CN1203631A - 提高光合生物的蛋白质水平的结构和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的基因结构,它们能够提高植物细胞和其它光合成生物细胞的效率。本发明还提供了对蛋白质进行更高表达的转基因植物。同时,给出了在植物和其它光合成生物中提高质体蛋白数量的方法。

Description

提高光合生物的蛋白质水平的结构和方法
本发明的背景技术
所有的光合生物都是通过光合作用的捕获光的反应来提供能量，从而产生重要的生长和代谢化合物。光合生物产生的富含能量的碳水化合物、脂肪酸、基本氨基酸以及其它的化合物，是所有动物赖以生存的食物链的基础。光合生物还是大气中氧气的主要来源，并在该过程中对二氧化碳进行循环。因此，地球上的生命依赖的是光合生物，特别是植物。
植物的生产量受到各方面的限制，例如，资源的有限性以及植物对这些资源的利用能力等。光能转换成化学能需要复杂的系统将捕获光的色素结构和蛋白质结合起来。光能对植物的价值只有在其被光合作用有效地转换成化学能并被送入到各种生物化学过程中才可以得到实现。
负责将光转换成化学能量的光合反应的类囊体蛋白质器是叶绿体中最为复杂的机制，并且仍然是最为难以研究的生物系统之一。释放氧气的光合生物，例如，蓝细菌、藻类和植物，都具有两套光系统，即PSI和PSII，它们通过一系列的合作从水中获取电子并使它们的能级得到提高从而到达NADP+。然后，光合成产生的NADPH和ATP就被送到各种生物化学途径中。将这些电子推向更高能级的力量来自与这两个光系统有关的叶绿素100-300分子所吸收的能量。一对重要的叶绿素，即在每个光系统中心的分子调控着电子的运动。其余的叶绿素分子与蛋白质关联，然后组成获取光的天线，围绕着反应中心并向其传送光能[参见Green等人(1991)，TIBS 16：181]。
对光的吸收能力，特别是在阴凉处，主要依赖于类囊体膜上面的光获取复合体(Light Harvesting Complex，Lhc)的组成和大小。LhcII光获取复合体是叶绿素a/b结合蛋白质(Cab)的重要地方，对光系统II(PSII)起着天线的作用，并且在为了光合成进行的获取光的过程中起重要的作用[Kuhlbrandt，W.(1984)Nature 307：478]。植物可以根据可供生长的光的强度来调节天线的尺寸。在阴凉地方，通过降低1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rbc或Rubisco)的水平，氮气的分配从基质中的多肽转移到类囊体蛋白质。氮气的再次分配是对低照射的补偿反应，平衡光吸收及对二氧化碳的固定[Evans，J.R.(1989)Oecologia 78：9；Stitt，M.(1991)Plant，Cell and Environment 14：741]。
除了将氮气分配到不同的蛋白质中的这种转移之外，光合成生物还可以通过对光获取复合体的分子重组来适应低光亮的条件[Chowet al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：7502；Horton et al.(1994)Plant Physiol. 106：415；Melis，(1991)Biochim.Biophys.Acta.1058：87]。植物对光特性变化进行补偿所具有的重组能力决定其生产力。虽然存在着对低光亮条件的适应机制，但是，由于通过电子转移来产生ATP和NADPH的能力有限，所以，在不利光照条件下，植物生长中的光合成明显地降低[Dietz，K.J.and Heber，U.(1984)Biochim.Biophys.Acta.767：432；ibid(1986)848：392]。在这样的条件下，产生ATP和NADPH的能力，以及吸收力，将决定还原二氧化碳的能力。当光源有限时，植物将其光合成能力调整到最大；但是，这种适应能力是有限的，受到分子参数的限制，例如，基因表达，复合体的组合，以及基质和协作因子的来源等。
如果要提高植物和其它光合成生物的生产力，就必须要有提高光获取能力但又不限制二氧化碳固定能力的方法。
本发明概述
本发明提供嵌合性基因结构，它包括启动子区域，含有翻译促进子的5’未翻译区，对增强蛋白质输入的质体特异性转运肽编码的DNA，编码质体蛋白质的基因，含有功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区。该结构产生高水平的功能性蛋白质的表达和对其功能位点的输入。
在本发明的一个实施方案中，启动子是35S花椰菜镶嵌病毒(CaMV)启动子。在本发明的另一个实施方案中，转译增强子来自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的豌豆小亚单位的5’未翻译区。在另一个实施方案中，编码蛋白质的基因是豌豆cab基因，编码叶绿素a/b结合蛋白质。在另一个实施方案中，含有功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区来自豌豆cab基因。
本发明还提供了提高光合植物和光合生物的获取光的能力的方法，包括制备基因结构，它包括启动子，含有转译增强子的5’未翻译区，对增强蛋白质输入的质体特异性转运肽编码的DNA，编码质体蛋白质的基因，优选编码叶绿素a/b结合蛋白质的结构基因，含有功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区；将该基因结构插入到适宜的克隆载体中；用该重组的载体对光合植物或其它的光合生物进行转化。另外，该基因结构被直接涂敷到生物颗粒中，并用该颗粒直接对细胞进行攻击。
本发明提供DNA结构，其可以提高质体中，特别是叶绿体中，或光合原生体细胞中的一种或多种蛋白质的数量。这些结构可以改变光合成器，提高植物获取光的能力，特别是在低光照的条件下。
本发明还提供在植物或其它光合成生物中提高光合作用中对光的获取效率以及提高光合成产物(例如糖类)的产量的方法。这些方法可以用于提高植物和种子的商业价值，还可以用于提高发酵和植物组织培养所产生的产物。
本发明还提供含有上述结构的转基因植物(TR)和转基因光合成生物。这些转基因植物和转基因光合成生物具有被提高了的光合成能力和生长能力，可以用于提高产量，组织培养，发酵和再生等方面。与野生型植物(WT)相比，本发明的转基因植物表现出了高产，色素增强，糖含量高，生物质高，生长更均匀，果实更大，茎围大，光合成强，发芽快，对移植的承受力更强等特点。本发明还提供了这些植物产生的种子，以及这些植物的局部组织，用于生产再生的植物和其它的副产品。
附图的简要说明
图1A-1B是AB80(豌豆I型LhcIIb基因)(序列号：1)的核苷酸序列，以及由序列号1所编码的氨基酸序列(序列号：2)
图2是载体pSSTP的结构图。
图3是载体pRBCS-CAB的结构图
图4是载体pCAMV-RBCS-CAB的结构图。
图5是土壤杆菌双连载体(pEND4K-CAMV-RBCS-CAB)的结构图。
图6是土壤杆菌双连载体pEND4K的限制性酶切图谱。
图7A-7C表示在转化的和野生型烟草植物中的稳定态转基因转录水平。图7A表示在原始转化物的T1种子衍生的植物中的转基因mRNA的水平。图7B表示在选择的具有高水平可自体交叉和可供分离分析的转基因转录的T1植物中的转基因mRNA的水平。所得到的纯合子的线被用与图7A相同的方式检验。图7C表示在转化的(TR)和野生型(WT)烟草植物中稳定态Cab蛋白质的水平。
图8A-8C表示野生型和转化烟草植物的生长和形态特征(图8A，分别列在左边和右边)。野生型和转化株的各自的第7片完全发育的叶片被用来比较它们的尺寸(图8B)以及横切面(图8C)。
图9是在固体MS介质中4天后转基因发芽(上面一排)和对照发芽(下面一排)的比较。
图10是转基因和对照野生型烟草愈伤组织在同一时间的生长的比较。
图11是野生型和转基因烟草叶的叶肉组织(左边)和叶绿体(右边)的电镜比较。
图12是在两种不同光强下种植的野生型()和转基因(●)植物的光合成氧气释放对光的反应曲线。(A)500μmol/m2/s(定为低)，(B)500μmol/m2/s(定为高)。
图13A-13D表示对于野生型()和转基因(●)植物的在空气中的光反应曲线，对qP为图13A，对qN为图13B，对Fv/Fm为图13C，对PSII为图13D。
本发明的详细描述
本发明涉及DNA结构，该结构在被整合到植物或光合成生物中后，提高质体或光合成细胞的效率。本发明还涉及通过对蛋白质表达和输入的增强来提高或改善质体代谢的产物的方法。本发明还涉及转基因的植物，种子，植物细胞和组织，以及其它的结合有这些DNA结构的光合成生物。
本发明的DNA结构包括启动子，含有转译增强子的5’未翻译区，对可以增强和引导基因产物到达质体或光合成器的质体特异性转运肽进行编码的DNA，编码质体蛋白质的基因，含有功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区。插入这种结构，可以提高质体和光合成器对蛋白质的表达和输入。这些元件一般都在转录的从5’到3’方向上作为可以结合的组成部分而得到提供。本发明的一个优选的实施方案是这样的结构，含有5’组成型启动子(例如，35S花椰菜镶嵌病毒启动子)，包含由序列号3的1-29残基核苷酸序列组成的转译增强子的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的豌豆小亚单位的5’未翻译区，对来自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的豌豆小亚单位的转运肽编码的DNA，对叶绿素a/b结合蛋白质编码的结构基因，以及含有来自豌豆cab基因的功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区。
这种新基因结构的组成可以同时达到高水平的转录，高水平的翻译，更好的mRNA稳定性和高水平的蛋白质对生物光合成器或质体的输入，从而在植物或其它光合成生物中对选择的蛋白质(例如，在此为光捕获Cab蛋白质)的大量生产。这种多层次的基因结构，特别是对蛋白质输入的增强，可以被广泛地用于提高对任何蛋白质的输入和表达。由给出的基因结构所代表的基因结构可以获得在其功能位点的对功能性蛋白质(叶绿素a/b结合蛋白质)的高水平的输入和表达。
光合作用过程中的许多不同的蛋白质和多肽的活性都可以通过本发明的方法得到增强。除了提高对内源性蛋白质的水平之外，本发明的DNA结构还可以在植物或其它的光合成生物的光合成器中对外源性蛋白质进行输入和表达。此外，这些DNA结构可以含有一个信号蛋白质编码区，也可以含有另外的编码区，从而对多个蛋白质进行输入和表达。因此，植物和光合成生物细胞的质体可以被修饰以增强光合作用中对光的捕获和/或改变光合作用暗反应的产物种类或水平。
为了产生本发明的嵌合性结构，将对适宜的Rbcs和I型LhcIIb Cab的蛋白质进行编码的序列结合起来得到有效的嵌合性Rbcs-Cab编码区。含有本发明的基因结构的转基因烟草植物可以大量生产LhcIIb的I型Cab并具有增强了的低光强光合成活力和生长能力。这些转基因植物还表现出在形态上、发育上、生物化学上、或生理上的一种或一种以上的改变。对农作物来讲，这些改变可以增加其商业价值，优选的是快速发芽和生长，高产和改善外观。通过本发明的新的基因结构对蛋白质的输入和表达的提高，可以获得这些所需的改变。通过将Rbcs-Cab基因结构连接到强力CaMV 35S启动子上，可以促进从头的转录水平的表达。更进一步，提高mRNA的稳定性，可以提高稳定态转基因转录群体的力度。这是由于引入了cab基因的3’未翻译的核酸序列以及编码Rbcs转运肽的核酸编码序列。这两个核酸序列都对提高mRNA稳定性起着重要的作用。对更高水平的蛋白质转译及合成的获得是因为引入了含有转译增强子的Rbcs5’未翻译序列，从而提高了输入到质体内部的蛋白质前体的数量。加入到类囊体膜和LhcIIb复合体中的Cab水平由于使用了更为有效的转运肽而进一步得到了提高。将I型LhcIIb Cab转运肽替换为1，5-二磷酸核酮糖羧化酶可以提高对叶绿体的输入。在叶绿体内的I型LhcIIb Cab的含量可以使LhcIIb天线结合更多的蛋白质，结果是天线的尺寸被增大。任何能够通过替代Cab转运肽来提高叶绿体内I型LhcIIb Cab的转运肽都可以产生类似的提高效果。通过使用效率更低的转运肽来调控蛋白质的表达数量可以得到更低水平的蛋白质输入。本文中给出的实施例表明由于有Rbcs转运肽的存在，众多的以质体为目标的蛋白质前体的输入可以得到提高，并且可能代表着迄今为止被特征化了的最为有效的转运肽。
术语“启动子”或“启动子区”指的是一种DNA序列，通常在结构基因的编码区的(5’)上游，它通过对RNA聚合酶或其它的任何在正确位点开始转录所需的因子提供识别和结合位点来控制编码区的表达。
启动子一般分为两类，即诱导启动子和组成性启动子。术语“组成性启动子”在本文中并不一定指某个基因在所有类型的细胞中都以同一水平被表达，而是指基因可以在众多种类的细胞中被表达，虽然通常都可以察觉到含量上的不同。
术语“诱导性启动子”是由于对诱导物反应而直接或间接地激活一种或一种以上DNA序列或基因的转录的启动子。在没有诱导物存在时，该DNA序列或基因将不被转录。一般而言，与诱导性启动子特异性结合并激活转录的蛋白质因子(或多个蛋白质因子)是以非活化形式存在的，然后由于诱导物而直接或间接地被转变为活化形式。诱导物可以是化学试剂，例如，蛋白质，代谢物，生长调节剂，杀草剂和酚类化合物，也可以是由于热、冷、盐、或毒性物产生的生理压力，还可以是病源或致病物如病毒的作用而间接地产生。诱导物还可以是照射剂，例如，光、黑暗、不同的光的方面，例如，波长、强度、方向和期限。含有诱导性启动子的植物细胞可以通过将诱导物从外部施加而与其发生接触，例如喷洒、浇灌、加热或类似方法。如果需要在植物生长期间的特定时间激活基因的表达，可以在那个时候施加诱导物。
这种诱导性启动子的例子包括热冲击启动子，如黑腹果蝇(Drosphilia melanogaster)的诱导性hsp70热冲击启动子[Feeling，M.et al.(1985)Ann.Rev.of Genetics 19：297-323]；冷诱导性启动子，如来自B.napus的冷诱导性启动子[White，T.C.et al.(1994)PlantPhysiol.106：917]；以及由乙醇诱导的醇类脱氢酶启动子[Nagao，R.T.et al.，Miflin，B.J.，Ed.Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology，Vol.3，p 384-438，Oxford University Press，Oxford 1986]。
在已知的提供对组成性基因进行表达的序列中，有与土壤杆菌基因，例如，胭脂碱合成酶基因(Nos)、Mas基因、Ocs基因相关的调节区，以及对病毒基因表达进行调控的区域，例如，花椰菜镶嵌病毒(CaMV)的35S基因区和19S基因区[Brisson et al.(1984)Nature310：511-514]，以及TMV的涂敷启动子[Takamatsu et al.(1987)EMBO J.6：307-311]。
其它有用的植物启动子包括在植物的韧皮部和维管部高度表达的启动子，例如谷氨酰胺合成酶启动子[Edwards et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3459-3463]，玉米蔗糖合成酶1启动子[Yang et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：4144-4148]，来自Ri质粒的TLDNA的Rol-C基因的启动子[Sagaya et al.，Plant Cell Physiol.，3：649-653]，以及pRVC-S-3A启动子的韧皮部特异性区域[Aoyagi etal.，Mol.Gen.Genet.，213：179-185(1988)]。另外，植物启动子，例如Rbcs启动子的小亚单位[Coruzzi et al.，EMBO J.，3：1671-1679(1984)；Broglie et al.，Science，224：838-843(1984)]，或热冲击启动子，例如大豆HPS17.5-E或HPS17.3-B[Gurley et al.(1989)Mol.Cell.Biol.6：559-565(1986)]也可以被使用。
可以用于本发明的其它的启动子包括：低温和ABA-反应性启动子Kinl，cor6.6[Wang et al.(1995)Plant Mol.Biol.28：605；Wang and Cutler(1995)Plant Mol.Biol.28：619]；来自麦子EM基因的ABA诱导性启动子[Marcotte Jr.et al.(1989)Plant Cell 1：969]；来自拟南芥的韧皮部特异性蔗糖合成酶启动子ASUS1[Martin et al.，(1993)Plant J.4：367]；根和枝的启动子ACS1[Rodrigues-Pousada et al.(1993)PlantCell 5：897]；来自玉米的种子特异性的22kDa的玉米醇溶蛋白质启动子[Unger et al.(1993)Plant Cell 5：831]；在豌豆中的ps1凝集素启动子[de Pater et al.(1993)Plant Cell 5：877]；来自(Phaseolusvulgaris)的phas启动子[Frisch et al.(1995)Plant J.7：503]；晚期胚胎lea启动子[Thomas，T.L.(1993)Plant Cell 5：1401]；来自西红柿的对水果为特异性的E8基因启动子[Cordes et al.(1989)Plant Cell1：1025]；对分生组织为特异性的PCNA启动子[Kosugi et al.(1995)Plant J.7：877]；对花粉为特异性的NTP303启动子[Weterings et al.(1995)Plant J.8：55]；对阶段为特异性的晚期胚胎发生OSEM启动子[Hattori et al.(1995)Plant J.7：913]；针对保卫细胞和茎薄壁组织细胞为特异性的ADP葡糖焦磷酸酶启动子[Muller-Rober et al.(1994)Plant Cell 6：601]；Myb传导性组织特异性启动子[Wissenbach et al.(1993)Plant J.4：411]；以及来自拟南芥的质体蓝素启动子[Vorst et al.(1993)Plant J.4：933]。
本发明的基因结构中，还包括5’未翻译前导序列，它起着转译增强子的作用。对编码序列的有效翻译可能需要特异性的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。起始密码子必须与编码序列的解读码一致才可以保证对序列的转译。转译控制信号和起始密码子的来源不限，可以是天然的或人工的。转译控制信号和起始密码子可以从转录起始区来，也可以从结构基因来。该序列还可以从选择用来表达基因的启动子衍生而来，并可以被特异性地修饰来提高对mRNA的转译。
本发明的转译增强子的例子之一是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的豌豆小亚单位的5’未翻译区。作为前导子和5’未翻译区而已经被报导过的其它表现出转译功能增强活性的核酸序列有来自亚铁素(ferrodoxin)结合蛋白基因psaDb[Yamamoto et al.(1995)J.BiolChem.270：12466]，铁氧还原蛋白[Dickey et al.(1994)Plant Cell6：1171]，从西红柿镶嵌病毒(TMV)来的68碱基对前导子[Gallieet al.(1987)Nucleic Acids Res.15：3257]，和来自苜蓿镶嵌病毒的36碱基对的前导子[Jobling et al.(1987)Nature 325：622]。这些转译增强子可以在本发明中替代Rbcs转译增强子信号。在大多数其它的基因中，转译增强活力很可能存在于5’未翻译核酸序列中[参见Gallie的回顾文章：1993 Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.44，77]。这些核酸序列一旦表现出含有转译增强效应，就可以被用于本发明。表现出适宜的转译增强效果的转译增强子可以用来在本发明的结构中获得适宜水平的转译增强。
本发明的基因结构还包括转运肽。术语“转运肽”指的是能够引导胞内运输将参与的蛋白质送到植物宿主细胞的质体中的肽。被运输的蛋白质可以是对转运肽为均质的或异质的。虽然植物细胞中很可能含有各种的质体，例如，造淀粉粒、有色体、白色体等，但是，最主要的是叶绿体。本发明的转运肽指的是可以对叶绿体和其它的质体提供胞内运输的转运肽。在很多情况下，转运肽还可以含有进一步的质体细胞器内针对功能位点的定靶信息，这些功能位点举例有胞质外膜和胞质内膜、基质、类囊体膜、以及类囊体腔。根据转运肽的来源，前体蛋白可能在重要的行为和输送活力上，例如在效率上表现出差异。这些在输送行为上的差异并不是完全由转运肽的功能引起的，被运送的蛋白质也造成一定影响，例如，很可能这两种蛋白质之间发生相互作用也产生影响[Ko and Ko，1992 J.Biol.Chem.267，13910]。在光合成原核生物中，例如在蓝细菌中，蛋白质可以被送到光合成膜或原生质膜上，也可以被送到涉及糖的还原和光合成产物形成的生物化学反应途径中。
捕获光的叶绿素a/b蛋白质复合体的组分多肽的转运肽是富含丝氨酸的，特别是在靠近NH2终端处，其中前13个氨基酸残基中的7个都是丝氨酸。对来自豌豆的Rbc的小亚单位的转运肽也在靠近NH2终端处有着丰富的丝氨酸[Cashmore，A.R.，Genetic Engineering ofPlants，Eds.Kosuge，T.et al.(Plenum Press，New York，pp.29-38(1983)]，大豆[Berry-Lowe，S.L.et al.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：483-498]，以及Chlamydomonas[Schmidt，G.W.et al.(1998)J.Cell Biol.83：615-623)]。捕获光的叶绿素a/b蛋白质复合体的转运肽，以及Rbc的小亚单位的转运肽的功能都是特异性地对贯穿叶绿体被膜的多肽进行运输。然而，这些多肽的最终目的地却是完全不同的，捕获光的叶绿素a/b蛋白质复合体到达叶绿体的类囊体的整合膜蛋白，而Rbc小亚单位到达叶绿体基质成为溶解蛋白的成分。
在一个实施方案中，转运肽来自Rbc小亚单位。在类囊体膜上和在LhcIIb复合体上加载的Cab水平被用更为有效的异源性转运肽来进一步提高。用1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亚单位来替代I型LhcIIbCab转运肽，提高了运送到叶绿体的Cab水平。在叶绿体内的I型LhcIIbCab成分的提高，使LhcIIb天线可以和额外的蛋白质结合，结果是天线的尺寸增大。
对被转录和被整合到光合成生物或细胞中的蛋白质的基因并不受到具体的限制。本领域的技术人员将可以明察到其它的色素(例如藻胆蛋白)和色素结合蛋白(例如类胡萝卜素结合蛋白)的编码基因也可以被用来提高捕获光的反应效率。很多光合成反应都可以被类似地增强。例如，在对电子运输中涉及的ATP合成酶的亚单位和铁氧化还原蛋白编码的基因都可以被整合本发明的基因结构中来提高对电子的运输。另外，对丙酮酸激酶、乙酰辅酶A羧化酶、和酰基载体蛋白进行的表达和运输也可以得到增强，从而扩展了生物合成的途径，例如，扩展了碳/脂肪的代谢。
任何对叶绿素a/b结合(Cab)蛋白进行编码的基因都可以被选作结构基因。叶绿素a/b结合蛋白包括四种不同的LhcI，即LhcII的I-III型，CP29，CP26，CP24，和早期光诱导蛋白质[Green B.R.(1991)Trends Biochem.Sci.16：181-186]。它们包括对可能属于复合体LhcIIa、LhcIIb、LhcIIc、LhcIId、LhcIIe、和任何其它的未被特征化的LhcII亚复合体的叶绿素a/b结合蛋白进行编码的基因和cDNA。同样的基因结构还可以被用于对LhcI的叶绿素a/b结合蛋白进行编码的基因和cDNA，包括光合系统I的LhcIa、LhcIb、和LhcIc的叶绿素a/b结合蛋白。
LhcII是最主要的复合体，含有的叶绿素a/b结合蛋白家族中的大多数的成员，占有大约生物球中叶绿素总量的50％，占有绿色植物中叶绿素b的大多数。因此，对LhcII叶绿素a/b结合蛋白编码的基因将是以提高叶绿素a/b结合蛋白数量为目标的优选基因。
在迄今为止所检验过的植物中，LhcII的叶绿素a/b结合蛋白都是由多成员基因家族来编码的，包括至少5种拟南芥基因，6种烟草基因，8种N.plumbaginifolia基因，以及多至15种的西红柿基因[Jasson，S.et al.(1992)Plant Mol.Biol.Rep.10：242-253]。因此，这些基因中的任何一种都可能适宜于提高叶绿素a/b结合蛋白的数量。表1提供了更为全面的编码叶绿素a/b结合蛋白的基因的清单，包括那些存在于核酸数据库中的如Jasson等人在同上的文献中的表2中所揭示的基因。
                                                                         表1
                                                编码叶绿素a/b结合蛋白的基因以及同叶绿素-蛋白质复合体的关系
                   基因生产/色素-蛋白质复合体
    基因 Green等人，1991年16期Trends Biochem Sci..181页 Thornber等人，1991年 Bassi等人，1990年               文献(基因)             文献(蛋白质)
    Lhca1 LhcI的I型 Lhc Ib LhcI-730  Hoffman等人，1987Jansson & Gustafsson，1991Palomares等人，1991  Ikeuchi等人，1991Knoetzel等人，1992
    Lhca2 LhcI的II型 Lhc Ia LhcI-680  Stayton等人，1987Pichersky等人，1988Jansson & Gustafsson，1991  Ikeuchi等人，1991Knoetzel等人，1992
    Lhca3 LhcI的III型 Lhc Ia LhcI-680  Pichersky等人，1988Jansson & Gustafsson，1991  Ikeuchi等人，1991Knoetzel等人，1992
    Lhca4 LhcI的IV型 Lhc Ib LhcI-730  Schwartz等人，1991aZhang等人，1991  Ikeuchi等人，1991Schwartz等人，1991aKnoetzel等人，1992
    Lhcb1 LhcII的I型 Lhc IIb     28kDa LhcII  Chitnis & Thornber，1988*  Jasson等人，1990Green等人，1992
    Lhcb2 LhcII的II型 Lhc IIb  27kDa LhcII  Chitnis & Thornber，1988*  Jasson等人，1990Green等人，1992
    Lhcb3 LhcII的III型 Lhc IIb  25kDa LhcIIa  Schwartz等人，1991bBrandt等人，1992  Bassi & Dainese，1990Morishige & Thornber，1991Bassi & Dainese，1992Green et al.，1992
    Lhcb4 CP29的II型 Lhc Iia CP29  Morishige & Thornber，1992  Henrysson等人，1989Pichersky等人，1991Morishige & Thornber，1992
    Lhcb5 CP29的I型 Lhc IIc CP24  Pichersky等人，1991Sorensen等人，1992  Pichersky等人，1991Morishige & Thornber，1992
    Lhcb6 CP24 Lhc IId LhcI-730  Schwartz & Pichersky，1990  Morishige等人，1990Spangfort等人，1990
*因为已经有众多的这些类的基因被克隆和序列化了，所以给出下面的文献作参考。文献：Green et al.1991， Trends Biochem.Sci.16，181.Thornber et al.1991，In：Chlorophylls.Scheer，H.(ed) CRC Press pp.549-585.Bassi et al.1990，Photochem.Phototbiol.52，1187.Hoffman et al.1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，8844.Jansson & Gustafsson，1991，Mol.Gen.Genet.229，67.Palomares et al.1991，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.11，151.Ikeuchi et al.1991，Plant Cell Physiol.32，103.Knoetzel et al.1992，Eur.J.Biochem 206，209.Stayton et al.1987，Plant Mol.Biol.10，127.Pichersky et al.1988，Plant Mol.Biol.11，69.Pichersky et al.1989，Plant Mol.Biol.12，257.Schwartz et al.1991a，FEBS Lett.280，229.Zhang et al.1991，Plant Physiol 96，1387.Chitnis and Thornber，1988，Plant Mol.Biol.11，95.Jansson et al.1990，Biochim.Biophys.Acta.1019，110.Green et al.1992，FEBS Lett.305，18.Schwartz et al.1991b，Plant Mol.Biol.17，923.Brandt et al.1992，Plant Mol.Biol.19，699.Bassi & Dainese，1990，In：Current Research in PhotosynthesisVol II，Baltscheffsky，M.(ed.)pp.209-216.Morishige & Thornber，1991，FEBS Lett.293：183.Bassi & Dainese，1992，In：Regulation of chloroplast biogenesisArgyroudi-Akoyonoglou，J.(ed.)，pp.511-520.Morishige & Thornber，1992，Plant Physiol.98，238.Henrysson et al.1989，Biochim.Biophys.Acta.977，301.Pichersky et al.1991.，Mol.Gen.Genet.227，227.Sorensen et al.1992，Plant Physiol.98，1538.Schwartz & Pichersky，1990，Plant Mol.Biol.15，157.Morishige et al.1990.FEBS Lett.264，239.Spangfort et al.1990.In：Current Research in Photosynthesis.Vol II，Baltscheffsky，M.(ed.)pp.253-256.
由ICABPSII编码的PSII的Cab蛋白质是与PSII有关的捕获光的主要天线，含有成熟的细胞质中总叶绿素的40-60％[Boardman et al.(1978)Current Topics in Bioenergetics，8：35-109]。进而言之，在PSII内，I型和II型的Cab蛋白质之间有很高的序列同源性[Pichersky etal.(1989)Plant Mol.Biol.12：257]。因此，对这个基因的改造将显著地改变叶绿素的成分。
可以用于本发明的编码a/b结合蛋白的基因包括：
a)捕获光的复合体I——光系统I，例如Lhca1型，PSI的主要
  Cab蛋白质，例如Lhca1*1[Hoffman et al.(1987)Proc.Natl.
  Acad.Sci.USA 84：8844]；Lhca2；Lhca3 III型；PSI的主要
  Cab蛋白质，例如Lhca3*1[Pichersky et al.(1989)Plant.Mol.
  Biol.12：257]；Lhca4；以及
b)捕获光的复合体II——光系统II，例如Lhcb1；Lhcb2 II型，
  主要的Cab蛋白质，例如Lhcb2*1[Pichersky et al.(1987)Plant
  Mol.Biol.9：109]；Lhcb3 III型，主要的Cab蛋白质，例如
  Lhcb3*1[Schwartz et al.(1991)FEBS Lett.280：229]；Lhcb4；
  Lhcb5；以及Lhcb6。
在本发明的一个实施方案中，使用了从豌豆(Pisum sativum)分离出来的对光捕获叶绿素a/b蛋白复合体的组成多肽编码的核酸基因(Lhc IIb的I型)[Cashmore，A.R.(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：2960-2964]。在另一个实施方案中，所选择的cab基因可以代表剩下的两种LhcIIb蛋白或其它的LhcIb主要蛋白。因为这两种蛋白是主要的光捕获复合体LhcIIb的组成成分，所以，它们可能在低光条件下起着重要的作用，并且是优选的。LhcIb复合体是光系统I的主要复合体，其组成包括两种Cab蛋白质，即LhcIb Cab的I型和II型。
本发明的基因结构进一步包括3’未翻译区。术语“3’未翻译区”指的是基因中的这样一个部分，它含有具备多聚腺苷酸化信号的DNA片段，并且可以含有其它的能够影响mRNA加工、mRAN稳定性、以及基因表达的调节信号。多聚腺苷酸化信号的一般特征是给3’终端的mRAN前体开辟额外的多聚腺苷酸的通道。多聚腺苷酸化信号一般的识别是存在有与正宗的5’AATAAA-3’的同源性，虽然各种变化还是比较常见的。
适宜的3’区的例子有3’转录的未翻译区域，含有土壤杆菌肿瘤引发(Ti)质粒基因，例如Nos基因，以及植物基因，例如大豆储存蛋白基因和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亚单位基因。其它适宜的3’序列可以从任何被特征化的植物或其它生物如动物的基因中衍生出来，只要它们在转基因植物细胞或光合成生物的细胞环境下能正常发挥功能就可以。在本发明的另一个实施方案中，3’未翻译区来自本发明结构的结构基因。
当在本发明中谈到具体的序列时，应当理解的是，这些序列包括与其“基本相似”的具体序列。当在一定长度的分子内有至少约80％，优选至少约90％，最优选至少约95％的核苷酸相互对应时，就可以说它们是“基本相似”的序列。“基本相似”的序列包括经过修饰后，与本发明的序列相比发生了替代、消除、和增加了核苷酸的序列，特别是由于遗传密码的简并产生的替代并具有相似特征(例如，功能)的序列。基本相似的DNA序列可以在高度严紧条件和中度严紧条件下用杂交方法来鉴定和分离，例如，选择使核酸不发生非互补序列杂交的条件。杂交的“严紧条件”是本领域的术语，指的是杂交的温度和缓冲液的条件，即该条件使两个核酸序列杂交时，其中的一条可以与另一条完全互补，或者两条核酸虽然不是完全互补，但是有着相当程度的互补性。“高度严紧条件”以及“中度严紧条件”对核酸杂交来讲，都在《现行分子生物学教程》的第2.10.1-2.10.16页和第6.3.1-6页中给予了解释[Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F.M.et al.，Vol.1，含有截止1995年的第29次补充)]，这些教导都通过在此引述而合并于本文。
为了帮助对转基因植物的鉴定，可以对本发明的基因结构做进一步的修饰来包含植物选择标记的编码基因。可用的选择标记包括提供对抗生素例如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等抗性的酶。类似地，还可以使用生产可被鉴别的化合物的酶，例如造成颜色改变或荧光的化合物，比如GUS(β-葡糖苷酸酶)，虫荧光素酶等。
本发明的基因结构可以通过病毒或细菌的感染来引入到植物细胞中，也可以通过物理或化学方法直接引入。间接引入(感染方式)和直接引入方法包括Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、微注射、电穿孔等方法。对这些技术的回顾文章请参见Weissbach和Weissbach的文章《植物分子生物学方法》[Weissbach and Weissbach，Methods forPlant Molecular Biology，Academic Press，New York，Section VIII，pp.421-463(1988)]；以及Grierson和Corey的文章《植物分子生物学》[Grierson and Corey，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Backie，London，Ch.7-9(1988)]。术语“转化”在本文中指的是用任何上述方法将基因结构插入到植物细胞或光合成生物的细胞中。
从植物细胞来再生整株植物的方法是本领域已经知道的方法[参见Plant Molecular Biology Manual，Eds.S.G.Gelvin and R.A.Schilperoort，Kluwer Acad.Publishers，Amsterdam(1988 and supplementsthrough 1993)]，获得被转化的和再生的植物的方法对本发明来讲不是十分重要的。一般而言，被转化的植物细胞在适宜的培养基中生长，培养基中可以含有选择剂例如抗生素，并用选择性标记物来帮助鉴别被转化的植物细胞。一旦愈伤组织形成，可以根据已知的方法加以适当的植物激素来促进苗的生长，然后，将苗转移到根培养基中来再生植物。这些植物可以用来重复地再生，通过种子或使用无性繁殖技术都可以。
本发明的另一部分是含有本发明的核酸结构的植物和其它的光合成生物。适宜的植物包括植物纲中的单子叶植物和双子叶植物，以及裸子植物和低等植物(例如，蕨类，苔藓)，和地衣植物。优选的单子叶植物的例子有稻子、麦子、燕麦和高粱。优选的双子叶植物的例子有豌豆、大豆、葵花、烟草、棉花、甜菜、牵牛、西红柿、花茎甘蓝、生菜、苹果、李子、柑橘、柠檬、和玫瑰等。其它的光合成生物也可以被用做本发明基因结构的宿主，包括单细胞的原核生物和多细胞的藻类，例如，Porphyra sp.，Chondrus crispus，Gigartina sp.，Eucheuma sp.，Laminaria sp.，Macrocystis sp.，Nereocystis leutkeana，Chlamydomonas reinhardtii，Chlamydomonas moewusii，Euglene gracilis，Cryptomonasφ和Ochromonas sinensis。本发明还包括缺少质体但是含有光合成器的原核生物，例如蓝绿藻，以及光合成微球，如Anacystisnidulans，Spirulina sp.，Synechococcus sp.，Rhodobacter sphaeroides，Rhodobacter capsulatus，Chloroflexus aurantiacus，和Heliobacteriumchlorum。本领域的人员都知道，上述的例子都不是限定性的。
根据本发明，转基因植物可以提供植物的局部来对含有本发明所述的基因结构的细胞和组织进行再生和组织培养。用以达到这个目标的植物局部包括叶子、茎、根、花、组织、上胚轴、分生组织、下胚轴、子叶、花粉、子房、细胞、原生质，或其它可以用来再生转基因植物、细胞、原生质和组织培养的植物局部。
本发明还提供转基因植物的种子，它们可以被用来制备更多含有本发明基因结构的植物。如果这些后代含有本发明的基因结构，则不论它们是纯种或是与其它的植物交叉繁殖的，都包括在本发明之中。
本发明的基因结构提供了对农作物进行基因改造的材料和方法，使它们的产量和经济价值被明显提高。农业生物学技术和农业产业的大部分实验策略都是对准提高农作物的产量和使单位面积农田获得最大的回报。虽然优选的方法是提高直接产量，但是，生产率也可以通过间接的方法得到提高，例如减少投入(如减少使用的肥料和水)，或者减少由于疾病、虫害和竞争造成的损失。这些间接的结果可以通过将新的可以降低对肥料的需求、提供抗病性、排斥有害昆虫、或忍受除草剂的特征整合到农作物中来实现。对生产率的提高还可以通过改善植物对不利环境因素的适应力来实现。通过分子生物学的方法或杂交还可以将这些特征结合起来，获得对生产率的进一步提高。
大多数的直接或间接的对光合成的分子学改良的结果都是抑制了光合作用。对这些研究的回顾可以参见Furbank和Taylor(1995)以及Stitt和Sonnewald(1995)的文章[Furbank and Taylor(1995)PlantCell 7：797 and Stitt and Sonnewald(1995)Ann.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.46：341]。使用这些方法主要涉及通过反义转基因产生了对光合成有关途径的酶的抑制。Ko等人介绍了对西红柿的有益功能的改善[Ko et al.(1992)Research in Photosynthesis Vol III：Proceedings ofthe IXth International Congress on Photosynthesis，Ed.N.Murata.KluwerAcademic Press，pp 445-448]。
光捕获复合物的结构多样性和所涉及的Cab蛋白质表明，在不同的光捕获复合物/蛋白质之间的分子关系是植物对光条件改变的适应力的关键机制之一。例如，能够造成对低光条件的重新安排结构的现象就很可能是增大光捕获复合物来增大天线的尺寸和表面积来捕获更多的光。大的天线可以捕获更多的光来用于转换为化学能。因此，增强植物对不同光条件而重新安排光捕获器的反应灵活性就可以给植物带来有益效果。对这种灵活性的限制可能归咎于植物中对功能性Cab蛋白质的表达水平的限度；因此，提高Cab蛋白质的水平就可以解轻这个限制。减轻这种分子水平的限制可以造成光合作用和相关活力及过程的显著变化，提高生产率，使农作物和产品的市场价值和常量得到提高。例如，针对提高光合作用的基因修饰在不论各种环境条件如光条件所找成造成的极限如何恶劣时都需要使作物生产有利可图的情况下就是十分重要的。对光合作用以及相关活性的提高还可以通过对能量的提供来产生对非植物产物，例如健康产物的生产起着重要的影响。这种直接基因修饰方法是多样化的，无法以单一经济价值来评估。这些工作产生的影响可以是巨大的，包括从对作物生产力的提高直到减少温室作物生产所需的光的要求而产生的间接节省。本发明的技术不仅对农作物有效，而且还可以使用在园艺植物上，包括室内植物、果园植物和装饰植物。由于对光合作用过程的普遍性被提高，本发明的技术就非常可能对所有光合成生物和各种植物都适用并带来有益效果。除了对光合作用以及相关的活性的理解得到更进一步的提高之外，本发明对农作物和园艺学所带来的有益效果主要有以下四个方面：
1)改善植物产物的商业价值(例如，植物颜色更绿)；
2)改善在低光条件下的生产力；
3)改善植物密度；以及
4)改善产量。
将基因转移到植物细胞逼供内从转化的细胞再生完整和可繁育的植物的技术的发展，提供了对某些分子学参数进行修饰来提高植物在低光条件下的光合作用能力的方法。对光合系统II的捕获光的天线的功能性Cab蛋白质的增强和产量的提高，可以使植物识别和捕获更多的光来进行光合作用。对光合作用产生正面效果的修饰可以产生新的所需要的特性并对农业和园艺业带来广泛的益处。这些在遗传工程植物中的新的特性可以对大田作物、温室植物、以及其它的任何培育形式的植物的带来未经修饰的常规植物所不具有的好处。有益的特征还可以通过传统培育方法来提供任何所需的重组植物品系，例如提供优良品系，并使其除了具有所需的农业经济重要的表型之外还带有新的特征。
特别是，提高质体中叶绿素结合蛋白可以使质体中叶绿素的含量更高。颜色更绿的植物在园艺学上具有更好的商业价值，在生产家用和花园用的盆栽植物和室外园艺用植物中都是如此。由于引入本发明的基因结构而产生的对植物的颜色和生长的改进，就可以在所有的植物中产生更为优异的表型，包括草坪、地被植物、花卉、蔬菜、树木和灌木等。更进一步，提高叶绿素的水平还可以使新鲜的和干燥的植物产物在收获后保持更好的颜色。提高类胡萝卜素和藻胆蛋白这些色素的水平也可以产生同样的商业价值效果。此外，提高类胡萝卜素的水平还可以提高食物如胡萝卜的营养价值，以及提高植物对紫外线的有害作用的抵抗。
本发明的转基因植物表现了很多其它被改善的性质。即便在高光照条件下，转基因植物也比其野生型大。在引入了对Cab结合蛋白编码的基因后，它们都比其野生型植物更绿并且表现了更强壮的生长。本发明的基因结构还给植物提供了承受移栽的能力。转基因植物在被移栽后，恢复的比其野生型更快。
转基因植物的种子比其野生型大，发芽快，籽苗茁壮。发芽快的结果是苗壮根多，使它们不易受危害种子和籽苗的真菌和细菌的侵害。此外，能够迅速建立丰富和深度的根系的籽苗具有更好的抗旱能力。因此，转基因的种子和籽苗比其自然型具有更好的商业价值。
再者，本发明的基因结构和方法可以用来提高茎围，从而提高对植株的支持。这对果实植物来讲更为重要，比如，西红柿、梨、苹果、柑橘、柠檬等。强大和粗壮的茎可以产生能够承担更多果实的植物。此外，新被移栽的观赏植物，包括乔木和灌木，由于具有更大的茎围而都可以在它们发展出强大的根系之前具有更好的抗风能力。
本发明对转基因植物和植物细胞带来的各种有益之处都可以通过将本发明的基因结构引入到单细胞光合成生物和植物组织培养物中来再生。因此，对于那些不易合成的植物产品，如taxol和其它的只在生长缓慢的植物和组织培养物中产生的细胞壁产物等，都可以获得更快的生产。此外，光合作用的提高和随之而来在低光条件下的生长的提高意味着植物的再生可以被加速，而且对组织培养和植物生长所要求的光照可以被降低。
事实上，本发明中所描述的对光照需求的降低，可以使植物生产在低光照条件下更为经济地进行，比如，在窑洞中(目前使用在花卉生产中)或在更为严密的顶棚下进行。更为高深的技术应用是在宇航所用的生命支持系统中。航天局需要提高光合作用生物的生长，降低这些生物对光的需求可以使这样的系统更容易制造和使用，并且价格更为经济。
本发明的特别有用的实施例之一是生产各种耐阴草坪。这些种类的耐阴草坪可以种植在现有草坪无法生长的地方，例如，草坪中被树阴遮挡的部分和室内运动场等因为光照的限制而不得不使用人造草坪的地方。由于人造草坪给运动员带来的伤害，橄榄球联盟现在正在将室外的人造草坪改变为活草草坪。然而，室内运动场的光照条件受到更强的限制，活草无法在这些运动场上生长，除非有更为耐阴的品种出现。
在本发明的另一个方面，本发明的基因结构可以被用来生产植物生长形式更为统一和均匀的植物。由于转基因植物的各部分对可用光的利用更为有效，所以它们在温室内和大田中都比其野生型品种生长的更为统一和均匀。这个特点经济作物的生产更为有益，例如，玉米、大豆等，因为它们的低位背阴叶片可以更好地生长，生产更多的生物质，不仅有利于果实的产量，而且可以抑制野草的生长。
本发明提供的DNA结构可以被用做植物转化的标记，即根据颜色的不同，对阴凉/低光照条件的反应，生长和/或成熟的速度，特别是在低光照条件下等来鉴别转化植物。使用天然植物的DNA序列，可以探察在光合成细胞和生物中整合的外源性DNA，并可以避免使用外源的选择性标记物带来的调节上的麻烦。特别是，它提供了对转化植物、植物组织、或光合成生物的检测方法，该方法包括，制备含有启动子区、含转译增强子的5’未翻译区、质体特异性转运肽、对表达可被探察的质体蛋白进行编码的基因、含有功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区的DNA结构；将该DNA结构插入到克隆载体中；用该克隆载体对植物、组织培养物或光合成生物进行转化来表达蛋白质，其中对蛋白质的表达是转化的标志。优选的是，相对于野生型的质体和细胞而言，对蛋白质的表达和蛋白质对质体或细胞光合成器的输入都得到了提高。
被表达的标记基因可以产生供目测的反应，即产生相对于不表达选择性标记基因的植物或光合成细胞为独特的外观和生长形式，使得它们可以区分于其它的植物、植物局部、光合成生物的细胞等，达到鉴定的目的。这种特征性的表型(例如，细胞的颜色更绿)，可以用来鉴定含有该结构的原生质、细胞、细胞群、组织、器官、植物局部、或整株植物。使用例如荧光活化细胞分离技术(FACS)可以对细胞中的绿色素惊醒测定和筛选[参见Galbraith，D.W.(1990)Methods CellBiol.33：547-547]。如果该结构中还加入了第二个基因，则对标记表型的测定就可以选择含有与标记基因相连的第二个基因的细胞。第二个基因一般包括所需的表型并在转化细胞中不是容易被鉴别的，但是，当植物细胞或其衍生物生长并成熟时则存在着，甚至在选择性标记表型本身并不明显的条件下也是存在着的。
下述实施例描述了本发明的具体方面，用以反应本发明，并描述了提供本发明的结构的方法和鉴别它们在生物体中的功能的方法。这些实施例不应该被认为是对本发明的任何的具体限制。本发明的优选实施例
                      实施例1
             体外翻译和蛋白质输入的分析
制备各种基因的融合，它们都显示Rbcs5’未翻译区(5’UTR)和Rbcs转运肽分别具有在镶嵌基因结构中更高级别的翻译和运输。这些体外运输和翻译的数据都总结于表2。在很多情况下，Rbcs转运肽对进入叶绿体中的被转运蛋白具有更高水平的运输。Rbcs基因的5’URT的提高翻译的效果在体外麦胚翻译体统中被证实。这些数据表明Rbcs基因的5’URT是所定义的翻译增强子。
对蛋白质运输和相关方面如效率的分析使用了体外放射性标记蛋白和体外运输检测来完成的。放射性标记的蛋白是从相应的DNA模板通过转录还合成的，并在表2中给予描述。所有描述的转录质粒都在大肠杆菌HB101或JM101-109品系中繁殖。各种细菌系都使用常规的方法转化[参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook et al.1989，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY]。使用常规的技术将质粒DNA从载有该质粒的细菌系中分离出来[参见Sambrook et al，1989，同上]。含有不同融合的各种转录的质粒(表2)都对基因融合DNA模板的3’端的适当的限制性位点进行线性化。根据使用的各种酶的供应商的说明来安排限制性酶解的缓冲液和反应条件。对基因融合模板的建立、插入和繁殖，都可以在各种可购买到的转录质粒中进行，例如，pBLUESCRIPT系列(Stratagene的产品)、pBS系列(Stratagene的产品)、pGEM和pSP系列(Promega的产品)、以及pT7/T3系列(Pharmacia的产品)等。转录质粒通常含有进行克隆操作的多个克隆区，以及至少一个病毒RNA聚合酶启动子。启动子可以是T7、T3或SP6等，并使用相应的RNA聚合酶。
对每毫克DNA加入5-10单位的限制性酶，用水将反应混合物调整到最终体积。最终体积一般为200微升，含有10微克的质粒DNA。充分混合后，在适宜的温度下反应1-3小时。使用苯酚和氯仿∶异戊醇萃取对酶解后的模板再次提纯，离心(通常在离心管中进行)，含有酶解的DNA的水相用2体积的100％乙醇并有0.3M乙酸钠存在和pH7.0的条件下沉淀浓缩。使用的苯酚用0.1M Tris-HCl pH8.0加0.1％(w/v)羟基喹啉预先饱和化。氯仿∶异戊醇由24体积的氯仿和1体积的异戊醇组成。在每一步有机溶剂的萃取中，反应混合物水液的体积与苯酚或氯仿∶异戊醇的体积相等。离心收取DNA沉淀，用70％(v/v)乙醇洗一次，干燥，再溶于20微升水中，然后进行体外转录。
在体外对模板的转录是根据Melton等人的方法[参见Melton et al.(1984)Nucl.Acids Res.12：7035]用相应于启动子的RNA聚合酶来进行。反应中加入未甲基化的cab类似物(GpppG)，浓度一般为0.5mM(Pharmacia的产品)。典型的转录反应(总体积为200微升)通常含有DNA模板(5微升)，RNA聚合酶(40单位的SP6、T3或T7)，转录反应缓冲液(最终浓度为40mM Tris-HCl pH7.5，6mM MgCl2，2mM亚精氨，10mM NaCl)，二硫苏糖醇(DTT，5mM)，40单位RNA酶抑制物，0.25mM的ATP、GTP、CTP或UTP。使用苯酚和氯仿∶异戊醇萃取对酶解后的模板再次提纯，离心，含有RNA转录本的水相用750微升的100％乙醇并有0.3M乙酸钾存在和pH7.0的条件下沉淀浓缩。转录本(反应得到330微升)经过在乙醇中离心后浓缩，用70％(v/v)乙醇/水清洗，干燥，再溶于34微升的含有20-40单位RNA酶抑制物的水中。此外，转录本的沉淀物可以在-70℃下保藏直至使用。
然后，该转录本在小麦胚提取系统中被转译，该系统含有35S-放射性标记的甲硫氨酸(New England Nuclear的产品或Amersham的产品)或TRAN35S-标记(ICN)，后者同时含有放射性标记的甲硫氨酸和半胱氨酸。小麦胚提取系统按照Erickson和Blobel在1983年所述的方法进行[参见Erickson and Blobel(1983)Methods in Enzymol.96：38]，稍有修改。具体是将3克的未经炒熟的小麦胚(购买自General Mill，Inc.，Minneapolis，MN)在研钵中研碎，研磨时要有液氮冷却，直至得到细碎粉末为止。将得到的小麦胚细碎粉末转移到另外一个预冷过的研钵中，在有12毫升均化缓冲液(100mM乙酸钾，40mM Hepes-KOHpH7.6，4mM DTT，2mM CaCl2，1mM乙酸镁)存在的条件下继续研磨直至化合物成为均匀的稠浆为止。然后将该匀浆物转移到30毫升的Corex管中，在4℃以31,000xg离心10分钟。收取上清液并在15毫升的Corex管中以相同条件再次离心10分钟。最终的上清液被小心地取出并测定其体积(一般为8-9毫升)。对交联葡聚糖G-25精细柱(Pharmacia的产品，2.5×20cm)用蒸煮法消毒，然后加载上述的上清液。该柱内含有20克(柱内体积为2.5×18cm)的交联葡聚糖G-25精细颗粒，这些颗粒用冷的无菌水预先浸泡过夜并用柱缓冲液(100mM乙酸钾，40mM Hepes-KOH pH7.6，4mM DTT，5mM乙酸镁)在使用前平衡。用柱缓冲液以1-1.5毫升/分的速率对小麦胚提取物洗脱，在前导的棕色带移动到柱子的下三分之二的时候开始收集各个组分。用分光光度计读取在280nm处的吸收来监测每个组分中蛋白质的含量。第一个峰区内的各个组分被合并起来并混合。用液氮将该洗脱峰的等份试样快速冷冻，然后在-70℃保藏直至使用。典型的转译反应包括从330微升的乙醇沉淀来的转录本，溶于34微升的水中，并含有20-40单位的RNA酶抑制物、5-6mM ATP、0.4mM GTP、64mM磷酸肌酸、0.08-0.09mM的每种氨基酸，只是不加入甲硫氨酸或甲硫氨酸及半胱氨酸，具体根据使用的35S标记的氨基酸来决定，此外，还含有4-8单位的磷酸肌酸酶，补偿缓冲液(最终浓度为：100mM乙酸钾，pH7.0，2mM DTT，0.3mM乙酸镁，0.8mM亚精胺)以及小麦胚提取物(在200微升的反应中加入80微升)。在转译中使用的放射性标记的氨基酸的数量，根据放射性标记的甲硫氨酸的数量和每次反应不超过200微居而决定。转译反应在26-27℃进行1.5小时，在进行运输检测和其它的相关实验之前，先用SDS聚酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和荧光自显影对转译的产物进行分析。对每个转译反应的1微升的样品计数其TCA-可沉淀的放射性来确定被结合的放射性标记的数量。
在运输测定中使用的完整的叶绿体是按照Bartlett等人[参见Bartlett et al.(1982)Methods in Chloroplast Molecular Biology，(eds.Edelman et al.)pp.1081-1091]或Cline等人[Cline et al.(1985)J.Biol.Chem.260：3691]所描述的方法从豌豆籽苗中提纯出来的。其生长条件如前所述[Ko and Cashmore(1989)EMBO J.8：3187]。从200克种子发出的籽苗在生长箱内发育9-11天，温度为21℃，荧光灯照射，光照与黑暗的比率为16小时比8小时。豌豆籽苗在收获之后，在冷的研磨缓冲液中[50mM Hepes-KOH pH7.6，0.33M山梨醇，0.05％(w/v)小牛血清(BSA)，0.1％(w/v)抗坏血酸，1mM MgCl2，1mMMnCl2，2mM Na2EDTA]进行2-3次每次1-10秒的搅碎，Polytron匀浆器设定在第5-6档位。各步骤都在大约4℃的温度下进行。匀浆产物用三层的Miracloth滤布过滤，在4℃下以2,800xg离心3分钟收集粗原生质。粗原生质的沉淀重悬浮于4毫升的研磨缓冲液中，然后分层在10-80％Percoll梯度上[50mM Hepes-KOH pH7.6，0.33M山梨醇，0.05％(w/v)BSA，0.1％(w/v)抗坏血酸，0.15％(w/v)聚乙二醇，0.05％(w/v)Ficoll，0.02％(w/v)谷胱甘肽，1mM MgCl2，1mM MnCl2，2mM Na2EDTA以及Percoll]。对该梯度以10,000xg在4℃离心10分钟，收集在梯度靠下方的完整的叶绿体带，用1x HS缓冲液(50mMHepes-KOH pH8.0，0.33M山梨醇)稀释至少5倍。以4,350xg离心2分钟收集完整的质粒。重复这个步骤，叶绿体沉淀重悬浮于1x HS。最后的沉淀重悬浮与5毫升的1x HS中，选取等份试样用于叶绿素分析。叶绿素分析按照Arnon的方法进行[参见Arnon(1949)Plant Physiol.24∶1]。样品用80％(v/v)丙酮/20％水提取。用离心机高速离心1分钟去除不溶性物质。取出上清液，根据Arnon的转换公式对叶绿素进行分光光度分析。
体外运输检测是按照Bartlett等人[参见Bartlett et al.(1982)Methods in Chloroplast Molecular Biology，eds.Edelman et al.，pp.1081-1091]所述的方法在0.3毫升的体积中进行的。该反应通常都含有相当于100微克叶绿素的叶绿体；35S-放射性标记的转译产物并调整到1x HS，10mM甲硫氨酸，10mM半胱氨酸(当使用TRAN35S-标记物时)，以及运输缓冲液(1x HS)。在室温和荧光灯照射下将样品轻轻摇动30分钟。运输检测还可以用加入外源性ATP来替代光驱动的ATP合成而进行。通常，加入的ATP的两在1mM-3mM之间。完整的叶绿体被再次分离出来用于进一步的处理和按照Smeekens等人所述的方法进行更细的分离[参见Smeekens et al.(1986)Cell 46：365]。反应完成后，运输检测中的叶绿体以686xg离心3分钟收集，重悬浮于500微升的1x HS中，用嗜热菌蛋白酶处理(终浓度为3微克/微升)，在40％Percoll垫护下以1,940xg离心分钟进行再次分离。在离心管底部收集到的完整的叶绿体重悬浮于500微升的1x HS中，以686xg离心3分钟清洗一次，在重悬浮于50微升的溶液A中(0.1M Na2CO3，0.1M β-巯基乙醇)。从按照上述的方法进行的运输反应中对叶绿体检测的反应物中各取5微升样品。叶绿素成分被用来使样品正常化，然后加载到蛋白质凝胶上。然后，对重悬浮的叶绿体沉淀加入30微升的溶液B[5％(w/v)SDS，30％(w/v)蔗糖，0.1％(w/v)溴酚蓝]煮沸30秒来准备进行SDS-PAGE。对体外小麦胚转译和各种运输反应的等份试样使用适宜的百分密度的凝胶进行SDS-PAGE分析[参见Laemmli，(1970)Nature 227：80]。电泳完成后，使用ENHANCETM(New EnglandNuclear的产品)并根据厂商的说明对凝胶进行处理，然后对KodakXARTM X-光底片曝光来进行荧光自显影。对运输的水平和被运输物的分配用LKB ULTRASCAN XL激光光密度计从荧光显影片上进行计算。蛋白质融合的结果总结于表2中。
                        表2
        对各种构造的体外运输和转译结果的总结A)植物
  启动子  转译增强子  转运信号  被运物质  表型  蛋白水平           注释
35SCaMV Rbcs1 Rbcs Cab2 + ＞Cab 增强了低光条件的光合成
  35SCaMV  Cab  Cab  Cab  0  ＝Cab 光合成正常
B)试管分析
  启动子   转译增强子    转运信号   被运物质   转译 运输水平         注释
  -   Rbcs    Rbcs   Rbcs   高 高 对Rbcs正常
  -   Rbcs    Rbcs   Cab   高 高 比单独Cab高50％
  -   Cab    Cab   Cab   好/高 好 对Cab正常
  -   Cab    Cab   Rbcs   好/高 好 比单独Rbcs低50％
  -   Oeel3    Oeel   Oeel   中度 好 对Oeel正常
- Rbcs Rbcs Oeel 高 高 比单独Oeel高数倍
- Rbcs Rbcs/Oeel Oeel 高 高 比单独Oeel高数倍
  -   Com444    Com44   Com44   低 低 对Com44正常
  -   Rbcs    Com44   Com44   高 低 对Com44正常
  -   Rbcs    Rbcs/Com44   Com44   高 高 输入好
- Rbcs Rbcs Com44 高 高 输入好
                                                                                 表2(续表)
  启动子 转译增强子   转运信号   被运物质   转译 运输水平      注释
  - Com705   Com70   Com70   低 正常 对Com70正常
  - Rbcs   Com70   Com70   高 正常 对Com70正常
  - PetA6   PetA   PetA   低 低 对PetA正常
  - Rbcs   Rbcs   PetA   高 高 高
  - Rbcs   -   PetA   高 低 无，信号损失
  - Rbcs   Rbcs/PetA   PetA   高 高 高
  - Oeel   Oeel   Dhfr7   中度 好 外源蛋白
  - Dhfr   -   Dhfr   低 无 缺少转运信号
  - Rbcs   Rbcs   Dhfr   高 高 高
  - Rbcs   Rbcs   Pka8   高 高 比单独Pka高
  - Rbcs   Rbcs   Pkg9   高 高 比单独Pkg高
  - Pka   Pka   Pka   中度 好 对Pka正常
  - Pkg   Pkg   Pkg   中度 好 对Pka正常
  - Pkg   Pkg   Rbcs   中度 好 类似Pkg水平
1豌豆
2豌豆
3拟南芥
4芸苔Brassica napus
5菠菜Spinacea oleracea
6蚕豆Vicia faba
7鼠
8蓖麻Ricinus cummunis
9烟草Nicotiana tabacum
                     实施例2
              Rbcs-Cab基因结构的制备
为了产生具有通过提高I型LhcIIB Cab蛋白水平而增强了低光条件下光合成能力的转基因烟草植物，进行了对转录本、mRNA能力、转译和蛋白输入的增强。基因结构的编码部分是一个DNA序列(图1，序列号：1)的融合，编码来自豌豆的I型LhcIIb Cab蛋白(图1，序列号：2)的成熟部分。该序列中相对于天然转运肽的部分被去除，并用编码来自豌豆Rbcs的小亚单位的转运肽的部分取代[参见A.R.Cashmore，in Genetic Engineering of Plants，T.Kosugi，C.P.Meredith，A.Hollaender，Eds.(Plenum Press，New York，1983)pp.29-38]。在该基因结构中使用的I型LhcIIb cab基因序列的5’和3’终端在图1中给出。表3中给出了Rbcs转运肽(序列号：4)和相应的基因序列(序列号：3)，有一个短的连接序列将转运肽和Cab肽连接起来。在紧靠豌豆Rbcs转运肽编码区上游的地方产生的一个29个碱基对的5’未翻译DNA序列(5’UTR)被用做转译增强子。该序列在表3中给出，包含在序列号：3的序列中(核苷酸1-29号)。对基因结构的表达由强CaMV35S启动子促进[参见Odell，J.T.et al.(1985)Nature 313：810]，而且转译终止信号从豌豆Cab基因中产生[参见A.R.Cashmore(1984)ProcNatl.Acad.Sci.USA 81：2960]。对该基因结构总结于表3中。
                         表3
            35SCAMV-Rbcs-Cab基因结构的总结关键结构部分：Rbcs(5’未翻译序列)-豌豆Rbcs转运肽-豌豆Cab蛋白体关键部分的被公开了的遗传名称：SS3.6(5’未翻译序列)-SS3.6 Rbcs转运肽-AB80 Cab蛋白体关键部分的序列：ACGTTGCAATTCATACAGAAGTGAGAAAA       ATG GCT TCT ATG ATA TCC
                                 M   A   S   M   I   STCT TCC GCT GTG ACA ACA GTC AGC CGT GCC TCT AGG GGG CAA TCC GCCS   S   A   V   T   T   V   S   R   A   S   R   G   N   S   AAAG AAG GTC AAC ACT GAC ATT ACT TCC ATT ACA AGC AAT GGT GGAK   K   V   Q   T   E   I   T   S   I   T   S   Q   G   GAGA GTA AAG TGC ATG GAT CCT GTA GAG AAG TCT   ......R   V   K   C   M   D   P   L   E   K   S
         Rbcs←                →Cab启动子35S CaMV终止子Cab终止序列[参见Cashmore(1984)Proc.Nat.Acad.Sci，USA 81：2960-2964]双连载体EcoRI-PvuII CAMV-Rbcs-Cab进入pEND4K(抗卡那霉素)的平整末端BamHI/blunt[参见Klee et al.(1985)Biotechnology3：637-642]。土壤杆菌LBA4404土壤杆菌的转化冻-融方法[参见Holster et al.(1978)Mol.Gen Genet.163：181-187。转化程序叶子圆片程序[参见Horsch et al.(1985)Science 227：1229-1231]。
克隆由建造pSSTP载体开始，该载体含有对Rbcs 5’UTR和转运肽编码的DNA序列(图2)。用HindIII内切酶将含有所需成分的DNA从质粒pSSNPT中取出[参见A.R.Cashmore，Univ.Pennsylvania，Philadelphia，PA，USA]。在按照实施例1所述的每一步DNA操作后，用苯酚和氯仿∶异戊醇提取，在有0.1M NaCl存在的条件下进行乙醇沉淀，并用70％的乙醇清洗，目的是对酶灭活并浓缩DNA。离心收集DNA沉淀，干燥，重新溶于10毫升水中。用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段(Promega的产品)将HindIII终端平整化。该反应含有1单位的Klenow片段，dATP、dCTP、dGTP、和dTTP各0.1mM，50mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl2，5mM DTT，和从上述步骤获得的DNA，在37℃培养1小时。用有机溶剂萃取重新提纯后，DNA用BamHI酶切，将所需的DNA片段从质粒pSSNPT的其它的部分中分离出来。对HindIII-BamHI DNA用凝胶提纯并连接到pGEM4(Promega的产品)的SmaI和BamHI位点，这些位点预先经过酶切并用小牛肠碱磷酸酶(Pharmacia的产品)脱磷酸。对DNA的提纯使用的是标准低熔点琼脂糖凝胶和苯酚萃取方法(Sambrook et al.1989，同上)。低熔点琼脂糖购自BRL(Gaithersburg，MD，USA)。将DNA从相应的低熔点琼脂糖中回收出来，使用预热至37℃的苯酚，然后加热到65℃，离心。重复苯酚萃取，将DNA水相调整到0.1M NaCl中，离心10分钟。对上清液按如上所述的方法用氯仿∶异戊醇萃取，然后用乙醇沉淀。DNA沉淀物用离心收集，用70％乙醇清洗，干燥，重悬浮于水中。
成熟的I型LhcIIb Cab编码DNA序列(豌豆AB80)含在Xbal-Pstl DNA片段中，用Xbal和Pstl(图3)对质粒pDX80[参见A.R.Cashmore，Univ.Pennsylvania，Philadelphia，PA]酶切将其提取出来。该DNA片段再用凝胶提纯，并通过Xbal和Pstl位点将其插入到质粒载体pSSTP(图2)中。连接之前，加入0.5单位的小牛肠碱磷酸酶，用3.5微升1M Tris-HCl，pH8.0调整酶切反应，对这些位点脱磷酸。在37℃培养30分钟后，脱磷酸的载体进行有机溶剂萃取和乙醇沉淀。得到的质粒被命名为pRBCS-CAB(图3)。
来自质粒pCAMV的带有35S CaMV启动子的经过凝胶提纯的EcoRI-HindIII片段[参见A.R.Cashmore，Univ.Pennsylvania，Philadelphia，PA，USA]被插入到pRBCS-CAB(图4)的EcoRI-Asp718位点使Rbcs-Cab镶嵌基因与35S CaMV组成启动子进行融合。用DNA聚合酶I的Klenow片段对相应的HindIII和Asp718限制性位点进行末端平整化。然后将35S CaMV-Rbcs-Cab结构作为EcoRI-PvuII DNA片段转移到双连载体pEND4K的BamHI位点(图5和6)[参见Klee，H.et al.(1985)Biotechnology 3：637]。限制性酶造成的所有末端都用Klenow片段在此步骤中平整化。
所有的连接步骤都是在15℃用T4 DNA连接酶过夜完成。连接反应中包括两种适宜的靶标DNA分子，连接酶缓冲液(50mM Tris-HClpH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP)，以及1-3单位的酶。基因构件过程中任何适宜的步骤都被使用标准CaCl2细菌转化程序[参见Sambrook et al.1989，同上]和大肠杆菌HB101引入到细菌中。所有重组的质粒都在HB101细菌中繁殖，并用标准技术分离(参见Sambrook et al.1989，同上)。使用标准琼脂糖和聚酰胺凝胶电泳技术对DNA片段进行分辨。
                     实施例3
                对植物的转化和选择
使用冻-融方法将pEND4K-CAMV-Rbcs-Cab质粒引入到土壤杆菌中[参见Holsters et al.(1978)Mol.Gen.Genet.163：181-187]。制取感受态LBA4404细胞，即用500微升过夜培养物接种50毫升LB肉汁(50微克/毫升)，然后在28℃摇动培养，直到在650nm的光密度读数为0.7OD为止。在4℃以2000xg离心5分钟收获细胞，用冰冷0.1M CaCl2清洗，并重悬浮于1毫升冰冷20mM CaCl2中。感受态LBA4404细胞的150微升等份试样与1微克的质粒DNA在离心管中混合，然后立即用液氮冷冻。这些细胞在37℃的水浴中或在恒温箱中培养5分钟，加入1毫升LB肉汁培养基，将这个混合物在28℃摇动培养3小时。以2000xg离心5分钟回收细胞，重悬浮于100微升LB肉汁培养基。将细胞加到含有100微克/微升卡那霉素和50微克/毫升利福霉素的LB培养盘上，在28℃培养2天。从一个抗卡那霉素的菌落中得到的质粒用Southern印迹分析证实了pEND4K-CAMV-Rbcs-Cab质粒的存在。含有50微克/毫升利福霉素和100微克/毫升卡那霉素的YEB肉汁培养基3毫升用抗卡那霉素菌落接种，并在28℃摇振培养过夜。对1.5毫升的过夜培养物离心30秒。细胞重悬浮于1.0毫升的GTE溶液(50mM葡萄糖，10mM Na2EDTA，25mM Tris-HCl pH8.0)和4毫克毫升的溶菌酶中，在室温下培养10分钟。加入预先用2体积1％(w/v)SDS，0.2N NaOH平衡过的苯酚30微升。混合物轻缓涡旋直至发粘，室温下培养10分钟。溶解的细胞用3M乙酸钠、pH4.8(150微升)中和，在-20℃培养15分钟，然后将混合物离心3分钟。上清液转移到干净的离心管中，加入2体积的乙醇，混合物在-80℃培养15分钟来对DNA沉淀。离心后，DNA沉淀重悬浮于90微升的水中。加入10微升pH为7.0的3M乙酸钠，再加入等体积的苯酚/氯仿，对混合物进行涡旋。在离心管中离心5分钟后，上清液转移到新的离心管中，加入2体积100％乙醇对DAN沉淀。离心后，沉淀用70％乙醇清洗，干燥，重悬浮在50微升的TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1mMNa2EDTA)中。
在土壤杆菌中的pEND4K-CAMV-Rbcs-Cab质粒的完整性，从对上述分离的质粒的酶解和Southern印迹分析得到证实，并与Sambrook等人在1989年的上面引述的文章相符。一个被筛选出来的含有完整pEND4K-CAMV-Rbcs-Cab的土壤杆菌菌落被用来对植物进行转化。
按照基本如Horsch等人[参见Horsch et al.(1985)Science227：1229]所述的叶子圆片转化程序，用质粒pEND4K-CAMV-Rbcs-Cab对烟草植物进行转化。仅仅使用生长了一个月的植物的3-7英寸长的没有完全伸展的嫩叶。对剪切下来的叶子的表面用10％(v/v)次氯酸钠，0.1％(v/v)Tween消毒，用无菌去离子水洗4次。从这一步以后，对材料和基质都采用标准的消毒技术处理。直径6毫米的叶子圆片用无菌纸打孔制备，在含有pEND4K-CaMV-Rbcs-Cab结构的土壤杆菌的过夜培养物按1∶5稀释的液体中培养10-20分钟。接种后，用无菌滤纸轻沾来去除多余的细菌，将叶子圆片转移到含有“根培养基”的培养皿中[参见Horsch et al.(1988)in Plant Molecular Biology Manual，(Eds.S.B.Gelvin，R.A.Schilperoort)Kluwer Acad.Publishers，A5：1-9]。用石蜡密封培养皿，放在生长箱中培养(24℃，并配以“生长”混合式荧光灯管)。两天后，在叶子圆片上生长的土壤杆菌用含在液体“根培养基”中的500毫克/毫升的头孢氨噻杀死，叶子圆片被转移到含有500毫克/毫升的头孢氨噻和100毫克/毫升卡那霉素的新鲜“根培养基”中，对转化的烟草植物的生长进行选择。
叶子圆片在上述的条件下培养3-5周，每周转移到新的培养基中。在此期间，从60个叶子圆片中生长出大约40棵绿苗，将它们切下来并转移到含有100微克/毫升卡那霉素的“根培养基”中[参见Horschet al.(1988)同上]。在有卡那霉素存在的条件下长根的苗被确认具有高水平的NptII活性[参见McDonnell，R.E.et al.(1987)Plant Mol.Riol.Rep.5：380]并被移植到土壤中。选择的转化株进行自花受精并收集种子。7个转基因烟草品系显示了高水平的NptII活性，它们的T1种子被在低光照条件(50-100μmol/m2/s)下繁殖，从而确定哪个品系具有高水平的稳定态的转基因mRNA。
同样的结构被引入到另外的2个拟南芥品系、3个芸苔品系、西红柿、生菜和苜蓿中。所有这些品系都显示了比其野生型更高的生长，特别是在低光照条件下更是如此。这些植物具有更好的阴凉回避反应。它们比其野生型生长快，长得大，对光的追求能力强。在65μmol/m2/s的光照强度下生长的西红柿和生菜，以及在5μmol/m2/s光照条件下生长的拟南芥都证实了这些结果。
                   实施例4
                   RNA分析
对全部RNA的分离以及随后的印迹杂交分析的方法参见A.R.Cashmore等人所述[A.R.Cashmore，1982 in Method in ChloroplastMolecular Biology，M.Edelman，R.B.Hallick，N.H.Chua，Eds.(ElsevierBiomedical Press，pp.533-542)and Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，andSambrook，J.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1982)]。对每一个主要转化物，从它们的20株T1植物中分离全部RNA。在11：00a.m.和1：00p.m.之间采集叶子样品。用甲醛变性凝胶溶解RNA，并转移到硝化纤维素上，方法参见Sambrook等人1989的文章，出处同上。对RNA印迹(图7A)用豌豆Cab DNA探针(记为探针1)检测，剥离，再与豌豆Rbcs转运肽-特异性DNA探针(记为探针2)杂化。1-7号表明原始转化体含有RbcS-Cab转基因并且显示高水平的NptII活性。7-12号植物代表着用对照豌豆Cab结构转化的植物。13号植物代表野生型未转化的烟草植物(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)。由豌豆Cab DNA探针检测到的转录水平被标准化，并用激光密度计定量。3号和5号转化品系的植物的豌豆cab mRNA含量最小，而品系1、2和7的含量最高。用豌豆Rbcs转运肽-特异性DNA探针得到的结果一样(图7A)。从野生型植物得到的全部RNA不与任何一种DNA探针杂化。
从具有最高的观察到的转基因mRAN水平的品系的T1个体植物进行自花授粉并进行分离分析。对后代纯合品系的转基因mRNA水平的分析与对原始转基因品系的一样(图7B)。在湿的滤纸上以24℃的温度使种子发芽，转移到含有按1∶1混合的土壤和蛭石的混合物的盆穴中，放入生长箱内，光照为50-100μmol/m2/s，14小时光照，10小时黑暗，光照时的温度为24℃，黑暗时的温度为18℃。每日浇水，使用的是含有10mM硝酸盐和2mM铵的完全营养溶液。有几个后代纯合品系显示了高水平的转基因mRAN，并且表现了相应的表型。
                     实施例5
                蛋白质和叶绿素分析
从转基因2号品系衍生的纯合品系的类囊体蛋白质的情况与野生型进行比较，确定额外的转基因转录可以造成稳定态Cab水平的总体提高。从原始转化2号品系(TR)衍生的纯合转基因品系和野生型植物(WT)各取9片叶子圆片样品。样品的采集时间是上午11：00到下午1：00之间。分离类囊体[参见K.E.Steinback，et al.in Methods inChloroplast Molecular Biology，M.Edelman，R.B.Hallick，N.H.Chua，Eds.(Elsevier Biomedical Press，Amsterdam，1982)pp.863-872；Vernon，L.P.(1960)Anal.Chem.32：1144]，用标准免疫印迹技术对其进行分析。对Cab/Oeel的比率用激光密度计由相应的免疫印迹带确定。标记相应于Oeel的和Cab的带。对总体Cab蛋白质水平的提高，用抗PSII氧气制造复合物(Oeel)的33kDa蛋白质的抗体和抗Cab的抗体同时对印迹检测来确定(图7C)。Cab与Oeel的比率被用来确定Cab相对PSII单位的水平，利用Oeel作为PSII水平的内部标记。密度计的结果表明，Cab蛋白质相对于Oeel来说被提高了2-3倍，说明对每单位的PSII有了更多的Cab蛋白质。当LhcII复合物被分离后，对叶绿素成分的平行提高是明显的[参见K.E.Steinback，(1982)同上；L.P.Vernon(1960)同上]。每克鲜重的叶子中回收的叶绿素增加了1.5倍，LhcII复合物增加了2-3倍，表明额外的Cab蛋白质发挥了结合叶绿素的功能。
                      实施例6
                  形态学和发育分析
转基因植物，不论是原始转基因植物还是自花授粉的后代纯合品系，都在各种实验条件下显示了与野生型不同的生长和外型差异，例如，在温室或生长箱中都是如此。所有的植物都是处于同样的发育阶段，并且按照前述进行繁殖。转基因植物在低光照条件下显示了更高水平的生长(50-80μmol/m2/s)(图8A)。
转基因植物对高光照的反应得到了增强。它们产生更多的生物质，生长形式更迅猛，取决于繁殖期间的光照强度。在高光照条件下，例如在温室中，转基因植物比其野生型长的大。另外，转基因植物与其野生型相比，茎围更大，生长形式的差异小。进而言之，大田实验表明，在田间的全日照条件下，转基因植物在生物质和尺寸上与野生型植物一样好。在这样的条件下，转基因植物没有任何有害现象。
对Cab的提高，引起了一系列的变化，最突出的是叶片宽大和平整，叶子边缘连续，生物质量高，花期晚。除了叶子整体增大以外，叶柄的基部也比野生型的宽(比较了转基因植物和野生型植物的第七片完全发育的叶子)(图8B)。转基因植物的叶片厚，并且胞间隙大(图8C)。光显微照相(图8C)显示了叶片中部的样品情况。叶子的切片用FAA50固定，并用光显微照相检查[参见D.A.Johansen，PlantMicrotechnique，(McGraw-Hill Book Co.，New York，1940)]。
选择叶子样品如上所述进行，用2.5％戊二醛缓冲液、0.1％磷酸缓冲液(pH7.5)固定，固定后，用1％四氧化锇处理2小时。在乙醇系列中脱水后，将叶子样品放入Spurr树脂中，切片后，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色[参见Spurr，A.R.(1969)J.Ultrastr.Res.26：31；Reynolds，E.S.(1963)J.Cell Biol.17：208；Watson，M.L.(1958)J.Biophys.Biochem.Cytol.4：475]。在野生型和转基因植物的叶肉组织的照相中使用的是相同的标尺。以每个细胞为基础，转基因植物的叶子细胞含有的叶绿体数量高，并且质体大，具有相当的圆形(图11)。在所用的方法中，没有显示出质体内部结构，例如类囊体的堆积等的差异。对线粒体、液泡和细胞核来说，任何水平的方法都没有显示出差异。
转基因植物的种子发芽率与野生型的极为不同。在固体培养基上，转基因种子平均比野生型早1-3天(图9)，而且新冒出的转基因籽苗已经是绿色的，出芽后，生长比野生型快。野生型的籽苗冒出的时候是黄色的，1天后才变成绿色。含有转基因细胞的愈伤组织比含有野生型细胞的生长快2-3倍(图10)。
转基因植物移栽后，比野生型植物的承受力强。恢复快，更快地进入正常生长形式。
                         实施例7
                   生理学和生物化学分析
提高Cab蛋白质对光合成活性以及功能的影响按照下述四项指标进行了评定：
1)气体交换特征；
2)代谢水平的改变；
3)糖含量；以及
4)PSII电子转运效率。
对在有限光照条件下生长的转基因植物和野生型植物的光合成率进行了比较。植物是在两种不同的光强度下培养的，50μmol/m2/s[即低光照，(图12A)]，和500μmol/m2/s[即高光照，(图12B)]。在25℃饱和的5％二氧化碳条件下，用叶子圆片氧气电极(LD2/2Hansatech，UK)对光合成进行了测定。由在叶子圆片电极的基部毡垫中的200微升的2M KHCO3/K2CO3混合物(pH9.3)提供5％CO2[参见Walker，D.A.(1987)The use of the oxgen electrode and fluorescenceprobes in simple measurements of photosynthesis，University of Sheffield，Sheffield，U.K.]。光照由Novomat 515 AF幻灯机提供(Braun，Germany)。数据表示每个表型的5株植物的结果。平均值的标准偏差小于10％。
转基因植物的光合成反应曲线表现出与野生型不同的特性(图12A)。在低光照(20-100μmol/m2/s)下，转基因植物展现出比野生型植物更高的光合成率；而在高光照条件下的结果相反(图12A)。随着光照强度的提高，反应曲线逐渐趋于接近，在大约300μmol/m2/s处交叉，即转基因组织到达的饱和的速率低。在相同的光照条件下，野生型组织的光合成提高的大并且没有达到饱和。野生型组织的饱和发生在大约450μmol/m2/s处。
在更高的光照条件下(500μmol/m2/s)，植物表现出了相同的反应(图12B)。在20-500μmol/m2/s的范围内，转基因组织的提高率比野生型的大，在更高的光强度处达到饱和，而野生型在1000μmol/m2/s处仍未达到饱和。转基因组织的低光照光合成能力的提高被空气中二氧化碳水平证实，并且在100μmol/m2/s的光强度下也得到证实，转基因组织显示的平均光合成率比野生型高50％(分别为3.3±0.8vs.2.2±0.8 O2/m2/s)。
代谢物和腺苷酸水平的改变也是光合成能力变化的指标。在低光照条件下，光合成的能力主要受到转运电子产生ATP和NADPH的能力的限制，即同化力FA[参见Heber，U.et al.(1986)Biochim.Biophys.Acta 852：144；Heber et al.，in Progress in Photosynthesis Research，J.Biggins，Ed.，(Martinus Nijhoff，Dordrecht)Vol.3(1987)pp.293-299]。同化力FA的强度可以由PGA(3-磷酸甘油酸)对TP(磷酸丙糖)的比率来估算[参见Dietz，K.J.and Heber，U.(1984)Biochim.Biophys.Acta.767：432，ibid 848：392(1986)]。进行测定的光强度是100-1000μmol/m2/s，850微巴的外部二氧化碳浓度，使光呼吸限制为最小(表4)。当光合成到达稳定状态时，将叶子冷冻破碎，准备进行代谢物的提取。转基因叶子在100μmol/m2/s时的二氧化碳同化率比野生型叶子高53％。PGA叶子的水平在转基因叶子和野生型叶子之间，但是，转基因的磷酸丙糖的含量高33％。因此，PGA/TP比率在野生型中高，表明在野生型植物中依靠提供ATP和NATP来使PGA转化为TP的能力受到了限制。腺苷酸的变化表明，在转基因叶子中观察到的APT含量是野生型叶子的两倍，而ADP的含量在这两种植物中相似。在叶绿体中ATP/ADP的比率比细胞溶质的低，一般计算结果为1.5-3.0之间[参见Stitt，M.et al.(1 982)Plant Physiol.70：971；Giersch，C.et al.(1980)Biochim.Biophys Acta.590：59；Neuhaus，N.E.and Stitt，M.(1989)Planta 179：51]。随着光强度的增加，该比率进一步降低(Dietz andHeber，同上)。ATP/ADP的比率在转基因植物中高于野生型植物(分别为2.2和0.8)。这些结果表明，转基因植物在低光照条件下的产生ATP的能力得到了提高，导致PGA还原的增强，以及光合成率的提高。
还观察到了磷酸己糖含量的改变，野生型的植物比转基因植物的磷酸己糖的含量高。G6P/F6P比率是磷酸己糖在细胞中分布的指标，比率值为1-2则表示叶绿体分室化作用并主要合成淀粉，比率值为3-5则表示胞质的分布并主要合成蔗糖[参见Gerhardt，R.et al.(1987)PlantPhysiol.83：399]。因此，低光照下野生型和转基因植物的G6P/F6P比率值低表明对碳的固定主要产生淀粉。
光吸收能力的提高，对转基因植物在高光照条件下的光合成代谢有副作用。此时，野生型植物的光合成率比转基因植物高37％。代谢物水平和比率的改变表明在转基因植物中发生了光合成调节机制的重要变化，补偿在高光照条件下光吸收能力的增强。两种植物的PGA/TP比率相等，ATP/ADP比率在转基因植物中比较低，这些都说明光磷酸化作用限制了光合成。有G6P/F6P比率提高指明的分配上的改变(对野生型和转基因型分别为2.9和3.9)，表明在转基因植物中蔗糖的合成被提高了，为的是补偿对无机磷(Pi)的需求的增加。转基因植物显得在高光照条件下通过蔗糖合成循环无机磷的效率比较低。
                                                 表4
                         在50μmol/m2/s光照下生长的植物的光合作用及代谢物含量
                               100μmol/m2/s          代谢率
                               代谢物含量              (mol/mol)
                               (nmol/mg叶绿体)
  植物       CER(μmol/m2/s)     PGA     TP     ATP     ADP     G6P     F6P     GlP   PGA/TP   ATP/ADP   G6P/F6P
野生型     1.7±0.1   364±110   46±21   74±27   89±51   92±39   98±40   69±48     8.4     0.8     0.9
转基因     2.6±0.6   353±47   61±8   181±38   85±32   43±9   65±38   61±9     5.8     2.2     0.7
                                                                1000μmol/m2/s
野生型     8.8±0.7   320±174   92±49   112±43   86±37   174±62   59±7   40±9     3.5     1.2     2.9
转基因     6.4±1.8   259±54   73±17   89±32   150±49   217±66   56±27   40±23     3.5     0.6     3.9
外部二氧化碳浓度为850微升/升，叶子温度为25℃。提供的数据是4株的平均值±标准偏差。对二氧化碳同化率的测定是在开放气体交换系统中，用Binos 100(Rosemount，Germany)红外线分析仪进行的。叶片室有合金铝制造，叶子圆片可以很快放进去并可以很快冷冻。该室的底部用石蜡封住，中间安置用来提供液氮的铜管。该室的上口安置一个透明的丙烯酸环来阻止叶子圆片切割刀。冷冻的叶子圆片(8cm2)在液氮中保存直到使用。从KL1500冷光源的两组光纤维提供的有光化照明直接以45度角照射到该室的顶部。通过在该室内循环水来控制温度。水蒸气对入气的反射调整到18毫巴，将进入的空气流通过15℃水浴内浸泡的螺旋管来完成。叶子样品用10％(v/v)HClO4萃取，指标代谢物用Hitachi U-3300光谱仪测定[Labate，C.A.and R.C.Leegood，R.C.(1989)Plant Physiol.91：905；Lowry，O.H.and Pasonneau，J.V.(1972)A flexible system of enzymatic analysis(Academic Press，New York)]。
光合成活性的改变反映在糖的含量上。在两种光照条件(50和500μmol/m2/s)下生长的转基因和野生型植物的嫩叶子中的淀粉和蔗糖的含量相对平衡，没有明显的分配变化(表5A)。蔗糖和淀粉的生产量相等，只是转基因植物中糖的总量比野生型的高2-3倍。开始于低光照然后转为高光照条件下从种子发育出的植物，转基因植物的淀粉含量比野生型的高2倍。对于嫩叶，光的改变似乎对转基因和野生型植物的总糖量没有影响。
完全发育的野生型植物的叶子具有类似的情况(表5B)，淀粉和蔗糖的水平基本平衡，并与光无关。然而，总糖量比嫩叶高。在相同发育阶段的转基因植物的叶子对两种光照的反应不同，淀粉和蔗糖生产的水平发生变化。低光照时，蔗糖的水平高，而高光照时，淀粉含量高。在高光照时，虽然总糖量的提高在转基因和野生型植物叶子中都得到提高，但是，转基因植物叶子的总糖量比野生型高49％。
                      表5
          在嫩叶和全发育叶子中的糖含量(A)在嫩叶中的淀粉和糖含量。数据是4株植物±标准偏差。
           淀粉             蔗糖             总糖量植物类型     μmol己糖等当量·mg-1Ch1
             在光照为50μmol/m2/s下的植物野生型       0.6±0.2          0.8±0.1         1.4±0.3转基因       1.3±0.2          1.6±0.4         3.0±0.6
             在光照为500μmol/m2/s 下的植物野生型       0.6±0.3          0.4±0.1         1.0±0.4转基因       1.8±0.5          1.4±0.4         3.2±0.9
                                                   表5(续表)(B)在完全发育叶中的淀粉和糖含量。数据是6株植物±标准偏差。
           淀粉              蔗糖           总糖量植物类型     μmol己糖等当量·mg-1Ch1
             在光照为50μmol/m2/s下的植物野生型       1.2±0.4           1.8±1.2       3.0±1.6转基因       1.2±0.5           2.1±1.4       3.3±1.9
             在光照为500μmol/m2/s下的植物野生型       4.1±1.9           3.8±1.9       7.9±3.8转基因       7.0±2.8           4.8±1.8       11.8±4.6对叶子用HClO4提出后，用分光光度仪对可溶性糖进行分析。对淀粉的测定是将不溶性叶子提取物用0.5M MES-HCl(pH 4.5)洗，重悬浮在0.5毫升的相同缓冲液中，用淀粉酶(4单位/毫升)-淀粉葡糖酶(14单位/毫升)酶解。离心后，对上清液进行葡萄糖分析(参见Jones，M.G.K.et al.(1977)Plant Physiol.60：379)。
图13给出了光反应曲线，qP(图13A)、qN(图13B)、Fv/Fm(图13C)、φPSII(图13D)，是在发芽后生长了6-8周的野生型和转基因植物的空气中测定的。每种表型的植物各测定4株。平均值的标准偏差小于5％。叶绿素荧光测定是用的脉冲放大调节荧光仪(PAM101，Heinz Walz，Effeltrich，Germany)。F0(黑暗下底物的荧光)用适应黑暗(30-60分钟)的叶子测量，光源为弱调节测量光(大约1μmol/m2/s)，由叶室下方窗户处安装的光纤维探测器提供(大约距离叶子5毫米)，同时收集荧光信号。为了测定最大荧光(Fm)，使用饱和脉冲光(7500μmol/m2/s)，由PAM103控制开关提供，每隔30秒发出1秒的光。稳定态荧光(Fs)用有光化的灯照射后测定。光化学(qP)和非光化学的(qN)抑制参数根据Schreiber等人的方法进行确定[参见Schreiber et al.(1986)Photosynth，Res.10：51]。通过PSIIφPSII的电子流的光子效率由qP产物和打开的PSII反应中心(Fv/Fm)的激发捕获的效率决定[参见Genty et al.(1989)Biochim.Biophys.Acta.990：87]。
对不同光照由额外的Cab蛋白质通过PSII(φPSII)对电子转运的效率的影响的测定，是由测定在φPSII稳定态光合作用时的叶绿素荧光特征[参见Genty，et al.(1989)同上]而决定的(图13)。测定用的植物是在低光照(50μmol/m2/s)条件下培养的。随着光照的增强，φPSII相应降低(图13D)，在转基因植物中的降低就比较小。随着光照强度的增加，开放PSII反应中心(Fv/Fm)的光子效率也降低；但是，转基因植物在100-600μmol/m2/s时的表现则不同(图13C)。在转基因植物中Fv/Fm的降低在这个光强范围内比野生型小，而在这个范围之上，则变的与野生型更近似。φPSII的效率可由Fv/Fm的产物和光化学对叶绿素荧光(qP)的抑制来确定。qP值反映主要接受器QA的氧化态[参见Schreiber，U.et al.(1986)同上]。随着光强度的增加也观察到了qP值的降低(图13A)。转基因植物保持着比野生型更为显著的氧化态，除了在高光照时之外。叶绿素荧光数据也指出将转基因植物暴露于高光照并不导致光抑制，因为Fv/Fm比率在转基因和野生型植物中是相似的。
在100-600μmol/m2/s时，非光化学的抑制(qN)在野生型植物中更高(图13B)。明显的是，在转基因植物中，对PSII功能的调节受到光吸收的能力提高的影响。在转基因植物中由PSII进行的低光电子运输的流动效率比较高，看起来可以主要归因于较高的Fv/Fm和较低的qN。相反，在光强度大于600μmol/m2/s时的转基因植物中，光化学抑制(qP)就成为决定较高的PSII(φPSII)的主要因素。
这些数据表明，通过遗传操作提高I型LhcIIb Cab蛋白质的水平，对植物产生了明显和重要的影响。LhcII被认为对去往PSII的吸收的激发能量起着关键的作用。通常，用来还原二氧化碳的ATP和NADPH的产生所需要的电子运输的能力在低光照条件下限制了光合作用；但是，提高Cab蛋白质水平可以使转基因植物通过在低光照条件下的电子运输系统而获得更多的能量。LhcIIb Cab蛋白质的提高还对还原产物和光合作用的激发压力有贡献。
转基因植物的较高的光合成能力独立于耕作的光参数。在低光照和中光照条件生长的转基因植物表现出的光合成能力类似于低光照时的光合成能力，在饱和的及在大气水平的二氧化碳条件下表现的光反应曲线的较大的起始斜率证明了这一点(图12和13)。这就意味着由代谢物比率反映的较高的ATP和NADPH生产能力在稳定态光合作用中发生了变化。在转基因植物中的较低的PGA/TP比率和较高的ATP/ADP比率表明，提高Cab蛋白质导致ATP合成的提高，从而增强了PGA的还原。叶绿素荧光参数也表示转基因植物的电子运输更为有效。开放的PSII中心捕获的激发能量的效率(Fv/Fm比率)在500μmol/m2/s光照条件下的转基因植物中比较高，与野生型植物相比，非光化学的抑制(qP)有相关的降低。对捕获光的能力的提高与叶子的解剖学上的变化有关，例如，增大了胞间隙，这就可能有助于二氧化碳向叶绿体的扩散，导致更高速率的光合作用和糖的合成。
在本文中所有给出的引述的文献和资料都合并于本发明。等同物
本领域的技术人员人将知道或者通过不多的例行试验就能确定许多与本文介绍的具体实施方案等价的方案。这些方案和其他等价方案都在本发明的权利要求的范围内。

Claims (40)

1.一种DNA结构，该结构包括：
(a)启动子；
(b)含有转译增强子的5’未翻译区；
(c)对提高蛋白质输入的质体特异性转运肽编码的DNA；
(d)对质体蛋白质编码的基因；以及
(e)含有功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区。
2.根据权利要求1所述的DNA结构，其中所述的结构，在整合到植物细胞或光合生物的细胞中时，使这些植物细胞或光合生物细胞的光合作用或质体功能比它们的在相同条件下的野生型细胞的高。
3.根据权利要求1所述的DNA结构，其中所述启动子区是组成启动子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的组成启动子是35S花椰菜镶嵌病毒(CaMV)启动子。
5.根据权利要求1所述的DNA结构，其中所述的转译增强子是对1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亚单位的5’未翻译区的转译增强子。
6.根据权利要求5所述的DNA结构，其中所述的转译增强子具有与序列号：3的第1-29残基基本相似的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的DNA结构，其中所述的转运肽来自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亚单位。
8.根据权利要求7所述的DNA结构，其中所述的转运肽具有与序列号：3的第30-215残基基本相似的核苷酸序列。
9.根据权利要求1所述的DNA结构，其中所述的基因编码色素或色素结合蛋白。
10.根据权利要求1所述的DNA结构，其中所述的基因编码叶绿素a/b结合蛋白。
11.根据权利要求1所述的DNA结构，其中所述的基因编码选自Lhcal、Lhca2、Lhca3、Lhca4、Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、和Lhcb6中的叶绿素a/b结合蛋白。
12.根据权利要求10所述的DNA结构，其中编码叶绿素a/b结合蛋白的基因是豌豆cab基因。
13.根据权利要求7所述的DNA结构，其中所述的含有功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区来自豌豆cab基因。
14.一种转基因植物或转基因光合成生物，它们含有的DNA结构包括：
(a)启动子；
(b)含有转译增强子的5’未翻译区；
(c)对提高蛋白质输入的质体特异性转运肽编码的DNA；
(d)对质体蛋白质编码的基因；以及
(e)含有功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区。
15.根据权利要求14所述的转基因植物的种子。
16.从权利要求14所述的转基因植物衍生的植物局部，其中所述的植物局部含有所述的DAN结构。
17.根据权利要求16所述的植物局部选自包括叶子、茎、根、花、组织、上胚轴、分生组织、下胚轴、子叶、花粉、子房、细胞、和原生质的一组。
18.根据权利要求14所述的光合成生物或植物的后代，其中所述的后代含有所述的DNA结构。
19.根据权利要求18所述的后代，其中所述的基因编码色素或色素结合蛋白。
20.根据权利要求14所述的转基因植物，其中所述的植物是单子叶植物。
21.根据权利要求14所述的转基因植物，其中所述的植物是双子叶植物。
22.据权利要求14所述的转基因植物或转基因光合成生物，其中所述的植物或生物进一步包括另外的外源性核苷酸序列。
23.一种转基因植物或转基因光合成生物，它们含有的DNA结构包括：
(a)启动子；
(b)含有1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亚单位的5’未翻译区的5’
   未翻译区；
(c)对具有与序列号：3的第20-215残基基本相似的核苷酸序列的
   转运肽编码的DNA；
(d)对色素结合蛋白编码的基因；以及
(e)含有功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区。
24.根据权利要求23所述的转基因植物的种子。
25.根据权利要求23所述的转基因植物衍生的植物局部，其中所述的植物局部含有所述的DNA结构。
26.根据权利要求25所述的植物局部，选自包括叶子、茎、根、花、组织、上胚轴、分生组织、下胚轴、子叶、花粉、子房、细胞、和原生质的一组。
27.根据权利要求23所述的植物或光合成生物的后代，其中所述的后代含有所述的DNA结构。
28.根据权利要求27所述的后代，其中所述的基因编码叶绿素a/b结合蛋白。
29.根据权利要求23所述的转基因植物，其中所述的植物是单子叶植物。
30.根据权利要求23所述的转基因植物，其中所述的植物是双子叶植物。
31.根据权利要求23所述的转基因植物或转基因光合成生物，其中所述的植物或光合成生物进一步包括另外的外源性核苷酸序列。
32.一种细胞或组织培养物，它们含有的DNA结构包括：
(a)启动子；
(b)含有转译增强子的5’未翻译区；
(c)对增强蛋白质运输的质粒特异性转运肽编码的DNA；
(d)对质体蛋白编码的基因；以及
(e)含有功能性多聚腺苷酸化信号的3’未翻译区
33.根据权利要求32所述的细胞或组织培养物再生的植物。
34.根据权利要求32所述的细胞或组织培养物，它们含有另外的外源性核苷酸序列。
35.根据权利要求34所述的细胞或组织培养物再生的植物
36.一种提高植物、组织培养物或光合成生物的光合成或生物合成能力的方法，所述的方法包括：
(a)制备DNA结构，该结构包括启动子，含有转译增强子的5’
   未翻译区，对提高蛋白质输入的质体特异性转运肽编码的
   DNA，编码质体蛋白质的基因，和含有功能性多聚腺苷酸化
   信号的3’未翻译区；
(b)将该DNA结构插入到克隆载体中；以及
(c)用所述的克隆载体对植物、组织培养物或光合成生物进行转
   化。
37.一种检测植物、组织培养物或光合成生物的转化的方法，所述的方法包括：
(a)制备DNA结构，该结构包括启动子，含有转译增强子的5’未
   翻译区，对提高蛋白质输入的质体特异性转运肽编码的DNA，
   编码其表达可被检测的质体蛋白质的基因，和含有功能性多聚
   腺苷酸化信号的3’未翻译区；
(b)将该DNA结构插入到克隆载体中；以及
(c)用所述的克隆载体对植物、组织培养物或光合成生物进行转
   化，使蛋白质被表达，
   其中所述的蛋白质的表达是转化的指标。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述的蛋白质是色素或色素结合蛋白。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述的蛋白质是叶绿素a/b结合蛋白。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述的表达，与其在同等条件下的野生型植物相比，在下述的一种或多种特征上被表现出来：产量提高、颜色增强、生物质增加、糖含量增加、生长更均匀、种子及果实更大、茎围增加、在低光照下的光合作用被增强、发芽快、对移植的承受能力增强。
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