子の機能が抑制されている、セシウム低吸収性植物品種。
- 植物が、イネである、請求項6に記載の品種。
- 請求項6または7に記載の品種の繁殖材料。
- 請求項4もしくは5に記載の植物体またはその一部、または請求項6もしくは7に記載の品種を利用することにより得られる、収穫物またはその加工品。
- 請求項1に定義された(a)〜(f)のいずれか一のポリヌクレオチドの、セシウム低吸収性のマーカーとしての使用。
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