CN107404857B - 高温种子萌发 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子。与不具有经修饰的NXS基因的野生型种子相比，经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列为该种子提供在高温下萌发的能力。对基因和/或其调控序列的修饰可能导致NXS基因的表达被显著降低或被阻止。除此之外或替代地，该种子可以具有降低的NXS蛋白水平、降低的NXS蛋白活性或完全不存在NXS蛋白。经修饰的NXS基因可以例如包含提前终止密码子和/或编码包含一个或多个氨基酸置换的NXS蛋白。

Description

高温种子萌发
发明领域
本发明涉及能够在高温下萌发的种子。本发明还涉及产生具有这种能力的种子的植物、后代和繁殖材料及其用途。本发明特别涉及莴苣中在高温下的萌发。
发明背景
种子在不同环境条件下快速均匀地萌发的能力是种植者中非常期望的特征。温度是调节萌发的关键环境信号。种子已经发展了被称为热抑制(二次或诱导型休眠的形式)的机制，以防止在超最适温度期间种子提前萌发，例如在炎热的夏天月份可能发生的种子萌发。
在种子中，植物的应激激素植物激素脱落酸(ABA)涉及种子萌发的热抑制。已经显示ABA的水平响应于诸如高温的非生物胁迫而升高，但在最适温度下迅速降低。因此，ABA在调控种子萌发的热抑制中起重要作用。
种子引发允许种子的受控水合，允许种子在萌发过程中完成第一步骤，然后它们干燥回其原始水分含量，并储存直至播种。种子引发的主要优点之一是通过增加萌发发生的最高温度来缓解热抑制的能力。
虽然种子引发可能有利于种子萌发，但在劳力和设备要求、所用成分的类型以及水合和干燥回种子所需的时间方面是昂贵的程序。此外，与未处理的种子相比，引发过程可能导致经引发的种子的保质期降低。这种不良副作用受到干燥回程序的速度和程度的影响。
此外，存在“过度引发”的固有风险，这可能导致种子的根尖发生损害，并且随之可能导致幼苗生长不良。过度引发将使得经引发的种子无用，从而使复杂的种子质量检查成为引发过程的另外必要条件。
通过开发能够在高温下萌发而不需要引发的种子，昂贵且潜在不确定的种子引发过程变得过时了。
提高种子在高温下萌发的能力也可以扩大蔬菜种植总面积。由于此类品种的萌发能力不足以克服在这样高的温度下的热抑制，世界相对温暖的冬季的地区目前不适合某些作物生长。
在更全球化的背景下，由于全球变暖导致的温度上升可能对土壤温度有相当大的影响。因此，高温和由此导致的土壤温度升高被认为是重大的环境压力，其可能限制了在不久的将来全球的作物生产力。
在得到本发明的研究中，出乎意料地发现对莴苣新黄素合成酶基因的一个或多个修饰给莴苣种子提供了在高温(其显著高于包含野生型新黄素合成酶基因的莴苣种子的萌发温度)下萌发的能力。如本文所用，新黄素合成酶简称为NXS。NXS是ABA途径中的酶，其催化来自紫黄质(ABA的前体)的新黄素的形成。由于NXS是ABA途径中的酶，因此预计对将导致较低的新黄素水平的NXS基因和/或编码的NXS蛋白的修饰也将导致ABA水平的降低，从而允许种子萌发仍然发生在高温下。ABA途径的高度保守性意味着对如同本研究中发现的NXS基因和所得性状的修饰广泛适用于其中存在具有相似功能的直系同源的NXS基因的其他植物物种。
因此，本发明的目的是提供具有改善的在高温下萌发的能力的种子。进而这将减少或消除对昂贵的引发处理的需要，和/或允许萌发的更大的均匀性和可靠性，和/或潜在增加作物栽培总面积。
因此，本发明提供了在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子。在一个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子，其中与不具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的野生型种子相比，经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列为种子提供在高温下萌发的能力。在另一个实施方案中，本发明涉及经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，与在其基因组中不具有经修饰的NXS基因和/或经修饰的调控序列的野生型种子相比，所述经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列为种子提供在高温下萌发的能力。因此，在本申请的上下文中，本发明的性状是其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子具有在高温下萌发的能力的表型。更特别地，在一个实施方案中，本发明是其中其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或经修饰的调控序列的种子具有在黑暗中的高温下萌发的能力的表型。“本发明的性状”、“性状”或“表型性状”可以互换使用。
在具体实施方案中，本发明涉及经修饰的莴苣(Lactuca sativa)NXS基因，其野生型基因被鉴定于SEQ ID No.1中，SEQ ID No.1编码SEQ ID No.2的蛋白质。
在更具体的实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因的莴苣种子，其中与不具有修饰的NXS基因的野生型种子相比，经修饰的NXS基因为处于未引发状态下的种子提供在高温下萌发的能力。
当本文提及莴苣的NXS基因时，修饰也可以涉及该基因的调控序列。在本发明的上下文中，此类调控序列可以是位于该基因的内含子区域内的增强子序列，或者可以位于其调控基因的上游或下游。此类调控序列甚至可以位于染色体另一部分上或者甚至另一染色体上远离该基因的位置。因此，调控序列控制或调控基因表达。
所述在高温下萌发的能力是通过对NXS基因和/或其调控序列的修饰来控制的，其遗传与单基因隐性性状的遗传相一致。术语“隐性性状”是指在本申请的上下文中，该完全可实现的性状仅在以纯合状态包含经修饰的NXS基因和/或经修饰的调控序列的植物的种子中可观察到。由于性状的遗传与单基因性状的遗传相当，所以有利的是，性状可以容易地并入各种植物类型的给定植物物种中。
在本申请中，术语“修饰”是指导致“修饰”型野生型基因的野生型NXS基因和/或其野生型调控序列的变化。本申请的上下文中的“基因”包含外显子序列和调控序列如启动子序列，并且如果存在也包含内含子序列。对NXS基因和/或其调控序列的修饰可抑制基因转录，从而减少或防止经修饰的基因的表达。修饰也可以是导致NXS基因的序列和/或调控序列的变化，其导致所编码的NXS蛋白的水平降低、活性降低或完全不存在。
本发明还涉及NXS基因，其与野生型序列相比包含其编码序列和/或其调控序列和/或剪接位点的修饰，其中所述修饰导致其基因组中包括经修饰的基因的种子的萌发温度的升高。如本文所用，“编码序列”是由编码蛋白质的外显子组成的基因的DNA部分。如本文所用，“剪接位点”是在将前mRNA加工成成熟mRNA期间内含子剪接发生的识别位点。剪接位点发现于内含子的5'和3'末端。剪接位点也旨在落在更一般的术语“调控序列”之下。当对隐性基因的修饰以纯合状态存在时，其是可见的。本文中描述的一些修饰是隐性的，因此，这些修饰仅将与野生型种子相比在升高的温度下萌发的能力赋予具有纯合形式修饰的种子。显性或中间状态的修饰也可以在杂合状态下看到。这种类型的修饰也是本发明的一部分。
在具体实施方案中，本发明涉及莴苣NXS基因，与SEQ ID No.1的野生型序列相比，其在其编码序列和/或其调控序列和/或剪接位点在包含修饰，其中修饰导致包含经修饰的基因的种子的萌发温度升高。
在本申请全文中描述了基因修饰技术、修饰类型并且更具体地说是NXS基因的修饰的实例。如本文所用，野生型是指天然存在的生物体、菌株、基因、特征或性状的形式，并且与例如突变的形式形成对比。
如前所述，种子萌发温度依赖性强。在一批种子中，每一粒单独的种子在具体温度下可能萌发或不萌发。优选地，所有种子或至少高百分比的种子在最适萌发温度范围内萌发。如果温度高于最适萌发温度范围，一批种子的萌发百分比急剧下降。种子批次的萌发温度可以用“萌发温度50”(GT50)来测量，GT50是这样的温度，在该温度下给定种子批次中50％的种子将会萌发。当给定种子批次的种子暴露于高于GT50的温度时，它们可能变得热休眠或死亡。在给定作物中，不同栽培品种的GT50可能不同。
本申请中所用的“种子批次(seed lot)”是指从母本植物生产的一批种子(abatch of seeds)。种子批次优选由至少100粒种子组成。当使用少于100粒种子来确定种子批次的GT50时，GT50变得不太准确。
应在相同的生产环境中生产包含具有经修饰的NXS基因的种子的种子批次及其相应的野生型种子批次，以使其可进行比较。本领域技术人员熟悉不同植物物种的生产环境。例如，在本发明的上下文中，即具有本文描述的GT50值的莴苣种子批次在纬度为52°的情况下，在具有Cfb的
Figure BDA0001278058510000051
-分类的海洋气候中生产(McKnight&Hess,2000.PhysicalGeography:A Landscape Appreciation.Upper Saddle River,NJ:Prentice Hall)。
本申请中使用的上限温度截止点“GT50 Dark”是指当在黑暗中播种在纸上时，给定种子批次中50％的种子将会萌发的温度。在连续黑暗条件(24h/天)下测量GT50 Dark，因为当种子种植在土壤下或种子被包裹在颗粒(pellet)中时，这样做模拟了萌发条件。属于该种子批次的种子暴露于GT50 Dark以上，可能导致种子变得热休眠或死亡。
本领域技术人员能够使用两步法确定种子批次的GT50 Dark。首先，在不同温度下进行萌发试验，以确定在给定温度下随时间推移的累积萌发百分比。对于要测试的每个种子批次，优选将100粒种子播种在用自来水润湿的圆形滤纸的顶部上。它们又放置在不透明的塑料托盘内，该托盘本身内衬着也用自来水润湿的大方形的甜菜滤纸。将温度记录装置放置在甜菜滤纸上以记录种子水平的实际萌发温度。然后将托盘用安装好的不透明的盖子封闭，并放置在深色塑料袋内。然后将托盘放置在所需温度的预热培养箱内。生物学重复优选播种在不同的托盘中和在不同的时间点以除去与播种相关的任何偏差。
应采取所有预防措施以确保萌发试验在黑暗条件下进行。设置测试、孵育和萌发评分优选在隔离了所有外部光源的热稳定的房间内进行。另外，例如使用绿色安全灯(Philips TL-D 36W/17 Green)照亮了热稳定房间，以防止任何光线对萌发产生影响。
对于给定的温度，优选每天对萌发评分两次。如本文所用，当根的突出可见时发生“萌发”。对萌发的种子进行计数，然后在每个计数时刻取出。如果在种子批次中有死亡或休眠的种子，则萌发后至少进行四次额外的计数时刻，直到没有观察到额外的萌发。然后可以通过绘制“随时间萌发”曲线来确定给定种子批次在给定温度下的最终萌发百分比。最终萌发百分比计算为在评分结束时萌发种子的数量/播种用于试验的种子数量×100％。例如，如果在评分结束时，被测试的种子批次的所有种子萌发，则最终萌发百分比为100％。如本文所用，“最终萌发百分比”是种子批次萌发的百分比，其后不再萌发。
然后将来自每个“随时间萌发”曲线的最终萌发百分比按照实际测量的温度进行绘制，例如莴苣的情况下从18℃至42℃(图5A、5B和5C)。例如，使用最佳拟合线，以将最终萌发百分比拟合成每个种子批次的曲线。本领域技术人员熟悉这种做法。
从最佳拟合线，可以确定每个种子批次的GT50 Dark。GT50 Dark对应于这样的温度，在该温度下最终萌发百分比预期为50％。当给定种子批次的种子暴露于高于GT50 Dark的温度时，它们可能变得热休眠或死亡。
在一个实施方案中，本发明涉及种子批次，其中属于该种子批次的种子包含经修饰的NXS基因和/或经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，其为种子提供在高温下萌发的能力，并且所述种子批次的特征在于，所述种子批次的GT50 Dark比不包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子批次的GT50 Dark高至少5℃。
在另一个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或经修饰的调控序列的种子，其中所述种子属于具有GT50Dark的种子批次，该GT50 Dark比包含不具有修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子的种子批次的GT50 Dark高至少5℃。
具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子的种子批次的GT50 Dark或具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子的萌发温度比不具有本发明的经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子的种子批次的GT50 Dark或种子的萌发温度高5℃至25℃、6℃至25℃、7℃至25℃、8℃至25℃、9℃至25℃、10℃至25℃、11℃至25℃、12℃至25℃、13℃至25℃、14℃至25℃、15℃至25℃、16℃至25℃、17℃至25℃、18℃至25℃、19℃至25℃、20℃至25℃、21℃至25℃、22℃至25℃、23℃至25℃以及24℃至25℃。超过25℃的升高也落在本发明范围内。
所述种子包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当纯合存在时，为该种子提供在高温下、特别是在至少20℃的温度下萌发的能力。
该种子批次的GT50Dark或该种子的萌发温度为20℃至40℃、21℃至40℃、22℃至40℃、23℃至40℃、24℃至40℃、25℃至40℃、26℃至40℃、27℃至40℃、28℃至40℃、29℃至40℃、30℃至40℃、31℃至40℃、32℃至40℃、33℃至40℃、34℃至40℃、35℃至40℃、36℃至40℃、37℃至40℃、38℃至40℃、39℃至40℃。
对于大多数植物物种来说，40℃是种子萌发可允许的最高生物学温度。这也意味着通过在所述种子的基因组中具有纯合存在的经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列为种子所提供的种子的种子批次的GT50 Dark的升高或种子萌发温度的升高将不能为所述种子提供具有超出生物最高值40℃的萌发能力，而不管由经修饰的NXS基因提供的相对升高。
对于一些植物物种来说，例如芹菜(Apium graveolens)或奎藜(Chenopodiumquinoa)，包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子的种子批次的GT50Dark，或包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子的萌发温度可以低于至少20℃的温度。然而，具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子的种子批次的GT50 Dark或具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子的萌发温度仍然比不具有本发明的经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子的种子批次的GT50 Dark或种子的萌发温度高5℃至25℃、6℃至25℃、7℃至25℃、8℃至25℃、9℃至25℃、10℃至25℃、11℃至25℃、12℃至25℃、13℃至25℃、14℃至25℃、15℃至25℃、16℃至25℃、17℃至25℃、18℃至25℃、19℃至25℃、20℃至25℃、21℃至25℃、22℃至25℃、23℃至25℃以及24℃至25℃。超过25℃的升高也落在本发明范围内。
在一个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的植物，当在种子中纯合存在时，为该种子提供在高温下萌发的能力。高温如上所述。
在具体实施方案中，本发明涉及莴苣种的种子批次，其中属于该种子批的种子包含经修饰的NXS基因，当纯合存在于种子中时，为处于未引发状态的种子提供在高温下萌发的能力，并且所述种子批次的特征在于所述种子批次的GT50 Dark比不包含经修饰的NXS基因的种子的种子批次的GT50 Dark高至少10℃。
在另外的实施方案中，本发明涉及莴苣种子，其在其基因组中包含经修饰的NXS基因，其中所述种子属于比包含不具有修饰的NXS基因的种子的种子批次的GT50 Dark高至少10℃的GT50 Dark的种子批次。
具有经修饰的NXS基因的莴苣种的种子的种子批次的GT50 Dark或者具有经修饰的NXS基因的种子的萌发温度比不具有经修饰的NXS基因的种子的种子批次的GT50 Dark或种子的萌发温度高10℃至25℃、11℃至25℃、12℃至25℃、13℃至25℃、14℃至25℃、15℃至25℃、16℃至25℃、17℃至25℃、18℃至25℃、19℃至25℃、20℃至25℃、21℃至25℃、22℃至25℃、23℃至25℃以及24℃至25℃。。超过25℃的升高也落在本发明范围内。
所述莴苣种子包含经修饰的NXS基因，其在纯合存在时，为处于未引发状态的种子提供在高温下、特别是至少31.8℃的温度下萌发的能力。
该种子批次的GT50 Dark或该种子的萌发温度为28℃至40℃、31.8℃至40℃、32℃至40℃、33℃至40℃、34℃至40℃、35℃至40℃、36℃至40℃、37℃至40℃、38℃至40℃、39℃至40℃。
在具体的实施方案中，本发明涉及包含经修饰的NXS基因的莴苣植物，当所述基因在种子中纯合存在时，其为处于未引发状态的种子提供在高温下萌发的能力。高温如上所述。
修饰NXS基因和/或其经修饰的调控序列可能导致该基因的表达的变化。在一个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子，其中经修饰的NXS基因的表达被显著降低或被阻止，并且这种降低或阻止导致该种子能够在比不包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的野生型种子更高的温度下萌发。在又一个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的种子，其中经修饰的NXS基因的表达被降低或被阻止。
在另一个实施方案中，本发明涉及经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，其中当存在于种子或植物的基因组中时所述基因的表达被显著降低或被阻止。在另一个实施方案中，本发明涉及经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，其中所述基因的表达被降低或被阻止。
当在本发明的上下文中NXS基因的表达被降低或被阻止时，这意味着经修饰的NXS基因的表达小于野生型NXS基因的表达，或者被阻止因而不存在。在本发明的上下文中所述降低或阻止基因表达直接或间接地造成本发明的高温下萌发的性状。
在更具体的实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因的莴苣种子，其中经修饰的NXS基因的表达被显著降低或被阻止。
通常，可以通过阻止基因的转录来降低或阻止基因表达。例如可以通过针对NXS基因启动子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子，或优选通过作用于NXS基因启动子的负性作用的转录因子的表达来实现阻止转录。通过使NXS mRNA或转录物不稳定，优选通过与NXS mRNA或转录物互补的核酸分子，选自反义RNA、RNAi分子、病毒诱导的基因沉默(VIGS)分子、共抑制分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸也可以降低或阻止基因表达。用于使mRNA或转录物不稳定的此类方法是本领域技术人员众所周知的。
在又一个实施方案中，本发明涉及具有降低的NXS蛋白水平、降低的NXS蛋白活性或完全不存在NXS蛋白的种子。在一个实施方案中，本发明涉及由编码它的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的修饰导致的具有降低的NXS蛋白水平、降低的NXS蛋白活性或完全不存在NXS蛋白的种子。在另一个实施方案中，本发明涉及经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，其特征在于包含所述经修饰的基因和/或其经修饰的调控序列的种子具有降低的NXS蛋白水平、降低的NXS蛋白活性或完全不存在NXS蛋白。通过破坏NXS基因的转录，例如通过在NXS基因启动子序列中引入一个或多个突变，可以发生NXS蛋白的水平降低或完全不存在NXS蛋白。例如通过将一个或多个突变引入到NXS基因的编码序列中，可能发生NXS蛋白的活性降低。与不存在一个或多个突变的野生型NXS基因编码的NXS蛋白相比，对NXS基因的此类突变可能会影响所编码的蛋白质的生物学功能。
在更具体的实施方案中，本发明涉及具有降低的NXS蛋白水平、降低的NXS蛋白活性或完全不存在NXS蛋白的莴苣种子。
在得到本发明的研究过程中，鉴定出在高温下萌发的莴苣种子在NXS基因中包含突变。所鉴定的突变之一导致在莴苣NXS基因的编码序列中的提前终止密码子(图1，SEQ IDNo.1)。另一个突变导致莴苣NXS蛋白的高度保守残基中氨基酸的置换(图1，SEQ ID No.2)。在一个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因的莴苣种子，其中经修饰的NXS基因包含提前终止密码子。在另一个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因的莴苣种子，其中经修饰的NXS基因编码包含一个或多个氨基酸置换的NXS蛋白。
两种类型的突变为各自突变体的莴苣种子提供了在高温下萌发的能力，所述高温远高于相应野生型莴苣种子的萌发温度(见实施例1-3和图5A、5B、5C)。已经发现，与野生型种子相比，其中保守的脯氨酸残基被丝氨酸残基置换的对NXS基因的修饰，为种子提供了在显著更高的高温下萌发的能力。引入了提前终止密码子的NXS基因的修饰也升高了萌发温度(参见实施例3B的表2，其显示出在突变种子批次和野生型种子批次之间GT50 Dark的相对升高，以及实施例4)。
尽管在本研究过程中已经确定的NXS突变说明了上述莴苣NXS基因突变与本发明性状之间的成因作用，但这肯定不是导致本发明的性状的NXS基因的仅有的突变并且不应当局限于此。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因的种子，其中经修饰的NXS基因包含提前终止密码子。在另一个实施方案中，本发明涉及经修饰的NXS基因，其中所述基因包含提前终止密码子。
在具体的实施方案中，本发明涉及具有经修饰的NXS基因的莴苣种子，其中修饰是位于根据SEQ ID No.1的莴苣NXS基因的外显子3、外显子4或外显子5内的提前终止密码子。更特别地，提前终止密码子是根据SEQ ID No.1的莴苣NXS基因的残基G3018>A3018的突变的结果。
在一个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因的种子，其中经修饰的NXS基因编码包含一个或多个氨基酸置换的NXS蛋白。在另一个实施方案中，本发明涉及经修饰的NXS基因，其中所述基因编码包含一个或多个氨基酸置换的NXS蛋白。
在莴苣中，鉴定出两种类型的突变均导致萌发温度升高。两种突变都在NXS基因中。除此之外，本领域技术人员能够非常好地引入对莴苣或另一作物的NXS基因中的萌发温度具有相同或相似效果的其它突变。通过使用本文所述的萌发试验，可以确定萌发温度是否高于野生型(即不包含经修饰的NXS基因的植物)中的萌发温度。因此，在莴苣中的这种观察可以更广泛适用于具有NXS基因的其他作物。
NXS基因和/或其调控序列中的一个或多个突变优选通过以下手段随机引入：一种或多种化学化合物，例如甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝基甲基脲、羟胺、原黄素、N-甲基-N-亚硝基胍、N-乙基-N-亚硝基脲、N-甲基-N-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、氮杂环丙烷、叠氮化钠、福尔马林、氨基甲酸酯、苯酚和环氧乙烷，和/或物理手段，如紫外线照射、快中子暴露、X射线、γ照射，和/或通过插入遗传元件，例如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件。诱变还包括通过同源重组、基于寡核苷酸的突变引入、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)或成簇的、规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统的更特异的、靶向引入至少一个修饰。
可能导致NXS蛋白活性降低的突变的实例是NXS编码序列的突变，其导致编码蛋白质中的提前终止密码子、移码或氨基酸变化。提前终止密码子通常导致表达所编码蛋白的截短形式。取决于编码序列中的突变的位置，蛋白质的截短形式可能缺少一个或多个对于进行其功能和/或与底物或与其它蛋白质相互作用所必需的结构域，和/或可能缺少适当折叠成功能蛋白质的能力。
移码突变是由编码蛋白质的DNA序列中的一个或多个碱基对的引入或缺失引起的。当在某一位置插入或缺失的碱基对的数量不是3的倍数时，编码蛋白质序列的各个氨基酸的三联密码子相对于原来的开放阅读框发生移动，所编码的蛋白质序列发生显著变化。蛋白质翻译将导致与原始编码的蛋白质的氨基酸序列相比完全不同的氨基酸序列，并且通常移码也导致开放阅读框架中的提前终止密码子。总体结果是所编码的蛋白质不再具有与最初编码的蛋白质相同的生物学功能。
当编码序列中一个或多个碱基对的突变导致编码不同氨基酸的改变的三联密码子时，产生编码蛋白质序列中氨基酸的变化。由于遗传密码的冗余，并非所有点突变都导致氨基酸变化。这样的突变被称为“沉默突变”。一些氨基酸变化是“保守的”，即它们导致一个氨基酸被另一个具有相当性质的氨基酸替换，使得突变不可能显著地改变成熟蛋白的折叠或影响其功能。其他氨基酸变化是在底物识别、酶的活性位点中发挥作用的结构域中的非沉默的、非保守氨基酸变化，相互作用结构域或主要结构域(如跨膜螺旋)可部分或完全破坏编码的蛋白质的功能，而并不必然影响编码基因的表达水平。如本文所用，当一个氨基酸被具有不同化学性质的另一个氨基酸替代时，会发生“非保守氨基酸改变”，这可能导致所编码蛋白质的不利的稳定性、功能性和/或结构效应。
NXS基因的启动子序列中的突变也可能扰乱所编码的NXS蛋白的生物学功能，因为这样的突变可能导致完全缺乏该基因的转录(例如随后导致完全不存在NXS蛋白)，或者转录水平的明显下降且生物学水平不足(例如随后导致NXS蛋白水平降低)。剪接位点中的突变也可能扰乱所编码的蛋白的生物学功能，因为如果剪接位点被突变破坏，则从基因转录的成熟mRNA中编码的氨基酸序列将不正确，并且可以容易含有移码和/或提前终止密码子。在任一情况下，从这样的mRNA翻译的蛋白质序列将不同于最初编码的蛋白质序列，这将最有可能对翻译的蛋白质的生物功能具有严重后果。
如前所述，某些氨基酸置换产生保守的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以基于残基的化学性质(例如极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性或两性性质中的相似性)进行保守氨基酸置换，在这种情况下所得蛋白质仍然可以正常发挥作用。氨基酸置换可以发生在不显著影响蛋白质结构或功能的蛋白质区域。相反，发生在对于蛋白质的结构和/或功能必不可少的良好保守或不变位置的氨基酸置换，或用不具有保守化学性质的氨基酸的置换(例如疏水的vs.带电的vs.极性的)，可能导致非保守氨基酸变化。
在优选的实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因的种子，其中经修饰的NXS基因包含提前终止密码子和/或编码包含一个或多个氨基酸置换的NXS蛋白。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及经修饰的NXS基因，其中所述基因包含提前终止密码子和/或编码包含一个或多个氨基酸置换的NXS蛋白。
直系同源的NXS蛋白之间的多个序列比对显示出可能与NXS蛋白的稳定性、功能和/或结构相关的高度保守的位置(图4)。保守残基的修饰可能引起蛋白质的表达水平或活性的变化。在一个实施方案中，本发明涉及在其基因组中包含经修饰的NXS基因的种子，其中编码的NXS蛋白的保守残基被置换。在另一个实施方案中，本发明涉及经修饰的NXS基因，其中所述基因编码其中保守残基被置换的NXS蛋白。导致在编码蛋白质的这些保守位置非保守氨基酸变化的NXS基因突变导致NXS蛋白水平降低、活性降低或完全不存在。
在又一个实施方案中，保守残基是特别是脯氨酸残基，其被发现在超过200个不相关物种的NXS蛋白的多个序列比对中非常高度保守(结果未显示)。优选地，该保守的脯氨酸被丝氨酸残基或任何其它非保守氨基酸改变所置换，这将破坏所编码的NXS蛋白的稳定性、功能性和/或结构。本领域技术人员熟悉对于给定氨基酸是非保守氨基酸变化的置换。
更特别地，本发明涉及经修饰的莴苣NXS基因，其中在莴苣NXS蛋白(SEQ ID No.2)中位置212上的高度保守的由莴苣NXS DNA序列(SEQ ID No.1)的C3518C3519A3520编码的脯氨酸残基被丝氨酸残基置换(C3518C3519A3520>T3518C3519A3520)。
在另一个实施方案中，保守残基是特别是色氨酸残基，其被发现在超过200个不相关物种的NXS蛋白的多个序列比对中非常高度保守(结果未显示)。
更特别地，在莴苣中，保守的色氨酸位于莴苣NXS蛋白(SEQ ID No.2)位置175上，其由莴苣NXS DNA序列(SEQ ID No.1)的T3196G3197G3198编码。优选地，这种保守的色氨酸被任何其它非保守氨基酸改变所置换，其将破坏所编码的NXS蛋白的稳定性、功能性和/或结构。
本发明的种子也是其中直系同源的NXS基因和/或其调控序列经适当修饰的种子，其中经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列为种子提供了在高温下萌发的能力，例如选自以下任意种的种子：莴苣(Lactuca sativa)、苦苣(Cichorium endivia)、菊苣(Cichorium intybus)、茄子(Solanum melongena)、番茄(Solanum lycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、风铃辣椒(Capsicum baccatum)、甘蓝(Brassica oleracea)、芹菜(Apium graveolens)、菠菜(Spinacia oleracea)、莴苣缬草(Valerianella locusta)、胡萝卜(Daucus carota)、大豆(Glycine max)、萝卜(Rhaphanus sativus)、奎藜(Chenopodium quinoa)、绿豆(Vigna radiata)、紫苜蓿(Medicago sativa)、鹰嘴豆(Cicerarietinum)、荞麦(Fagopyrum esculentum)、胡卢巴(Trigonella foenum-graecum)、洋葱(Allium cepa)、兵豆(Lens esculenta)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、豌豆(Pisum sativum)、欧洲葡萄(Vitis vinifera)、小麦(Triticum aestivum)和/或大麦(Hordeum vulgare)。本申请不打算要求保护烟草(Nicotiana tabacum)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子。
本发明还涉及植物，其在基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在纯合存在于种子中时，与不具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的野生型种子相比，给种子提供在高温下萌发的能力。对于本发明的包含经修饰的NXS基因的种子，如上所述，对NXS基因和/或编码的蛋白质的一个或多个修饰导致显著NXS蛋白的基因表达降低或被阻止和/或活性降低或完全不存在。
因此，本发明的植物是从表现本发明的性状的种子生长的植物或产生表现本发明的性状的种子的植物。在后一种情况下，种子的两个亲本都应该具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列。
本发明的植物也是其中直系同源的NXS基因和/或调控序列被适当修饰的植物，当修饰存在于种子中时，这种修饰为种子提供了在高温下萌发的能力，例如选自以下任意种的植物：莴苣、苦苣、菊苣、茄子、番茄、辣椒、风铃辣椒、甘蓝、芹菜、菠菜、莴苣缬草、胡萝卜、大豆、萝卜、奎藜、绿豆、紫苜蓿、鹰嘴豆、荞麦、胡卢巴、洋葱、兵豆、水稻、玉米、菜豆、豌豆、欧洲葡萄、小麦和/或大麦。本申请不打算要求保护烟草(烟草)或拟南芥植物。
在一个实施方案中，本发明的植物是莴苣植物，其在其基因组中包含经修饰的NXS基因，其在未引发的种子中纯合存在时，与不具有修饰的NXS基因的野生型种子相比，为种子提供高温下萌发的能力。
一旦经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列在植物中纯合存在，在隐性的情况下，导致显著减少或阻止NXS基因表达和/或降低的水平、降低的活性或完全不存在NXS蛋白的遗传修饰导致种子在高温下萌发的能力。可以将经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列从包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的植物渗入缺乏经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的植物，但具有其他期望的性状，当植物具有性别相容性时，使用杂交，任选地与有助于开发活的种子或促进发育成植物的技术组合。缺少经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的植物的期望性状可以选自，但不限于以下组：对细菌、真菌或病毒疾病的抵抗力、昆虫或害虫的抗性、植物大小、植物类型、改善的保质期、水分胁迫、耐热性、单性结实和不育性。在具体的实施方案中，使用标准育种技术，将经修饰的莴苣NXS基因从含有修饰的莴苣NXS基因的莴苣植物渐渗到缺乏经修饰的莴苣NXS基因和/或其经修饰的调控序列的莴苣植物中。
通过使用性状内在的基于对NXS基因的修饰和/或其经修饰的调控序列的分子标志物，从包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的植物中获得本发明的高萌发性状的植物的选择开始于F1或来自正在获得的植物与源植物之间的杂交的任何其它代。本领域技术人员熟悉产生并使用分子标志物来鉴定此类修饰。在具体的实施方案中，合适的分子标志物的实例是根据SEQ ID No.1的莴苣的NXS基因中的SNP C3518>T3518和SNP G3018>A3018。
或者，经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的选择开始于杂交的F2或备选地回交的F2。也可以基于对F3种子批次进行的萌发试验，以及通过使用直接或间接检测性状内在的NXS基因修饰和/或其经修饰的调控序列的分子标志物，完成对F2中植物的筛选。
选择具有经修饰的NXS基因的植物可以开始于F3或更后一代，其中当在种子中纯合存在时所述基因为种子提供在高温下萌发的能力。
杂交可以任选地接着胚胎拯救技术或导致成功组合和渐渗的其它技术，所述技术是本领域技术人员已知的。
本发明还涉及植物的后代，所述植物包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，其中当纯合存在于种子中时，其为种子提供在高温下萌发的能力。这样的后代可以通过本发明的植物或其后代植物的有性繁殖或营养繁殖产生。该后代携带导致本发明的性状的经修饰的NXS基因和/或经修饰的调控序列。
当经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列纯合存在于后代植物的种子中时，种子具有以与本发明植物的种子相似或类似方式在高温下萌发的能力。
如本文所用，“后代(progeny)”旨在表示来自与本发明的植物的杂交的后代(offspring)或第一个和所有其他后代(descendant)，其显示本发明的性状和/或携带性状内在的经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列。
在一个实施方案中，本发明涉及携带本发明的性状并且已经通过从合适的来源通过常规育种或遗传修饰(特别是顺式发生(cis-genesis)或反式发生(trans-genesis))引入负责该性状的经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列获得所述性状的植物。顺式发生是用编码来自作物植物本身或与性相容的供体植物的(农业)性状的天然基因遗传修饰植物。反式发生是用来自不可杂交物种的基因或用合成的基因遗传修饰植物。
本发明还涉及适用于生产植物的繁殖材料，该植物在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当纯合存在于种子中时，为种子提供在高温下萌发的能力。
在一个实施方案中，繁殖材料适于有性繁殖。此类繁殖材料包括例如小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。在另一个实施方案中，繁殖材料适于营养繁殖。此类繁殖材料包括例如插条、根、茎、细胞、原生质体，并且特别是叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根尖、花药、花、种子和茎。
本发明还涉及从本发明的植物的所述繁殖材料生长或再生的植物，所述植物在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，其中经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列当其纯合存在于种子中时，为种子提供了在高温下萌发的能力。
本发明还涉及本发明植物的细胞，所述细胞包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，其为种子提供了在高温下萌发的能力。优选地，本发明的细胞是植物或植物部分的一部分，但细胞也可以为分离形式。
本发明还涉及本发明植物的细胞，所述细胞在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，其为种子提供在高温下萌发的能力。
本发明还涉及本发明的植物作为作物的用途，所述植物包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，其为种子提供在高温下萌发的能力。
本发明还涉及本发明的植物作为种子来源的用途，所述植物包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，其为种子提供在高温下萌发的能力。
本发明还涉及本发明的植物作为繁殖材料的来源的用途，所述植物包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，其为种子提供在高温下萌发的能力。
本发明还涉及的本发明植物用于消费的用途，所述植物包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，其为种子提供在高温下萌发的能力。
本发明还涉及本发明的植物在植物育种中的用途，所述植物包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，其为种子提供在高温下萌发的能力。
本发明还涉及本发明的种子用于发芽(sprouting)的用途，所述种子在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，其为种子提供在高温下萌发的能力。术语“发芽”是指萌发种子用于消费的做法。
本发明还涉及本发明的发芽的种子用于消费的用途，所述种子在其基因组中包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，其为种子提供在高温下萌发的能力。术语“发芽的种子”是指可以生吃或烹饪的萌发种子。可以生吃或烹饪的发芽的种子的实例可以包括但不限于以下种的发芽的种子：萝卜、奎藜、绿豆、紫苜蓿、鹰嘴豆、荞麦、胡卢巴、洋葱、兵豆、菜豆和豌豆。
本发明还涉及生产能够在高温下萌发的种子的方法，包括修饰种子的NXS基因和/或其调控序列以降低基因的表达水平、以阻止基因的表达和/或降低编码的NXS蛋白的活性。适当地，通过使基因突变来实现修饰。突变适合于种子、特别是在其基因组中具有野生型形式的NXS基因的种子上进行。
在一个实施方案中，包含经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的植物是近交系、杂交体、二倍体化单倍体的植物或分离群体的植物。
本发明还提供了用于生产具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的植物的方法，其中当在种子中纯合存在时，通过使用二倍体化单倍体生成技术以产生包含高温萌发性状的二倍体化单倍体系为种子提供在高温下萌发的能力。
本发明还涉及具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的杂交种子，当在种子中纯合存在时，为种子提供在高温下萌发的能力，以及生产这样的杂交种子的方法，包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得杂交种子，其中所述第一亲本植物和所述第二亲本植物是携带经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列的至少一个等位基因的植物。当两个亲本都具有经修饰的NXS基因和/或经修饰的调控序列时，其一个或多个、优选多个其他性状适当地不同。
本发明还涉及通过使用包含经修饰的NXS基因和/或经修饰的调控序列的种子用于生长所述植物而用于生产植物的方法，所述植物具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，为种子提供在高温下萌发的能力。
本发明还涉及用于种子生产的方法，该方法包括从本发明的种子生长植物，允许植物产生种子并收获那些种子。通过杂交或自交适当地进行种子的生产。优选地，如此产生的种子具有在高温下萌发的能力。为此，两个亲本应该具有经修饰的NXS基因和/或经修饰的调控序列。
在一个实施方案中，本发明涉及使用组织培养物用于生产植物的方法，所述植物具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，为种子提供在高温下萌发的能力。
本发明还涉及使用营养繁殖用于生产植物的方法，所述植物具有经修饰的NXS基因和/或其经修饰的调控序列，当在种子中纯合存在时，为种子提供在高温下萌发的能力。
本发明可广泛适用于在其基因组中含有NXS基因的所有植物物种和作物。可以在许多作物中鉴定NXS直系同源物，即其他物种中的NXS基因，用于该鉴定的方法是本领域已知的方法。在本研究中，使用基本局部比对搜索工具(BLAST)程序针对其他植物基因组序列来比较莴苣NXS DNA和蛋白质序列(图1，SEQ ID No.1和2)。这导致每个物种1-2个最佳匹配，并且这些被鉴定为候选NXS直系同源基因。然后设计引物以扩增完整的NXS基因。对于一些植物物种，直系同源的NXS蛋白序列通过Blast X或Blast P鉴定为对莴苣NXS或其他植物NXS蛋白序列的互惠最佳匹配。通过该方法鉴定的NXS直系同源物的DNA和蛋白质序列呈现在图2、图3和表1中。蛋白质序列的多个序列比对证实这些是直系同源的NXS基因(图4)。
一旦直系同源的NXS基因的DNA序列是已知的，则该信息可用于通过本文所述的方法调节或修饰所述基因的表达。在一个实施方案中，本发明涉及以下的NXS基因的修饰形式和/或其经修饰的调控序列：莴苣、苦苣、菊苣、茄子、番茄、辣椒、风铃辣椒、甘蓝、芹菜、菠菜、莴苣缬草、胡萝卜、大豆、萝卜、奎藜、绿豆、紫苜蓿、鹰嘴豆、荞麦、胡卢巴、洋葱、兵豆、水稻、玉米、菜豆、豌豆、欧洲葡萄、小麦和/或大麦。
当在本申请中指出，经修饰的NXS基因“当纯合存在时”为种子提供具有在高温下萌发的能力，这旨在包括其中修饰为隐性的情况，而且还包括其中修饰为显性的情况，并且当修饰基因存在于杂合状态时，也表达高温下萌发的能力。这样的显性修饰可以但不是必须存在于纯合状态中，而且在杂合状态中也是可见的。具有这样的显性修饰的种子和植物及其用途也是本发明的一部分。
附图
图1：莴苣NXS(基因组)DNA(SEQ ID No.1；图1A)和NXS蛋白序列(SEQ ID No.2；图1B)。ATG翻译起始位点是加粗和加下划线的。两个经修饰的密码子(T3017G3018G3019和C3518C3519A3520)和保守的色氨酸密码子(T3196G3197G3198)的野生型位置是加粗和加下划线的。
在优先权申请中图1的编号和其中对图1的所有引用开始于并包括位于该图中第一个核苷酸下游的ATG翻译起始位点。在本申请中SEQ ID No：1的编号和本文中对SEQ IDNo：1的所有引用开始于图中所示的位于起始密码子上游的第一个核苷酸位置。为了便于参考，下表表示在优先权申请中与ATG起始密码子相关的核苷酸位置的编号及其在本申请的SEQ ID NO：1中相应的编号。
优先权申请中的编号 本申请中的编号
T1218G1219G1220 T3017G3018G3019
C1719C1720A1721 C3518C3519A3520
T1397G1398G1399 T3196G3197G3198
T1218G1219G1220>T1218A1219G1220 T3017G3018G3019>T3017A3018G3019
C1719C1720A1721>T1719C1720A1721 C3518C3519A3520>T3518C3519A3520
SNP G1219>A1219 SNP G3018>A3018
SNP C1719>T1719 SNP C3518>T3518
图2A-2AA：NXS直系同源物的DNA序列。
Fig.2A；2B:胡萝卜(变体1和2),
Fig.2C:苦苣,
Fig.2D；2E:茄子(变体1和2),
Fig.2F；2G:番茄(变体1和2),
Fig.2H:辣椒,
Fig.2I:甘蓝,
Fig.2J；2K:芹菜(变体1和2),
Fig.2L:菠菜,
Fig.2M:莴苣缬草,
Fig.2N:萝卜,
Fig.2O:风铃辣椒,
Fig.2P:奎藜,
Fig.2Q:荞麦,
Fig.2R:兵豆,
Fig.2S:紫苜蓿,
Fig.2T:豌豆,
Fig.2U；2V:绿豆(变体1和2),
Fig.2W:胡卢巴,
Fig.2X:菊苣,
Fig.2Y；2Z:洋葱(变体1和2),
Fig.2AA:大麦。
图3：以下NXS直系同源物的蛋白质序列：胡萝卜(变体1和2)、苦苣、茄子(变体1和2)、番茄(变种1和2)、辣椒、甘蓝、芹菜(变体1和2)、菠菜、莴苣缬草、萝卜、奎藜、辣椒、荞麦、兵豆、紫苜蓿、豌豆、绿豆(变体1和2)、胡卢巴、菊苣、洋葱(变体1和2)、大麦。
图4：来自图3和表1的植物物种的直系同源物NXS蛋白序列的多个序列比对。
图5A：显示野生型
Figure BDA0001278058510000221
种子批次和Ls_mt_sen突变体种子批次在给定温度范围内的最终萌发百分比的图。GT50Dark是这样的温度，在该温度下最终萌发百分比预期为50％。/>
图5B：显示野生型Burovia种子批次和Ls_mt_bur突变体种子批次在给定温度范围内的最终萌发百分比的图。GT50Dark是这样的温度，在该温度下最终萌发百分比预期为50％。
图5C：显示对于
Figure BDA0001278058510000222
和Burovia两种野生型种子批次和突变体种子批次在给定温度范围内的最终萌发百分比的图。GT50Dark是这样的温度，在该温度下最终萌发百分比预期为50％。
表
NXS直系同源物的概述呈现在表1中。概述表明图2、3和4中哪些植物物种连接哪些SEQ ID No.。对于一些植物物种，列出了GI号(GenInfo标识符)和Genbank登录号，其可以用于检索相应的直系同源的NXS序列。
表1
Figure BDA0001278058510000231
/>
Figure BDA0001278058510000241
CDS＝编码DNA序列
实施例
实施例1
通过甲基磺酸乙酯(EMS)对
Figure BDA0001278058510000242
和Burovia莴苣种子进行遗传修饰
野生型莴苣品种
Figure BDA0001278058510000243
和Burovia RZ的种子(二者均来自Rijk Zwaan,De Lier,The Netherlands)在室温下用EMS通过将每个品种大约2000粒种子浸没于0.5％(w/v)或0.7％EMS的充气溶液中24小时。
每个品种每个EMS剂量约1500个经处理的种子萌发，并将所得植物从5月到9月在荷兰的温室(例如52°纬度，海洋气候，
Figure BDA0001278058510000244
-分类Cfb)中生长以生产种子。
成熟后，收获M2种子并以每种处理每个品种一个库进行堆积。将所得的四个库的M2种子用作起始材料，以鉴定含有高温下萌发的等位基因的个体M2种子。
通过确定褪色植物的发生来评估遗传修饰程序的功效，褪色植物表示由于直接或间接参与叶绿素形成或积累的基因的修饰而导致的叶绿素损失。观察到M2种子的4个池中的每一个中的个体植物褪色。这表明所应用的处理导致遗传修饰。
实施例2
鉴定能够在高温下萌发的
Figure BDA0001278058510000251
和Burovia莴苣种子
在实施例1中描述的EMS处理产生的M2种子中鉴定出能够在高温下萌发的莴苣种子。
在每个可用的M2库中，约2000粒种子在密封的容器中的湿滤纸上萌发。在连续黑暗条件(24h/天)下，将Burovia的M2种子在35℃下孵育，而
Figure BDA0001278058510000252
的M2种子在32℃下孵育，以模拟土壤下或当种子被包裹在颗粒中的天然萌发条件。
在给定温度下萌发的任何种子都长成植物。这些植物自花授粉以产生M3种子。在连续黑暗条件下，在34℃或35℃下再次萌发M3种子，以确认存在高温下萌发的等位基因。
将确认的M3种子长成M3系，然后使其繁殖。
实施例3A
Figure BDA0001278058510000253
和Burovia野生型和突变体莴苣种子的种子萌发试验
在不同温度下进行萌发试验，以确定每个种子批次的野生型莴苣品种
Figure BDA0001278058510000254
和Burovia以及EMS处理的保藏种子(在实施例2中获得)在给定温度下随时间的累积萌发。
对于每个种子批次，将100粒种子播种在用自来水润湿的圆形滤纸的顶部上。将圆形滤纸上播种的种子又放置在不透明的塑料托盘内，该托盘本身内衬着用自来水润湿的大方形的甜菜滤纸。此外，将温度记录装置放置在甜菜滤纸上以记录种子水平的实际萌发温度。然后将托盘用安装好的不透明的盖子封闭，并包裹在一层深色塑料内。将托盘放置在所需温度的预热培养箱内。萌发试验从18℃至42℃进行。生物学重复在不同的托盘中播种，优选在不同的时间点，以消除与播种相关的任何偏差。
采取所有预防措施以确保萌发试验在黑暗条件下进行。设置萌发试验、孵育和萌发评分均在隔离了所有外部光源的热稳定房间内进行。为了防止任何光线对萌发产生影响，房间里点亮了绿色安全灯(Philips TL-D 36W/17 Green)。
对于给定的温度，每天对萌发评分两次。当穿过种皮的根的突出清晰可见时，种子被评分为萌发。对萌发的种子进行计数，然后在每个计数时刻取出。如果在测试种子批次中有死亡或休眠的种子，则萌发后至少进行四次额外的计数时刻，直到没有观察到额外的萌发。通过绘制“随时间萌发”曲线确定给定种子批次在给定温度下的最终萌发百分比。最终萌发百分比计算为在评分结束时萌发种子的数量/播种用于试验的种子数量×100％。
实施例3B
测定
Figure BDA0001278058510000261
和Burovia野生型和突变体种子批次的GT50 Dark
为了测定给定种子批次的GT50 Dark，将来自实施例3A的每个“随时间萌发”曲线的最终萌发百分比按照实际测量的温度从18℃至42℃进行绘制(图5A、5B和5C)。使用最佳拟合线将最终萌发百分比拟合成曲线。
通过测定在该温度下最终萌发百分比预计为50％的温度得到每个种子批次的GT50 Dark(表2)。当给定种子批次的种子暴露于高于GT50 Dark的温度时，它们可能变得热休眠或死亡。
从表2和图5A、5B和5C(在突变体种子批次和野生型种子批次之间GT50 Dark的相对增加)可以清楚地看出，包含本发明的以纯合状态携带突变的未引发的种子的种子批次的GT50Dark，显著高于不携带所述突变的未引发的种子的种子批次。这说明本发明的种子在高温下萌发的能力直接来自所述突变。
表2突变体种子批次和野生型种子批次的GT50 Dark。
Figure BDA0001278058510000271
B＝Burovia RZ
Figure BDA0001278058510000272
实施例4
在高温下萌发的NXS基因的鉴定
对产生如实施例3A和3B所示的能够在高温下萌发的M3种子批次的M2莴苣植物进行测序。基于根据SEQ ID No.1的莴苣NXS DNA序列设计PCR扩增和测序引物。
DNA测序显示根据Ls_mt_sen在根据SEQ ID No.1的NXS基因中存在G3018>A3018突变(T3017G3018G3019>T3017A3018G3019)，导致在根据SEQ ID No.2的所编码的蛋白质中在位置140上的色氨酸转变成提前终止密码子。这种突变导致在M2植物中截短的、无功能形式的NXS蛋白的表达和相应的M3种子批次的种子。
在Ls_mt_bur中，DNA测序显示根据SEQ ID No.1的NXS基因中存在C3518>T3518突变(C3518C3519A3520>T3518C3519A3520)，导致在根据SEQ ID No.2的所编码的蛋白质中在位置212上的脯氨酸转化为丝氨酸。这种突变导致在M2植物中无功能形式的NXS蛋白的表达和相应的M3种子批次的种子。
实施例5
NXS直系同源物的鉴定
莴苣NXS基因的DNA和蛋白质序列示于图1、SEQ ID No.1和2中。使用基本局部比对检索工具(BLAST)将莴苣NXS DNA和蛋白质序列与其他植物物种的序列进行比较鉴定了NXS基因的直系同源物。使用这种方法，每个物种1-2个最佳匹配被鉴定为候选NXS直系同源基因。然后设计引物扩增完整的NXS基因。对于一些植物物种，直系同源的NXS蛋白序列通过Blast X或Blast P鉴定为对莴苣NXS或其他植物NXS蛋白序列的互惠最佳匹配。通过该方法鉴定的NXS直系同源物的DNA和蛋白质序列呈现在图2、图3和表1中。预测的蛋白质序列的多个序列比对证实这些是直系同源的NXS基因(图4)。
超过200个不相关物种的NXS蛋白的比对显示，在NXS直系同源物中存在许多非常高度保守的氨基酸(结果未显示)。例如，根据SEQ ID No.2的莴苣NXS蛋白中位置212上和由根据SEQ ID No.1的莴苣NXS DNA序列中C3518C3519A3520编码的脯氨酸残基，是许多不相关物种中高度保守的基序的一部分。在莴苣突变体Ls_mt_bur中发现了无功能形式的NXS蛋白，其为在该位置上用丝氨酸残基置换脯氨酸残基的结果(见实施例4)。由于在该位置的脯氨酸是高度保守的氨基酸和/或高度保守的蛋白质基序的一部分，因此在任何NXS直系同源物中它的破坏也将导致产生无功能的NXS蛋白。
超过200种不相关物种的NXS蛋白的相同比对还显示，NXS直系同源物中另一非常高度保守的氨基酸残基是色氨酸残基，其在莴苣中位于根据SEQ ID NO.2并由在根据SEQID No.1的莴苣NXS DNA序列中T3196G3197G3198编码的莴苣NXS蛋白中的位置175上。同样因为色氨酸也是高度保守的氨基酸和/或高度保守的蛋白质基序的一部分，在任何NXS直系同源物中它的破坏将导致产生无功能的NXS蛋白。
实施例6
修饰直系同源的NXS基因以产生高温下萌发的性状
目的植物物种的种子被诱变以将点突变引入基因组。使用化学手段(如EMS处理(见实施例1))或特定靶向手段实现诱变。本领域技术人员熟悉将突变引入基因组的化学和靶向手段。
然后将经诱变的种子萌发，所得植物自交或杂交以产生M2种子。进行负责NXS基因表达或活性缺失或降低的NXS基因修饰的tilling筛选。针对给定植物物种，基于表1中列出的NXS DNA序列鉴定NXS基因修饰。本领域技术人员还熟悉tilling(McCallum et.al.(2000)Nature Biotechnology,18:455-457)和用于鉴定核苷酸变化(例如DNA测序等)的技术。
具有经修饰的NXS基因的植物是纯合的或通过本领域技术人员熟悉的自交、杂交或二倍体化单倍体技术变得纯合。然后对来自基于对NXS基因的修饰所选择的植物的种子批次测试它们在高温下萌发的能力。为了确认由NXS基因的修饰产生的在高温下萌发性状，在黑暗中进行萌发试验(参见实施例3)。属于具有经修饰的NXS基因和显著高于野生型种子批次的GT50 Dark的GT50 Dark的种子批次的种子被鉴定为本发明的植物。
实施例7
将本发明的性状转移到其他植物
将本发明的莴苣植物与没有显示本发明的性状的野生型莴苣植物杂交，本发明的莴苣植物由其NXS基因中的修饰是纯合的Burovia NXS突变体Ls_mt_bur的种子生长而成。
如实施例3A和3B所述测定所得F1种子的GT50Dark。F1种子与野生型植物的种子(例如该种子不能在高温下萌发)具有相同的GT50Dark。
从F1种子生长的F1群体中，选择了一株莴苣植物，其自交以获得F2植物群体。F2植物再次自交以产生F3种子批次。然后将这些F3种子批次在35℃下在黑暗中萌发。在大约四分之一的F3种子批次中，所测试的种子中没有种子萌发。在大约另外四分之一的F3种子批中，接近100％的所测试的种子萌发了，这表明突变的NXS等位基因以纯合状态存在于相应的F2母本植物中。在大约一半的F3种子批次中，约25％的被测试的种子萌发，表明突变的NXS等位基因以杂合状态存在于相应的F2母本植物中。F3种子批次的分离对应于本发明的性状的单基因隐性遗传。通过对相应的F2母本植物中的NXS基因测序证实了F3种子批次的分离。
然后从具有在相应的F2母植株中纯合存在的经修饰的NXS基因的F3种子批次生长F3植物。将该F3植物用于进一步杂交以将本发明的性状转移到其他莴苣植物。
以与上述莴苣相同的方式，可以从表1中列出的具有经修饰的直系同源物NXS基因的任何种类的植物将本发明的性状转移到相应的不具有本发明性状的野生型植物中。取决于植物物种，F2植物和较后的代需要自交或杂交以产生种子。本领域技术人员熟悉给定植物物种所需的自交和杂交步骤。此外，对于给定植物物种的本发明性状的分离比还取决于存在于物种基因组中的NXS基因的直系同源拷贝数。无论如何，本发明性状的分离仍应对应于单基因隐性遗传。
Figure IDA0001278058570000011
Figure IDA0001278058570000021
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Claims (17)

1.生产具有经修饰的NXS基因的莴苣(Lactuca sativa)种子的方法，其中所述经修饰的NXS基因包含导致在编码根据SEQ ID No.2的蛋白质的位置140上的提前终止密码子的SNP，或者其中所述经修饰的NXS基因包含导致在编码根据SEQ ID No.2的蛋白质的位置212上的脯氨酸置换成丝氨酸的SNP，或者其中用导致非保守氨基酸改变的任何其他氨基酸置换在编码SEQ ID No.2的NXS蛋白的位置175上的色氨酸残基，当在莴苣种子中纯合存在时，所述经修饰的NXS基因为该种子提供在高温下萌发的能力，所述方法包括从具有经修饰的NXS基因的莴苣种子生长莴苣植物，允许植物产生种子并收获那些种子。
2.权利要求1的方法，其中NXS基因的表达被显著降低或被阻止。
3.权利要求1的方法，其中与不具有经修饰的NXS基因的野生型种子相比，该种子具有降低的NXS蛋白水平、降低的NXS蛋白活性或完全不存在NXS蛋白。
4.权利要求1的方法，其中提前终止密码子是SEQ ID No.1的位置3018上的G>A SNP的结果。
5.权利要求1的方法，其中导致在编码根据SEQ ID No.2的蛋白质的位置212上的脯氨酸置换成丝氨酸的SNP是SEQ ID No.1的位置3518上的C>T SNP。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中种子属于种子批次，并且所述种子包含如权利要求1至5中任一项所定义的经修饰的NXS基因，当经修饰的NXS基因纯合存在于莴苣种子中时，经修饰的NXS基因给未引发状态的种子提供在高温下萌发的能力，并且所述种子批次的特征在于所述种子批次的GT50 Dark比不包含经修饰的NXS基因的种子的种子批次的GT50Dark高至少10℃。
7.权利要求6的方法，其中包含经修饰的NXS基因的种子的种子批次的GT50 Dark比不包含经修饰的NXS基因的种子的种子批次的GT50 Dark高10℃至25℃。
8.权利要求6的方法，其中包含经修饰的NXS基因的种子的GT50Dark为至少31.8℃。
9.权利要求6的方法，其中包含经修饰的NXS基因的种子的种子批次的GT50 Dark为28℃至40℃。
10.生产能够在高温下萌发的莴苣种子的方法，包括修饰种子的NXS基因以降低基因的表达水平、以阻止基因的表达和/或降低编码的NXS蛋白的活性，其中修饰NXS基因包括引入导致在编码根据SEQ ID No.2的蛋白质的位置140上的提前终止密码子的SNP，或者引入导致在编码根据SEQ ID No.2的蛋白质的位置212上的脯氨酸置换成丝氨酸的SNP，或者用导致非保守氨基酸改变的任何其他氨基酸置换在编码SEQ ID No.2的NXS蛋白的位置175上的色氨酸残基。
11.生产具有如权利要求1至5中任一项所定义的经修饰的NXS基因的莴苣植物的方法，其中当在莴苣种子中纯合存在时，所述经修饰的NXS基因为种子提供在高温下萌发的能力，所述方法通过使用二倍体化单倍体生成技术以产生包含高温萌发性状的二倍体化单倍体系。
12.生产杂交莴苣种子的方法，包括将第一亲本莴苣植物与第二亲本莴苣植物杂交并收获所得杂交种子，其中所述第一亲本植物和所述第二亲本植物是携带如权利要求1至5中任一项所定义的经修饰的NXS基因的至少一个等位基因的植物，其中所述经修饰的NXS基因包含导致在编码根据SEQ ID No.2的蛋白质的位置140上的提前终止密码子的SNP，或者其中所述经修饰的NXS基因包含导致在编码根据SEQ ID No.2的蛋白质的位置212上的脯氨酸置换成丝氨酸的SNP，或者其中用导致非保守氨基酸改变的任何其他氨基酸置换在编码SEQID No.2的NXS蛋白的位置175上的色氨酸残基。
13.生产具有如权利要求1至5中任一项所定义的经修饰的NXS基因的莴苣植物的方法，所述方法通过使用包含所述经修饰的NXS基因的莴苣种子生长所述植物。
14.用于生产具有如权利要求1至5中任一项所定义的经修饰的NXS基因的莴苣植物的方法，其中当在莴苣种子中纯合存在时，所述经修饰的NXS基因为该种子提供在高温下萌发的能力，所述方法通过使用组织培养物进行。
15.用于生产具有如权利要求1至5中任一项所定义的经修饰的NXS基因的莴苣植物的方法，其中当在莴苣种子中纯合存在时，所述经修饰的NXS基因为该种子提供在高温下萌发的能力，所述方法通过使用营养繁殖进行。
16.经修饰的莴苣NXS基因，其野生型的莴苣NXS基因被鉴定于SEQ ID No.1中，SEQ IDNo.1编码SEQ ID No.2的蛋白质，并且其中经修饰的基因如权利要求1至5中任一项所定义。
17.权利要求16的经修饰的莴苣NXS基因用于生产莴苣种子的用途，与不具有经修饰的NXS基因的野生型莴苣种子相比，该莴苣种子具有在高温下萌发的能力。
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