CN1100874C - 编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的dna及其应用,含所述dna的重组载体和植物细胞 - Google Patents

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Abstract

公开了编码C4植物磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的克隆DNA。本发明的DNA编码序列表SEQ ID NO：1，2或3所示氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外与SEQ ID NO：1，2或3所示氨基酸序列相同的氨基酸序列，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。

Description

编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的DNA及其应用，含 所述DNA的重组载体和植物细胞
                       技术领域
本发明涉及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(下文有时称为“PCK”)基因和含所述基因的重组载体。
                       背景技术
PCK是反向催化磷酸烯醇丙酮酸羧化形成草酰乙酸之反应的酶。ATP-依赖性PCK(EC4.1.1.49)和GTP-依赖性PCK(EC4.1.1.32)是已知的。植物PCK依赖于ATP，并在光合作用中由二氧化碳形成淀粉过程中起重要作用。
另一方面，C4植物主要包括属于源于热带地区之禾本科的植物，而且它们与C3植物相比更适应强光，高温和缺水环境。更具体地说，C4植物的最大光合作用率是C3植物的两倍，而且光合作用不受空气中氧的抑制。即使用使C3植物光合作用达到饱和的光强度照射C4植物，它们的光合作用也不会达到饱和。此外，C4植物进行光合作用的最佳温度高于C3植物。
正如上文提到的，植物的PCK在光合作用中起重要的作用。因此，如果转化C3植物以使其生产C4植物的PCK，则预期可得到各种效果，例如提高光合作用率，有效利用阳光，促进在高温下的光合作用。然而，到目前为止，还未对植物的PCK基因进行完全定序，更不用说C4植物的。
                      发明的公开
因此，本发明的目的是提供克隆的C4植物PCK基因，含有所述基因的重组载体，用所述重组载体转化的植物。
本发明人进行了刻意研究，结果成功地克隆了C4植物Urochloapanicoides的PCK基因，并确定了所述基因的完整序列以及由所述基因编码的推导的氨基酸序列。本发明人还成功地构建了含有PCK基因的重组载体并用所述重组载体成功地转化了植物，从而得到表达PCK基因的转化植物，由此完成了本发明。
即，本发明提供编码序列表中SEQ ID NO：1、2或3所示之氨基酸序列或者在该氨基酸序列中增加、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸并且编码具有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性的多肽的克隆的DNA。本发明还提供含有本发明DNA的重组载体，此载体在宿主细胞中可表达所述的DNA。本发明还提供用本发明重组载体转化的，生产磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的植物。
通过本发明克隆了C4植物Urochloa panicoides的PCK基因并确定了其核苷酸序列。预期通过将所述基因导入C3植物，可提高光合作用效率，可以更有效地利用光能，而且还可提高植物对高温的抗性。
                   附图的简单说明
图1表示为得到PCK1所用的cDNA的位置和长度，所述cDNA是Urochloa panicoides的全长cDNA序列；
图2表示为得到PCK2所用的cDNA的位置和长度，所述cDNA是Urochloa panicoides的全长cDNA序列；
图3表示PCK1编码的氨基酸序列与PCK2编码的氨基酸序列的比较；
图4是用于转化水稻植物之重组载体的插入DNA区的基因图谱；和
图5图示表明PCK蛋白质在水稻转化体中的位置。
                    实施发明的最佳方式
用常规方法从Urochloa panicoides绿叶制备cDNA文库，然后通过利用抗-PCK抗体的免疫印迹法鉴别生产PCK的克隆，从而克隆出本发明的基因。通过定序克隆中的cDNA插入片段可确定所述基因的核苷酸序列，然后推导由此编码的氨基酸序列。具有推导的氨基酸序列的蛋白质的分子量与经纯化的PCK的相同，从而认为所述基因编码全长PCK。在下文实施例中将详细描述上述方法。
通过上述方法，确定序列表SEQ ID NO：1和2所示的核苷酸序列。本发明提供分别编码SEQ ID NO：1和2所示之氨基酸序列的克隆DNA。此外，如在下述实施例中的具体描述，确定Urochloapanicoides之活性PCK的N-末端，结果测定了具有SEQ ID NO：1所示之氨基酸序列的活性PCK，其N-末端分别为：第57位氨基酸是Ser，第61位氨基酸是Glu，第66位氨基酸是Leu，第69位氨基酸是Gly且第75位氨基酸是Gly。因此，由此可看出至少从序列1的第75位氨基酸Gly到C-末端的氨基酸序列足以发挥PCK活性。由未发现具有SEQ ID NO：1第57位氨基酸Ser之上游N-末端的活性PCK这一事实，推测在PCK蛋白质的纯化过程中，截掉了从第1位氨基酸Met到第56位氨基酸Ala的氨基酸序列。在下述实施例中，通过表达含有从水稻基因组DNA制备的水稻Rubisco小亚单位序列的DNA和编码第57位氨基酸Ser到C-末端之多肽区的DNA而对此加以证实。
另外，在下文实施例中，将示于SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列在KpnI位点相连(示于SEQ ID NO：2的部分氨基酸序列位于上游侧)，然后将编码源于水稻Rubisco小亚单位过肽的氨基酸序列的DNA与上述相连之DNA的上游相连(SEQ ID NO：3)。从第52位Ser到C-末端的氨基酸序列编码成熟PCK蛋白质。可以肯定用所述DNA转化的水稻植物生产由所述DNA编码的具有PCK活性的PCK。因此，通过连接多个天然产生的PCK基因中的部分而制备的DNA也在本发明范围内。
本领域熟知，即使肽的氨基酸序列在小范围内被修饰，也即即使取代或缺失氨基酸序列中的一个或多个氨基酸，或者即使将一个或多个氨基酸加入或插入氨基酸序列中，具有生理学活性之多肽的生理学活性仍可得到保留。编码具有所述修饰但有PCK活性之多肽的DNA片段也在本发明范围内。因此，编码除增加、插入、缺失或取代一个或多个氨基酸外具有与SEQ ID NO：1、2或3所示相同之氨基酸序列并且具有PCK活性的多肽的DNA也在本发明范围内。
通过本领域熟知(如，Nucleic Acid Research，vol.10.No.20，p6487-6500(1982))的位点特异性诱变修饰DNA，从而使由其编码的氨基酸序列发生增加、插入、缺失或取代。在本发明说明书中，“一个或多个氨基酸”指通过位点特异性诱变可增加、插入、缺失或取代的氨基酸数。
例如通过用一合成的寡核苷酸引物即可完成位点特异性诱变，所述引物除如下文所需的突变外，与单链噬菌体DNA互补。即，用上述合成的寡核苷酸为引物，用噬菌体生产互补链，然后用所得的双链DNA转化宿主细菌细胞。将转化的细菌细胞培养物涂布在琼脂上，然后由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。理论上，50％的新菌落含有具有携带突变之单链的噬菌体，而另50％的菌落含有具有原始序列的噬菌体。然后在探针与含有所需突变的DNA序列杂交，而不与和探针不完全互补的原始DNA序列杂交的温度下，将所得的噬菌体与激酶处理的合成探针杂交。然后检出观察到杂交的噬菌斑，培养并收集DNA。
除上述位点特异性诱变外，用于取代、缺失、插入或增加一个或多个氨基酸而不丧失酶活性的方法包括用诱变剂处理基因的方法和选择性裂解基因，取出加入或取代所选的核苷酸，然后连接基因的方法。
用下文实施例中详细描述的方法可得到本发明DNA。另外，由于本发明确定了示于SEQ ID NOs：1-3的Urochloapanicoides PCK基因的核苷酸序列，所以通过利用Urochloapanicoides的基因组DNA为模板的PCR方法或通过利用Urochloapanicoides cDNA为模板的RT-PCR方法可以很容易得到本发明的基因。
可将本发明的DNA插入植物表达载体以得到重组载体。用所得的重组载体转化植物可得到表达Urochloa panicoides PCK的转化植物。已确立了转化植物的方法，而且利用根癌土壤杆菌的方法是优选的。利用根癌土壤杆菌的转化方法是本领域熟知的，而且可以转化双子叶植物(如日本特开平4-330234)和单子叶植物(WO 94/00977)。导入本发明PCK基因的适宜植物包括水稻、玉米、番茄、烟草等，尽管不限于这些植物。在下文实施例中详细描述转化方法的实例。
实施例
本发明将利用实施例更具体地进行描述。但应注意到，本发明并不限于下列实施例。实施例1  克隆并鉴别PCK1(I)材料和方法(1)植物材料
用于RNA分离的所有植物材料均来自U.Panicoides登记号CQ 2798，由CSIRO，Division of Tropical Crops and Pastures，Brisbane，Queensland，Australia提供。在夏季月份中，使光生长植物在全光照下生长5周。使暗生长植物于28℃从播种在湿组织中的种子开始生长，所述湿组织在铝箔包着的聚苯乙烯盒中。(2)纯化PCK
基本按在Burnell  JN，Purification and properties ofphosphoenolpyruvate carboxykinase fron C4 plants，Aust.J.Plant.physiol.13：577-587(1986)中的描述，除去掉第二个DEAE-Sepharose  CL-6B柱(从Pharmacia购买的)外，从光生长的U.panicoides叶中纯化PCK。将1ml含峰PCK活性的SephacrylS-300柱(可从Pharmacia购买)组分中，100μg和200μg间的蛋白质与等体积125mM Tris-HCl，pH6.8，20％甘油，4％SDS，10％2-巯基乙醇，0.0025％溴酚蓝混合，于85℃加热2分钟。在于16cm×18cm×0.2cm 10％SDS-聚丙烯酰胺分辨凝胶上，按已知方法(Laemmli UK：Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophage T4，Nature 227：680-685(1970))分离前，以12,000xg将样品澄清5分钟。用0.5％考马斯兰R-250，4D％乙醇，10％乙酸将凝胶染色1小时，然后用10％甲醇、10％乙酸脱染。
在有关电洗脱的制备中，切下染色的蛋白质带，用0.15m NaCl、1％SDS，50mM Tris-HCl，pH7.5然后用10mM Tris乙酸盐pH8.6，1mMEDTA，1％SDS平衡。经通过5ml注射管破碎凝胶片，然后放在LittleBlue Tank(商标)电洗脱装置(ISCO，USA)板的阳极孔中。所述的板用10mM Tris乙酸盐，pH8.6，1mM  EDTA，1％SDS填装，而阳极和阴极空间用40mM Tris乙酸盐，pH8.6，1mM EDTA，1％SDS填装。在3W的稳定功率下完成3小时的电洗脱。所述板的阴极孔的蛋白质回收率大于90％。用Centricon-30(商标)超滤盒(Amicon，Australia)经离心浓缩电洗脱的PCK，用PBS(15mM磷酸钠，pH7.2，140mM NaCl，3mM KCl)稀释100倍，然后再浓缩。(3)制备抗PCK抗血清
将500μl PBS中的约500μg凝胶纯化的PCK与等体积的弗氏完全佐剂混合。将混合物的小样(500μl)肌肉内注射到兔(新西兰长耳变种)的各大腿中。在开始注射后第30天和第48天，按上述，除用弗氏不完全佐剂外，加强免疫兔。在第二次加强免疫时和10到14天间隔时，从耳静脉收集血液。使血样凝结，然后以1000xg离心10分钟进行澄清。用0.02％叠氮化钠制备澄清的血清，然后贮于4℃。(4)电印迹并免疫检测PCK
在10％丙烯酰胺分辨凝胶(Laemmli，上文)上进行SDS-PAGE而分离蛋白质，然后用考马斯兰R-250染色或用于电印迹。为了进行免疫印迹实验，用25m Tris，192mN Gly，20％甲醇平衡凝胶，然后在Trans-Blot(商标)盒(Bio-Rad，Australia)在冰上用所述缓冲液以250mA，经1小时电印迹到硝酸纤维素膜(Schleicherand schuell，Germany)。在加入澄清的兔抗-PCK抗血清并温育1小时前，用在TBST(12.5mM Tris-HCl，pH8.0，137mM  NaCl，2.7mMKCl，0.1％吐温20)中的0.5％脱脂奶粉阻断印迹。用TBST 10分钟将印迹洗涤3次，然后用ProtBlot(商标)检测系统按制造商的说明(Promega，Australia)检测结合的抗体。为了进行N-末端氨基酸序列测定，用上述电印迹，除用的箱缓冲液是10mM CAPS，pH11，10％甲醇外，将蛋白质转移到聚二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad，Australia)上。用50％甲醇中的0.1％考马斯蓝R-250将印迹染色，用50％甲醇脱色，然后空气干燥。切下序列测定中所用的蛋白质带。(5)从U.panicoides中分离RNA
用Chomczynski和Sacchi的方法(Chomczynski P.Sacchi N：Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate phenol chloroform extractionAnal.Biochem.162：156-159(1987))后，从各种U.panicoides组织中纯化总RNA。通过用寡核苷酸(dT)25-结合的顺磁颗粒(Dynal，Norway)按制造商的方法成批处理从总RNA中分离poly(A)+RNA。(6)构建并筛选U.panicoides cDNA文库
用TimeSaver(商标)cDNA合成试剂盒(Amrad-Pharmacia，Australia)按供应商的说明在3μg  U.panicoides  poly(A)+RNA的λgt11D中构建定向的cDNA文库。用Gigapack II(商标)包装提取物(Stratagene，USA)包装所述文库，然后在Y1088涂布的细菌上滴定并扩增(Sambrook J.Fritsch EF，Maniatis T：MolecularCloning A.Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring harborlaboratory Press，Cold Spring Harbor NY(1989))。在于含10μl兔抗-PCK抗血清的50ml TBST中温育16小时前，按上述经1小时阻断转移进行免疫印迹。洗涤转移物，如在免疫印迹实验中一样检测结合的抗体。
为了经杂交进行筛选，将噬菌斑转移到Hybond-N+(商标)(Amersham，Australia)，变性然后按制造商的说明用0.4M NaOH固定噬菌体DNA。在加入热变性的放射性标记的探针前，于42℃将膜在5×SSC(1×＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸三钠)50％甲酰胺，0.1％ SDS，50mM磷酸钠(pH7.0)，0.1％Ficoll(商标)(Amrad-Pharmacia，Australia)，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％牛血清白蛋白，250μg/ml热变性的鲱鱼精DNA中预杂交1小时。从琼脂糖凝胶(Sambrook J.，等人，文献同上)纯化DNA限制片段探针，通过使用GIGAprime  DNA标记试剂盒(Bresatec，Australia)的随机引发，用[α-32P]dCTP(NEN-DuPont，Australia)进行放射性标记。于42℃杂交16小时，然后用2×SSC，0.1％SDS于42℃将膜15分钟洗2次，再于65℃用0.1×SSC，0.1％SDS 15分钟洗2次。(7)亚克隆并测序cDNA插入片段
从平皿溶解产物中制备噬菌体DNA，然后用标准方法(SambrookJ.等人，文献同上)将插入片段亚克隆到pBluescript II-KS(商标，Stratagene，USA)中。为了测序，用外切核酸酶III构建数组嵌套缺失(Henikoff S：Unidirectional digestion withexonuclease III creates targeted breakpoints for DNAsequencing，Gene 28：351-359 (1984))，然后用绿豆核酸酶消化后，再连接。经碱煮而使适宜缺失质粒的碱溶解小制品(SambrookJ.等人，文献同上)变性(Yie Y.Wei Z，Tien P：Asimplified and reliable protocol for plasmid DNAsequencing：fast miniprep and denaturation Nucleic AcidRes 21：361(1993))，然后用双脱氧链终止法(Sanger F，Nicklen S，Coulson  AR：DNA sequencing  with chainterminating inhibitors，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467(1977))用T7测序试剂盒(商标，Amrad-Pharmacia，Australia)测序。限制酶和其他核酸修饰酶均来自Amrad-Phramacia，Australia。(3)Northern分析
在含8mM甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上分离poly(A)+RNA(SambrookJ.等人，文献同上)在75mmHg压力下，用0.4M NaOH为缓冲液将RNA2小时转移到Hybond-N+(商标)上。在0.9M NaCl，6mM EDTA，60mM NaH2PO4，pH7.4，50％甲酰胺，0.1％ SDS，10％葡聚糖硫酸酯，0.04％Ficoll(商标)，0.04％聚乙烯吡咯烷酮，0.04％牛血清白蛋白，0.5ma/ml变性的鲱鱼精DNA中于42℃将膜预杂交3-4小时。加入热变性的放射性标记的限制性片段，于42℃杂交16小时，按上述洗涤膜以除去噬菌斑。结果(1)制备兔抗-U.panicoides PCK抗血清
U.panicoides PCK分子鉴定的第一步是得到抗纯化PCK的抗血清。用硫酸铵分级分离、接着用离子交换和分子筛柱层析按Burnell JN(同上文)的方法从生长U.panicoides的地中纯化PCK。用SDS-PAGE分离从Sephacryl S-300(Pharmacia)柱层析得到的峰组分蛋白质。用考马斯兰染色表明有约69、63、62、61和60kDa的5种蛋白质。推测迁移到62kDa处的最丰富的带是PCK并对其进行凝胶纯化。最后纯化的产物在SDS-PAGE上是同质的，因此用其作为抗原生产兔抗血清。
用所得的抗血清探测用于抗原纯化的相同柱组分的免疫印迹。所得的图像与被检蛋白质和所述5个种相对染色强度中的考马斯兰染色图谱相同，然而，若用该抗血清探测U.panicoides的粗组织提取物，在染色强度方面发现有细微的差别。在粗提取物中，63、62和61kDa种有相同的染色强度，而60kDA种染色强度低得多，而在纯化PCK中，63kDa种染色强度比其他种的低。(2)PCK cDNA的克隆并序列分析
在λgt11衍生的载体中，用从生长U.panicoides地中的绿叶分离的poly(A)+RNA构建cDNA表达文库。若用抗-PCK抗血清筛选2×105个该文库的噬菌斑，则得到40个有免疫反应性的克隆。对其中的20个再筛选以达到均质性。亚克隆cDNA插入片段，然后进行末端测序。所有12个插入片段均与啤酒酵母的PCK序列(Stucka R etal.，Nucleotide sequence of the phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene from Saccaromyces cerevisiae.NueleicAcid Res.16：10926(1988))同源。最长的插入片段λPCK100101为1.4kb，因此不足以编码约62kDa的PCK蛋白质。为了得到覆盖全部PCK开放阅读框架的cDNA，用放射性标记的限制片段再筛选所述文库，所述片段从cDNA的5′末端向3′方向逐渐延伸。在图1中列出了在两个方向均完全测序了的所得重叠克隆。λPCK110402插入片段分别与λPCK100101和λPCK190203插入片段重叠了675和132bp。这些克隆的重叠区有相同的序列。
结果，确定了共2220bp的cDNA序列，包括1872bp的开放阅读框架(ORF)，出于序列表中的SEQ ID NO：1。此ORF编码具624个残基的蛋白质，将编码该ORF的基因称为PCK1。PCK1 ORF两侧为288bp的延伸向poly(A)尾的3′非翻译区和57bp的5′非翻译区。(3)PCK1蛋白质的特性
推导的624个残基的PCK1蛋白质的分子量为68,474Da。Kyte和Doolittle算法(Kyte J.Doolittle RF：A simple methodfor displaying the hydropathic character of a protein，J.Mol.Biol.157：105-132(1982))表明PCK1有所有的亲水特性，没有根据Popot和de Vitry标准(Popot J-L，de VitryC：On the microassembly of integral membrane proteinsAnnu.Rev.Biophys，Chem.19：369-403(1990))的跨膜区。这与其细胞溶质定位一致。(4)PCK的氨基末端序列分析：
经直接定序确定U.panicoides PCK的N-末端氨基酸序列。用SDS-PAGF分离在含峰PCK活性的Sephacryl S-300(Pharmacia)柱组分中的蛋白质以使60-63kDa的蛋白质跑成单一的宽带。将所述材料印迹到PVDF膜上，然后使完整的带经12个循环的自动Edman降解，每个循环释放可检测量的四或五个氨基酸。从此数据，鉴定了对应于U.panicoides PCK cDNA推导的氨基酸序列的共5个重叠序列。这些序列示于下文表1。
表1
    方法     氨基酸序列
  直接确定法a   I.    Ser  X  Ala Arg Glu Tyr Gly Pro Asn Leu Val LysII.                    X  Tyr Gly Pro Asn Leu Val Lys Gly Asp  X  GluIII.                                      Leu Val Lys Gly Asp  X  Glu Ala Lys Gly Ala  XIV.                                                   Gly Asp Pro Glu Ala Lys Gly Ala  X   X   X   XV.                                                                            Gly  X  Pro Pro Ala  X  Val Lys X  X  X  X
  从cDNA推导的         Ser Thr Ala Arg Glu Tyr Gly Pro Asn Leu Val Lys Gly Asp Pro Glu Ala Lys Gly Ala Pro Pro Ala Pro Val Lys Gly Gln Gln Ala
a  X表示在测序循环未发现与cDNA推测的残基相对应的氨基酸
如表1所示，所有5个序列均在彼此的19个残基内开始，大部分N-末端从起始Met的56残基开始。在鉴定的N-末端中，序列I和III是最丰富的。在第二个实验中，按上文所述电泳PCK，然后分别将各带测序。但是，只得到有关62和61kDa种的结果。62kDa带只产生N-末端序列III和IV，分别对应于推测分子量为61.8kDa和61.4kDa的蛋白质。61kDa带只产生序列V，得到推测分子量为60.8kDa的蛋白质。总之，N-末端测序实验表明，通过除去56-75个残基的前导序列，69kDa的U.panicoides PCK翻译产物被加工成60.8到62.7kDa之间的成熟蛋白质。因此，本发明还提供编码这5种蛋白质的DNA。(5)光对PCK1表达的影响
使U.panicoides种子萌发并使苗在暗中生长7天，然后连续暴露于光96小时。黄化枝一般为5到6cm长，15到20mg重。细长的胚芽鞘是白色的，在完整的顶芽上均带有可见的黄色不成熟的叶子。暴露于光6小时后，胚芽鞘的顶芽已断裂，肉眼可见叶片开始变绿并伸展开。叶子继续变绿并在光处理96小时后完全伸展。相反，剩下的胚芽鞘在暴露于光后，长度没什么变化，而且苗的重量只有轻微的增加。
在96小时的光处理期间的不同时间收集苗。从这些苗制备总RNA，在琼脂糖凝胶上分离、印迹，然后用放射性标记的λPCK100101的1.4kb插入片段检测。还包括了来自光生长植物根和绿叶组织的总RNA。在来自绿叶的总RNA中，用部分PCK cDNA探针检测的主要种类是2.7kb长。所述探针还与异源的小于2.7kb的RNA条带杂交。在使用来自poly(A)+RNA的实验中，只检测到2.7kb RNA。因此，该种最有可能是PCK1 mRNA，而在总RNA中的异源条带可能是没有poly(A)尾的PCK1转录本。所述的未聚腺苷酸化的RNA可能产生于PCK1 mRNA的降解或PCK1转录本的未成熟终止。
1.4kb的cDNA探针末在来自根和黄化苗的总RNA中检测到PCK1 mRNA。然而，变绿6小时后，在苗中检测到PCK1 mRNA。在接下来的84小时中，所述DNA的丰度稳定增加，但在光照期间，所述PCK mRNA的丰度与绿叶组织中的从不一样。尽管仅在暴露于光6小时后就出现了2.7kb的转录本，但是在暴露于光48小时后才检测到异源条带。实施例2  克隆并鉴定PCK2
重复与实施例1中相同的方法。结果，通过分析在分离PCK1 cDNA中所得到的阳性克隆，得到了与PCK1 cDNA高度同源但是其核苷酸序列不同于PCK1 cDNA的克隆。图2中列出了重叠克隆。λPCK170204的插入片段与λPCK190202和λPCK110101的插入片段分别重叠227和107bp。这些克隆的重叠区有相同的序列。结果，确定了共2245bp的cDNA序列，含有1878bp的开放阅读框架(ORF)，列于序列表的SEQ ID NO：2。所述ORF编码626个残基的蛋白质。编码所述ORF的基因被称为PCK2。PCK2 ORF的两侧是延伸向poly(A)尾的304bp的3′非翻译区和44bp的5′非翻译区。PCK2编码的氨基酸序列与PCK1编码的氨基酸序列有96％的同源性，在这些序列中有26个氨基酸残基不同，有22个氨基酸残基是相似氨基酸残基。在图3中列出了PCK1和PCK2氨基酸序列间的比较。实施例3  将PCK基因导入水稻并表达1.构建在植物中表达PCK cDNA的基因材料和方法植物材料和基因组DNA的分离
用Komari等人的方法(Komari T，Saito Y，Nakakido F，Kumashiro T：Efficient selection of somatic hybridsinNicotiana tabacum L.using a combination of drug-resistance markers introduced  by transformation.Theor，Appl.Genet.77：547-552(1989))从生长于温室中的水稻植物(Oryza sativa cv.Nipponbare)的绿叶或玉米植物(Zea mayL.subsp.mays line B73)的绿叶出提取基因组DNA。DNA操作
根据标准方法(Sambrook J.et al.，上文)进行DNA操作。用DNA合成仪392(Applied Biosystems，USA)制备寡DNA。根据标准方去(Mcpherson MJ，Quirke P，Taylor GR：PCR.A practicalapproach.Oxford express press，Oxford NY(1991))进行PCR。为了亚克隆PCR产物，使用TA克隆试剂盒(商标：Invitrogen，USA)。用DNA循环测序试剂盒(商标：Applied  Biosystems，USA)和测序仪373A(Applied Biosystems，USA)进行测序。制备其他DNA区
用基于玉米磷酸烯醇丙醇酸羧化酶启动子区的序列(HudspethRL，Grula JW：Structure and expression of the maizegene encoding  the phosphoenolpyruvate varboxylaseisozyme involved in photosynthesis.Plant Mol.Biol.12：579-589(1989))合成的引物经PCR方法从玉米基因组DNA中分离启动子。所用引物的核苷酸序列如下：向前的引物：5′-AGACGACTCTTAGCCACAGCC-3′反向引物：  5′-TCGATGGAGTGGTGCTTCTC-3′
至于终止子，使用在质粒DNA pGL2(Biland  B.Iida S.Peterhans A，Potrykus I.Panszkowski J：The 3′-terminalregion of the hygromycin-B-resistance gene isimportant for its activity in  Escherichia coli  andNicotiana tabacum Gene 100：247-250(1991)上的花椰菜花叶病毒35S终止子(SphI-EcoRI片段)。
使用基于水稻Rubisco小亚基序列(Matsuoka M，Kano-Murakame Y，Tanaka Y，Ozeki Y，Yamamoto N：Classification and mucleotide sequence of cDNA encodingthe small subunit of ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylass from rice Plant Cell physiol，29：1015-1022(1988))合成的引物经PCR方法从水稻基因组DNA中分离编码过渡肽的区域。所用引物的核苷酸序列如下：向前的引物：5′-GGAATTCCATGGTGCATCTCAAGAAGTAC-3′反向引物：  5′-GCTCTAGACTGCATGCACCTGATCC-3′
在λPCK170204和λPCK100101插入片段的KpnI位点连接编码被运输到叶绿体的PCK的基因，将上述编码过渡肽的基因连在PCK2编码的第57位Ser的下游位点。
在质粒DNA pUC18(Yanish-perron c，Vieira J，MessingJ：Improved M13 phage Cloning vectors and hoststrains：nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19vector.Gene 33：103-119(1985))的多克隆位点中按所述的顺序插入启动子，编码过渡肽和PCK基因，以及终止子。将所构建的质粒命名为pPCK。
图4中列出了所构建质粒的基因图谱。所构建的cDNA区的核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO：3。在SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中，nt1-nt153是编码源自水稻Rubisco小亚基之过渡肽的区域，nt154-nt966是编码PCK2N-末端侧的区域，nt967-nt1863是编码PCK1 C-末端测的区域。2.转化水稻植物材料和方法
用70％乙醇将Japonica水稻变种“Tsukinohikari”的种子表面消毒30秒，然后用1％次氯酸钠消毒40秒，然后用无菌水洗涤3次。将种子放在2N6固体培养基上，于30℃在暗中培养，来自未成熟种子之scutella去分化的愈伤组织于25℃暗中次级培养于N6液体培养基中，同时以125rpm旋转。每周在新鲜的培养基中次级培养培养的细胞。
将次级培养开始3天的细胞悬于含有1.0％Cellulase Onozuka(Yakult Honsha，Japan)，1.0％ Macerozyme(Yakult Honsha，Japan)，0.1％Pectoriaze Y-23(Seishin Seiyaku，Japan)，0.5％Dricellase(Kyowa Hakko，Japan)和0.4M甘露醇的酶溶液中，然后，将悬浮液放在30℃的暗中保持3小时。然后使细胞悬液通过20μm的尼龙筛过滤，将所得的滤物以50xg离心5分钟。将所得的原生质体沉淀悬浮于0.4M甘露醇中，用所述的溶液将原生质体洗涤两次。
将所得的原生质体悬浮于EPAA缓冲液(Tada Y，Sakaoto M，Fujimura T：Efficient gene introduction into rice byelectroporation and analysis of transgenic plants：use of electroporation buffer lacking chloride ionsTheor.Appl.Genet.80：475-180(1990))中，然后将悬液在冰上放5分钟。向原生质体悬液中加入10μg pGL2质粒和30μgpPCK质粒，用电穿孔仪(Bio-Rad，USA)将250μF，600V/em的电脉冲用于所述的悬液，将脉冲处理的悬液在冰上放15分钟，然后在室温下放30分钟。
经离心收集原生质体，然后悬浮于含1.25％Seeplaque(商标)琼脂糖(FMC，USA)的R2-1培养基中，使细胞群体为3×105细胞/ml。在9cm培养皿上以小滴的形式固化悬浮液。向其中加入R2-1培养基和水稻Oc细胞(Baba A，Hasezawa S，ShonoK：Cultivation of rice protoplasts and theirtransformation mediated by Agrobacterium Spheroplast.Plant Cell  Physiol.27：463-471(1986))，于25℃在暗中培养所得的悬液。
两星期后，除去液体培养基和Oc细胞，然后加入R2-t培养基，于25℃在连续光照下培养。一星期后，用含40mg/l潮霉素的R2-t培养基取代所述的培养基，然后继续培养。一星期后，将含有直径为0.2-0.5mm愈伤组织的琼脂糖滴与少量无菌水一起破碎，将所得的产物放在N6-12培养基上，然后在连续光照下于25℃培养所得的产物。当愈伤组织生长到直径不小于2mm时，将愈伤组织移植到含有40mg/l潮霉素的N6S3培养基中，继续培养。将生长到高度不低于10cm的分化植物移植到盆中，放在温室中培养。培养基的组成2N6培养基(pH5.8)
N6基本培养基(Chu 1978)
酪蛋白氨基酸                           1000mg/ml
2，4-D                                 2.0mg/ml
蔗糖                                   20000mg/ml
Gelrite                                    2000mg/mlN6液体培养基(pH5.8)
N6基本培养基(Chu 1978)
酪蛋白氨基酸                               300mg/ml
2，4-D                                     1.0mg/ml
蔗糖                                       30000mg/mlR2-1培养基(pH5.8)
R2培养基无机盐(0hira等人，1973)
MS培养基维生素(Murashige和Skoog 1962)
酪蛋白氨基酸                               1000mg/ml
2，4-D                                     1.0mg/ml
n-丙基没食子酸                             0.05mg/ml
蔗糖                                       68500mg/ml
葡萄糖                                     36000mg/mlR2-t培养基(pH5.8)
R2培养基无机盐
MS培养基无机组分
酪蛋白氨基酸                               1000mg/ml
2，4-D                                     1.0mg/ml
蔗糖                                       20000mg/ml
葡萄糖                                     10000mg/mlN6-12培养基(pH5.8)
N6基本培养基
酪蛋白氨基酸                               2000mg/ml
2，4-D                                     0.2mg/ml
6-BA                                 0.5mg/ml
ABA                                  5.0mg/ml
蔗糖                                 20000mg/ml
D-山梨醇                             30000mg/ml
Gelrite                              2000mg/mlN6S3培养基
半浓度的N6培养基主要盐
N6培养基微量盐
N6培养基维生素
AA培养基氨基酸(Toriyama和Hinata 1985)
酪蛋白氨基酸                        1000mg/ml
NAA                                 0.2mg/ml
激动素                              1.0mg/ml
蔗糖                                20000mg/ml
Gelrite                             3000mg/ml参考文献Chu，C.-C.(1978)The N6 medium and its application toanther culture of cereal crops.In Proc.Symp.PlantTissue Culture.Peking：Science Press，pp.43-50；Murashige，T.and Skoog，F.(1962)A revised medium forrapid growth and bio assay with tobacco tissue culture.Physiol.Plant.15：473-497；Ohira，K.，Ojima，K.and Fujiwara，A.(1973)Studies on thenutrition of rice cell culture I.A simple，definedmedium for rapid growth in suspension culture.Plant CellPhysiol.14：1113-1121；Toriyama，K.，Hinata，K.and sasaki，T.(1986)Haploid和diploid plant regeneration from protoplasts of anthercallus in rice.Theor.Appl.Genet.73：16-19.3.PCK蛋白质在转化水稻植物中的位置材料和方法
从在人工气候箱(28℃天/22℃夜，天长方式16小时)生长的转化水稻的绿叶中除去主要的叶脉，然后将叶子切成0.5-1mm宽的小片。于30℃将所得的叶片用含有0.8％Cellulase OnozukaRS，0.8％Fancellase(Yakult Honsha Japan)，0.25％PectriazeY-23，150mM磷酸钠缓冲液(pH5.6)，0.3％牛血清白蛋白和0.4M甘露醇的酶溶液消化1小时。用缓冲液(50mM Hepes-KOH pH7.0，0.33M山梨醇，2mM  EDTA，1mM  MgCl2，1mM MnCl2，0.1％牛血清白蛋白)洗涤所处理的组织，然后悬浮于约10倍体积含有1mg/mm抗坏血酸钠的冰缓冲液中，接着用Polytron匀浆器(商标，KinematicaSwitzwerland)将组织匀浆。以最高动力用Polytron匀浆器3秒钟匀浆两次。将所得的匀浆物通过4-ply  Miracloth(商标，Calbiochem，USA)过滤，然后将过滤物快速离心(当其达到6000xg时，降低转速)。将所得的沉淀悬浮于缓冲液中，将所得的悬浮液作为叶绿体样品。向所述样品中加入胰蛋白酶达到50μg/ml的浓度，将混合物在冰上放30分钟。进行完所述的胰蛋白酶处理后，通过10,000xg离心3分钟收集叶绿体，然后悬浮于50mM Hepes-KOH(pH8.0)中。将所述的悬浮液冻于-80℃，然后在室温融解以破碎叶绿体。将破碎的叶绿体以10,000xg离心5分钟，然后将所得的悬浮液(叶绿体的可溶组分)经受SDS-PAGE。电泳后，将凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维素膜上，用抗U.panicoides PCK蛋白质兔抗血清，过氧化物酶标记的抗兔IgG山羊抗体(MBL)和HRP着色试剂盒(商标，Bio-Rad，USA)检测PCK蛋白质。结果：
在所分离的叶绿体的可溶组分中，检测到其大小与加工的过渡肽的大小相对应的PCK蛋白质。由于通过胰蛋白酶处理分离的叶绿体并未降低PCK蛋白质，所以认为PCK蛋白质已被转移到叶绿体中(基质组分)。4.检测被转化水稻的PCK活性材料和方法
下列所有的操作均在4℃完成。用杵和臼将水稻转化体(PKS12和PKS18)的各约0.2g绿叶与1ml提取缓冲液(50mM Hepes-KOH，pH7.0，2mM MnCl2，2mM MgCl2，1mM EDTA，0.1％(v/v)2-巯基乙醇，1mM  PMSF，1mM苄脒，1mM 6-氨基-n-己酸，10％(w/v)甘油，0.2％(w/v)抗坏血酸钠，2％(w/v)Polycral AT)一起磨碎。以15,000xg将所得的磨碎溶液离心20分钟，将所得的上清液用于经柱缓冲液(25mM  Hepes-KOH，pH 7.0，2mM MnCl2，2mM MgCl2，0.1％(v/v)2-巯基乙醇，10％(w/v)甘油)预先平衡的NAP5(商标)柱(Pharmacia，瑞典)以进行脱盐，由此得到粗提取物。根据Winterman和deMots的方法(Winterman JFGM，De Mots A：Spectrophotometriccharacteristics of chlorophylls a and b and theirpheophytins  in ethanol Biochem，Biophys，Acta 109：448-453(1965))定量分析在磨碎溶液中的叶绿素。根据Bradford方法(33页)用Protein Assay试剂盒(商标，Bio-Rad，USA)定量分析粗提取物中的蛋白质。通过测量1ml反应混合物在280nm草酰乙酸吸收值降低的速率来测量磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，所述的反应混合物含有25mM Hepes-KOH pH7.5，4mM DTT，0.2mM草酰乙酸，1单位丙酮酸激酶，0.2mM ATP和50μl粗提取物。结果：
检测在转化水稻和非转化水稻绿叶的粗提取物中的PCK活性。然而，在非转化水稻中基本上没有检测到PCK活性。
                       表2
转化水稻的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性
转化体     酶活性(单位/mg叶绿素)
PKS  12     1.61
PKS  18     2.99
对照1     0.00
对照2     0.00
这些结果表明活性PCK蛋白质位于转化水稻植物的叶绿体中，通过将编码水稻Rubisco小亚单位的序列加到编码从U.panicoides分离的PCK蛋白质的cDNA中而制备的嵌合基因导入所述的水稻植物中即可得到转化水稻植物。
                        序列表SEQ ID NO：1序列长度：2220序列类型：核酸序列描述：CTCCACACCG CTTCCTCGGC GGCCGGCGCA CGTCGCTGCT CCCGACGCTC GAACGAG       57ATG GCG-TCG-CCG AAC GGT GGT GTC ACG ACC TAT GAC TAC GAC GAC AGC     105Met Ala Ser Pro Asn Gly Gly Val Thr Thr Tyr Asp Tyr Asp Asp Ser1               5                   10                  15GAC AGC GCG GCG CCG GTG CGC GCG CAG ACC ATC GAG GAG CTG CAT TCG     153Asp Ser Ala Ala Pro Val Arg Ala Gln Thr Ile Glu Glu Leu His Ser
        20                  25                  30CTG CAG CGG AAG GCT GCC GCC ACG GCC AAG GAT AGC GCA TCG CCC CTG     201Leu Gln Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Lys Asp Ser Ala Ser Pro Leu
    35                  40                  45CAG TCC ATC AGC GCG TCA TTG GCG TCT ACG GCA CGT GAA TAT GGC CCC     249Gln Ser Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ser Thr Ala Arg Glu Tyr Gly Pro
50                  55                  60AAC CTC GTC AAG GGT GAC CCG GAA GCG AAG GGC GCG CCG CCG GCG CCG     297Asn Leu Val Lys Gly Asp Pro Glu Ala Lys Gly Ala Pro Pro Ala Pro65                  70                  75                  80GTA AAG CAC CAG CAG GCC GCC GCC GCT GCC GCC ATC GCC GCC AGT GAC     345Val Lys His Gln Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp
            85                  90                  95AGC TCC CTC AAG TTC ACC CAT GTC CTC TAC AAC CTC TCC CCC GCT GAG     393Ser Ser Leu Lys Phe Thr His Val Leu Tyr Asr Leu Ser Pro Ala Glu
        100                 105                 110CTG TAC GAG CAG GCT TTC GGG CAA AAG AAG AGT TCG TTC ATC ACG TCG     441Leu Tyr Glu Gln Ala Phe Gly Gln Lys Lys Ser Ser Phe Ile Thr Ser
    115                 120                 125ACC GGC GCG CTG GCC ACG CTG TCC GGC GCC AAG ACC GGT CGG TCG CCC     489Thr Gly Ala Leu Ala Thr Leu Ser Gly Ala Lys Thr Gly Arg Ser Pro
130                 135                 140AGG GAC AAG CGC GTC GTC AAG GAC GAC ACC ACC GCG CAG GAG CTG TGG     537Arg Asp Lys Arg Val Val Lys Asp Asp Thr Thr Ala Gln Glu Leu Trp145                 150                 155                 160TGG GGC AAG GGC TCG CCC AAC ATC GAG ATG GAC GAG CGC CAG TTC GTG     585Trp Gly Lys Gly Ser Pro Asn Ile Glu Met Asp Glu Arg Gln Phe Val
            165                 170                 175ATC AAC AGG GAG CGG GCC CTG GAC TTC CTC AAC TCC CTG GAC AAG GTG     633Ile Asn Arg Glu Arg Ala Leu Asp Phe Leu Asn Ser Leu Asp Lys Val
        180                 185                 190TAC GTC AAC GAC CAG TTC CTC AAC TGG GAC CCC GAG AAC CGC ATC AAG     681Tyr Val Asn Asp Gln Phe Leu Asn Trp Asp Pro Glu Asn Arg Ile Lys
    195                 200                 205GTC CGG ATC ATC ACC TCC AGG GCG TAC CAC GCC CTC TTC ATG CAC AAC     729Val Arg Ile Ile Thr Ser Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met His Asn
210                 215                 220ATG TGC ATC CGT CCC ACC GAG GAG GAG CTG GAG ACC TTC GGC ACG CCG     777Met Cys Ile Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Glu Thr Phe Gly Thr Pro225                 230                 235                 240GAC TTC ACC ATT TAC AAC GCC GGG GAG TTC CCC GCC AAC CGT TAC GCC     825Asp Phe Thr Ile Tyr Asn Ala Gly Glu Phe Pro Ala Asn Arg Tyr Ala
            245                 250                 255AAC TAC ATG ACG TCG TCG ACG AGC ATA AAC ATC AGC CTC GCT AGG AGG     873Asn Tyr Met Thr Ser Ser Thr Ser Ile Asn Ile Ser Leu Ala Arg Arg
        260                 265                 270GAG ATG GTG ATC CTG GGC ACG CAG TAC GCT GGG GAG ATG AAG AAG GGC     921Glu Met Val Ile Leu Gly Thr Gln Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly
    275                 280                 285CTC TTC GGC GTC ATG CAC TAC CTC ATG CCC AAG CGC GGC ATC CTC TCG     969Leu Phe Gly Val Met His Tyr Leu Met Pro Lys Arg Gly Ile Leu Ser
290                 295                 300CTG CAC TCC GGG TGC AAC ATG GGC AAG GAA GGT GAC GTC GCC CTC TTC    1017Leu His Ser Gly Cys Asn Met Gly Lys Glu Gly Asp Val Ala Leu Phe305                 310                 315                 320TTC GGG CTC TCA GGT ACC GGG AAG ACG ACG CTG TCA ACT GAC CAC AAC    1065Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Thr Asp His Asn
            325                 330                 335AGG CTC CTG ATC GGT GAT GAC GAG CAC TGC TGG AGC GAC AAT GGC GTC    1113Arg Leu Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Cys Trp Ser Asp Asn Gly Val
        340                 345                 350TCC AAC ATT GAG GGA GGT TGC TAT GCC AAG TGC ATC GAC CTG TCC AAG    1161Ser Asn Ile Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Cys Ile Asp Leu Ser Lys
    355                 360                 365GAG AAA GAA CCT GAT ATC TGG AAC GCC ATC ACG TTT GGA ACA GTG CTG    1209Glu Lys Glu Pro Asp Ile Trp Asn Ala Ile Thr Phe Gly Thr Val Leu
370                 375                 380GAA AAC GTC GTC TTC AAC GAG CGC ACT CGT GAA GTT GAC TAC GCC GAC    1257Glu Asn Val Val Phe Asn Glu Arg Thr Arg Glu Val Asp Tyr Ala Asp385                 390                 395                 400AAA TCT ATC ACC GAG AAC ACC CGG GCC GCC TAC CCG ATC GAG TTC ATC    1305Lys Ser Ile Thr Glu Asn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro Ile Glu Phe Ile
            405                 410                 415CCC AAC GCC AAG ATC CCA TGC GTC GGG CCG CAC CCC AAG AAC GTC ATC    1353Pro Asn Ala Lys Ile Pro Cys Val Gly Pro His Pro Lys Asn Val Ile
        420                 425                 430CTC CTG GCC TGC GAC GCG TAC GGC GTG CTC CCG CCG GTG ACC AAG CTC    1401Leu Leu Ala Cys Asp Ala Tyr Gly Val Leu Pro Pro Val Ser Lys Leu
    435                 440                 445AAC CTG GCG CAG ACC ATG TAC CAC TTC ATC AGC GGC TAC ACT GCC ATC    1449Asn Leu Ala Gln Thr Met Tyr His Phe Ile Ser Gly Tyr Thr Ala Ile
450                 455                 460GTC GCC GGC ACG GAG GAC GGC GTC AAG GAG CCG ACG GCG ACC TTC TCG    1497Val Ala Gly Thr Glu Asp Gly Val Lys Glu Pro Thr Ala Thr Phe Ser465                 470                 475                 480GCC TGC TTC GGC GCG GCC TTC ATC ATG TAC CAC CCC ACC AAG TAC GCC    1545Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Ile Met Tyr His Pro Thr Lys Tyr Ala
            485                 490                 495GCC ATG CTC GCC GAG AAG ATG CAG AAG TAC GGC CGC ACC GGG TGG CTT    1593Ala Met Leu Ala Glu Lys Met Gln Lys Tyr Gly Arg Thr Gly Trp Leu
        500                 505                 510GTC AAC ACC GGC TGG TCC GGC GGC AGG TAC GGT GTG GGC AAC AGG ATC    1641Val Asn Thr Gly Trp Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Val Gly Asn Arg Ile
    515                 520                 525AAG CTG CCG TAC ACC AGG AAG ATC ATC GAC GCC ATC CAC TCC GGC GAG    1689Lys Leu Pro Tyr Thr Arg Lys Ile Ile Asp Ala Ile His Ser Gly Glu
530                 535                 540CTC CTC ACC GCC AAC TAC AAG AAG ACC GAG GTG TTC GGG CTG GAG ATC    1737Leu Leu Thr Ala Asn Tyr Lys Lys Thr Glu Val Phe Gly Leu Glu Ile545                 550                 555                 560CCC ACC GAG ATC AAC GGC GTG CCG TCG GAA ATC CTC GAC CCC GTC AAC    1785Pro Thr Glu Ile Asn Gly Val Pro Ser Glu Ile Leu Asp Pro Val Asn
            565                 570                 575ACC TGG ACG GAC AAG GCC GCG TAC AAG GAG ACT CTC CTG AAG CTT GCC    1833Thr Trp Thr Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Lys Leu Ala
        580                 585                 590GGG CTC TTC AAG AAC AAC TTC GAG GTG TTC GCC AGC TAC AAG ATC GGG    1881Gly Leu Phe Lys Asn Asn Phe Glu Val Phe Ala Ser Tyr Lys Ile Gly
    595                 600                 605GAC GAC AAC AGC CTG ACC GAA CAG ATC CTT GCC GCA GGC CCC AAC TTC    1929Asp Asp Asn Ser Leu Thr Glu Gln Ile Leu Ala Ala Gly Pro Asn Phe
610                 615                 620TGATTCCAAG CAATGGATCC GGAACGGCGA GGCGTTGGAG TTGGTTCAGA ATGAACCAGT  1989GGTGCGTGTG TGCGTGCGTG TGTTACGATG ATGATGATGA TGGCGAAAAA AAAACTGTTG  2049GACTGATGAT GTGCCAACAT GGAGTAGACC AGCTCTGTAT GCTATCATGT GTGTGTGGTG  2109TTGTTACCTG TGGTTTGTTC TATCTGGGCG TGGTCCTGGT GTAAATCTGT ATGCCTGTTC  2169GGCGGCCTGG TCCTGGTGTA AATCTGGGCG TGCTTTGCAT CTTGCCCGTG T           2220SEQ ID NO：2序列长度：2245序列类型：核酸序列描述：CCTCGGCGGC CGGCGCACGT CGCTGCTCCC GACGCTCGAA CGAG ATG GCG TCG CCG     56
                                             Met Ala Ser ProAAC GGT GGT GTC ACG ACC TAC GAC TAC CAC GAC AGC GAC AGC GCG GCG     104Asn Gly Gly Val Thr Thr Tyr Asp Tyr His Asp Ser Asp Ser Ala Ala5                   10                  15                  20CCG GTG AAC GCG CAG ACC ATC GAA GAG CTG CAT TCG CTG CAG CGG AAG     152Pro Val Asn Ala Gln Thr Ile Glu Glu Leu His Ser Leu Gln Arg Lys
            25                  30                  35GCT GCC ACC ACG ACC AAG GAT GGC GCA TCG CCC CTG CAG TCC ATC AGC     200Ala Ala Thr Thr Thr Lys Asp Gly Ala Ser Pro Leu Gln Ser Ile Ser
        40                  45                  50GCG TCA TTG GCG TCT CTG GCA CGT GAA TAT GGC CCC AAC CTC GTC AAG     248Ala Ser Leu Ala Ser Leu Ala Arg Glu Tyr Gly Pro Asn Leu Val Lys
    55                  60                  65GGT GAC CCG GAA GCG ACC AAG GGC GCG CCG CCG GTG CCG ATA AAG CAC     296Gly Asp Pro Glu Ala Thr Lys Gly Ala Pro Pro Val Pro Ile Lys His
70                  75                  80CAG CAG CCC TCC GCC GCC GCT GCC ACC ATC GCC GCC AGC GAC AGC TCC     344Gln Gln Pro Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ile Ala Ala Ser Asp Ser Ser85                  90                  95                  100CTC AAG TTC ACC CAT GTC CTC TAC AAC CTC TCC CCC GCT GAG TTG TAC     392Leu Lys Phe Thr His Val Leu Tyr Asn Leu Ser Pro Ala Glu Leu Tyr
            105                 110                 115GAG CAG GCT TTC GGC CAA AAG AAG AGT TCG TTC ATC ACG TCG ACC GGC     440Glu Gln Ala Phe Gly Gln Lys Lys Ser Ser Phe Ile Thr Ser Thr Gly
        120                 125                 130GCG CTG GCC ACG CTG TCC GGC GCC AAG ACC GGC CGG TCG CCC AGG GAC     488Ala Leu Ala Thr Leu Ser Gly Ala Lys Thr Gly Arg Ser Pro Arg Asp
    135                 140                 145AAG CGT GTC GTC AAG GAC GAG ACC ACC TCA CAG GAG CTC TGG TGG GGC      536Lys Arg Val Val Lys Asp Glu Thr Thr Ser Gln Glu Leu Trp Trp Gly
150                 155                 160AAG GGC TCG CCC AAC ATC GAG ATG GAC GAG CGC CAG TTC GTG ATC AAC      584Lys Gly Ser Pro Asn Ile Glu Met Asp Glu Arg Gln Phe Val Ile Asn165                 170                 175                 180AGG GAG CGG GCC CTG GAC TAC CTC AAC TCA CTG GAC AAG GTG TAC GTC      632Arg Glu Arg Ala Leu Asp Tyr Leu Asn Ser Leu Asp Lys Val Tyr Val
            185                 190                 195AAC GAC CAG TTC CTC AAC TGG GAC TCG GAG AAC CGC ATC AAG GTC CGC      680Asn Asp Gln Phe Leu Asn Trp Asp Ser Glu Asn Arg Ile Lys Val Arg
        200                 205                 210ATC ATC ACC TCC AGG GCG TAC CAC GCC CTC TTT ATG CAC AAC ATG TGC      728Ile Ile Thr Ser Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met His Asn Met Cys
    215                 220                 225ATC CGG CCC ACG GAA GAG GAG CTG GAG AGC TTC GGC ACG CCG GAC TTC      776Ile Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Glu Ser Phe Gly Thr Pro Asp Phe
230                 235                 240ACC ATT TAC AAC GCC GGG GAG TTC CCC GCC AAC CGT TAC GCC AAC TAC      824Thr Ile Tyr Asn Ala Gly Glu Phe Pro Ala Asn Arg Tyr Ala Asn Tyr245                 250                 255                 260ATG ACG TCG TCG ACG AGC ATA AAC ATC AGC CTC GCT AGG AGG GAG ATG      872Met Thr Ser Ser Thr Ser Ile Asn Ile Ser Leu Ala Arg Arg Glu Met
            265                 270                 275GTA ATC CTG GGC ACG CAG TAC GCC GGG GAG ATG AAG AAG GGG CTC TTT      920Val Ile Leu Gly Thr Gln Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly Leu Phe
        280                 285                 290GGC GTC ATG CAC TAC CTC ATG CCC AAG CGA GGC ATC CTC TCG CTG CAC     968Gly Val Met His Tyr Leu Met Pro Lys Arg Gly Ile Leu Ser Leu His
    295                 300                 305TCC GGG TGC AAC ATG GGC AAG GAG GGT GAC GTC GCC CTC TTC TTT GGG    1016Ser Gly Cys Asn Met Gly Lys Glu Gly Asp Val Ala Leu Phe Phe Gly
310                 315                 320CTC-TCA-GGT ACC GGG AAG ACG ACG CTG TCA ACT GAC CAC AAT AGG CTC    1064Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Thr Asp His Asn Arg Leu325                 330                 335                 340CTG ATC GGT GAT GAC GAG CAC TGC TGG AGC GAC AAT GGC GTC TCC AAC    1112Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Cys Trp Ser Asp Asn Gly Val Ser Asn
            345                 350                 355ATT GAG GGA GGT TGC TAT GCC AAG TGC ATT GAC CTG TCC CAG GAG AAG    1160Ile Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Cys Ile Asp Leu Ser Gln Glu Lys
        360                 365                 370GAA CCT GAT ATC TGG AAC GCC ATC AAG TTT GGA ACT GTG CTG GAG AAC    1208Glu Pro Asp Ile Trp Asn Ala Ile Lys Phe Gly Thr Val Leu Glu Asn
    375                 380                 385GTC GTC TTC AAC GAG CGC ACT CGT GAA GTT GAC TAC GCC GAC AAA TCT    1256Val Val Phe Asn Glu Arg Thr Arg Glu Val Asp Tyr Ala Asp Lys Ser
390                 395                 400ATC ACC GAG AAC ACC CGG GCC GCC TAC CCG ATC GAG TTC ATC CCC AAC    1304Ile Thr Glu Asn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro Ile Glu Phe Ile Pro Asn405                 410                 415                 420GCC AAG ATC CCG TGC GTC GGG CCG CAC CCC AAG AAC GTC ATC CTC CTG    1352Ala Lys Ile Pro Cys Val Gly Pro His Pro Lys Asn Val Ile Leu Leu
            425                 430                 435GCG TGC GAC GCG TAC GGC GTG CTC CCG CCG GTG AGC AAG CTC AAC CTG     1400Ala Cys Asp Ala Tyr Gly Val Leu Pro Pro Val Ser Lys Leu Asn Leu
        440                 445                 450GCG CAG ACC ATG TAC CAC TTC ATC AGC GGC TAC ACC GCC ATC GTC GCC     1448Ala Gln Thr Met Tyr His Phe Ile Ser Gly Tyr Thr Ala Ile Val Ala
    455                 460                 465GGC ACA GAG GAC GCC GTC AAG GAG CCG ACG GCC ACA TTC TCG CCC TGC     1496Gly Thr Glu Asp Gly Val Lys Glu Pro Thr Ala Thr Phe Ser Ala Cys
470                 475                 480TTC GCC CCG GCC TTC ATC ATG TAC CAC CCC ACC AAG TAC GCA CCC ATG     1544Phe Gly Ala Ala Phe Ile Met Tyr His Pro Thr Lys Tyr Ala Ala Met485                 490                 495                 500CTC GCC GAG AAG ATG CAG AAG TAC GGC GCC ACC GGG TGG CTT GTC AAC     1592Leu Ala Glu Lys Met Gln Lys Tyr Gly Ala Thr Gly Trp Leu Val Asn
            505                 510                 515ACT GGC TGG TCC GCC GGC AGG TAC GGT GTG GGC AAC AGG ATC AAG CTG     1640Thr Gly Trp Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Val Gly Asn Arg Ile Lys Leu
        520                 525                 530CCG TAC ACC AGG AAG ATC ATC GAC CCC ATC CAC TCC GGC GAG CTC CTC     1688Pro Tyr Thr Arg Lys Ile Ile Asp Ala Ile His Ser Gly Glu Leu Leu
    535                 540                 545AAC GCC AGC TAC AAG AAG ACC GAG GTG TTC GGG CTG GAG ATC CCC ACC     1736Asn Ala Ser Tyr Lys Lys Thr Glu Val Phe Gly Leu Glu Ile Pro Thr
550                 555                 560GCG ATC AAC GGC GTG CCG TCG GAA ATT CTC GAC CCC GTC AAC ACC TGG     1784Ala Ile Asn Gly Val Pro Ser Glu Ile Leu Asp Pro Val Asn Thr Trp565                 570                 575                 580ACG GAC AAG GCC GCG TAC AAG GAG ACG CTC CTG AAG CTT GCC GGG CTC    1832Thr Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Lys Leu Ala Gly Leu
            585                 590                 595TTC AAG AAC AAC TTC GAG GTG TTC GCC AGC TAC AAG ATC GGG AAC AAC    1880Phe Lys Asn Asn Phe Glu Val Phe Ala Ser Tyr Lys Ile Gly Asn Asn
        600                 605                 610AAC AGC CTG ACA GAA CAG ATC CTC GCC GCA GCG CCC AAC TTC            1922Asn Ser Leu Thr Glu Gln Ile Leu Ala Ala Ala Pro Asn Phe
    615                 620                 625TGATTCCAAG CAATGGATCT GGAACGGCGA GGCGATGGAG TTGGTTCAGA ATAAACCGGT  1982GGTGCGTGCG TGCGTGTGTT ACGATGATGA TGATGGCAAA AAAAAAAACT GTTGGACTGA  2042TTATGTGCCA ACATGCAGTA GACCAGCTCT GTATGCTATC ATGTGTGTGT GGTGGTGTTA  2102CCTGTAAGGT TTGTTCTATC AGCTGGTTCG GCGGCCTGGT TCTGGTGTAA ATCTGGGCGT  2162GCTTTGCATC TTGCCCGTGT ATTCCCTCTT GTTTCAGAAT TTGAATATAT ACTATCTTAT  2222TTCCAAAAAA AAAAAAAAAA AAA                                          2245SEQ ID NO：3序列长度：2109序列类型：核酸序列描述：ATG GCC CCC TCC GTG ATG GCG TCG TCG GCC ACC ACC GTC GCT CCC TTC      48Met Ala Pro Ser Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Thr Val Ala Pro Phe1               5                   10                  15CAG GGG CTC AAG TCC ACC GCC GGC ATG CCC GTC GCC CGC CGC TCC GGC      96Gln Gly Leu Lys Ser Thr Ala Gly Met Pro Val Ala Arg Arg Ser Gly
        20                  25                  30AAC TCC AGC TTC GGC AAC GTC AGC AAT GGC GGC AGG ATC AGG TGC ATG     144Asn Ser Ser Phe Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met
    35                  40                  45CAG TCT AGA TCT CTG GCA CGT GAA TAT GGC CCC AAC CTC GTC AAG GGT      192Gln Ser Arg Ser Leu Ala Arg Glu Tyr Gly Pro Asn Leu Val Lys Gly
50                  55                  60GAC CCG GAA GCG ACC AAG GGC GCG CCG CCG GTG CCG ATA AAG CAC CAG      240Asp Pro Glu Ala Thr Lys Gly Ala Pro Pro Val Pro Ile Lys His Gln65                  70                  75                  80CAG CCC TCC GCC GCC GCT GCC ACC ATC GCC GCC AGC GAC AGC TCC CTC      288Gln Pro Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ile Ala Ala Ser Asp Ser Ser Leu
            85                  90                  95AAG TTC ACC CAT GTC CTC TAC AAC CTC TCC CCC GCT GAG TTG TAC GAG      336Lys Phe Thr His Val Leu Tyr Asn Leu Ser Pro Ala Glu Leu Tyr Glu
        100                 105                 110CAG GCT TTC GGC CAA AAG AAG AGT TCG TTC ATC ACG TCG ACC GGC GCG      384Gln Ala Phe Gly Gln Lys Lys Ser Ser Phe Ile Thr Ser Thr Gly Ala
    115                 120                 125CTG GCC ACG CTG TCC GGC GCC AAG ACC GGC CGG TCG CCC AGG GAC AAG      432Leu Ala Thr Leu Ser Gly Ala Lys Thr Gly Arg Ser Pro Arg Asp Lys
130                 135                 140CGT GTC GTC AAG GAC GAG ACC ACC TCA CAG GAG CTC TGG TGG GGC AAG      480Arg Val Val Lys Asp Glu Thr Thr Ser Gln Glu Leu Trp Trp Gly Lys145                 150                 155                 160GGC TCG CCC AAC ATC GAG ATG GAC GAG CCC CAG TTC GTG ATC AAC AGG      528Gly Ser Pro Asn Ile Glu Met Asp Glu Arg Gln Phe Val Ile Asn Arg
            165                 170                 175GAG CGG GCC CTG GAC TAC CTC AAC TCA CTG GAC AAG GTG TAC GTC AAC      576Glu Arg Ala Leu Asp Tyr Leu Asn Ser Leu Asp Lys Val Tyr Val Asn
        180                 185                 190GAC CAG TTC CTC AAC TGG GAC TCG GAG AAC CGC ATC AAG GTC CGC ATC      624Asp Gln Phe Leu Asn Trp Asp Ser Glu Asn Arg Ile Lys Val Arg Ile
    195                 200                 205ATC ACC TCC AGG GCG TAC CAC GCC CTC TTT ATG CAC AAC ATG TGC ATC      672Ile Thr Ser Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met His Asn Met Cys Ile
210                 215                 220CGG CCC ACG GAA GAG GAG CTG GAG AGC TTC GGC ACG CCG GAC TTC ACC      720Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Glu Ser Phe Gly Thr Pro Asp Phe Thr225                 230                 235                 240ATT TAC AAC GCC GGG GAG TTC CCC GCC AAC CGT TAC CCC AAC TAC ATG      768Ile Tyr Asn Ala Gly Glu Phe Pro Ala Asn Arg Tyr Ala Asn Tyr Met
            245                 250                 255ACG TCG TCG ACG AGC ATA AAC ATC AGC CTC GCT AGG AGG GAG ATG GTA      816Thr Ser Ser Thr Ser Ile Asn Ile Ser Leu Ala Arg Arg Glu Met Val
        260                 265                 270ATC CTG GGC ACG CAG TAC GCC GGG GAG ATG AAG AAG GGG CTC TTT GGC      864Ile Leu Gly Thr Gln Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly Leu Phe Gly
    275                 280                 285GTC ATG CAC TAC CTC ATG CCC AAG CGA GGC ATC CTC TCG CTG CAC TCC      912Val Met His Tyr Leu Met Pro Lys Arg Gly Ile Leu Ser Leu His Ser
290                 295                 300GGG TGC AAC ATG GGC AAG GAG GGT GAC GTC GCC CTC TTC TTT GGG CTC      960Gly Cys Asn Met Gly Lys Glu Gly Asp Val Ala Leu Phe Phe Gly Leu305                 310                 315                 320TCA GGT ACC GGG AAG ACG ACG CTG TCA ACT GAC CAC AAC AGG CTC CTG     1008Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Thr Asp His Asn Arg Leu Leu
            325                 330                 335ATC GGT GAT GAC GAG CAC TGC TGG AGC GAC AAT GGC GTC TCC AAC ATT    1056Ile Gly Asp Asp Glu His Cys Trp Ser Asp Asn Gly Val Ser Asn Ile
        340                 345                 350GAG GGA GGT TGC TAT GCC AAG TGC ATC GAC CTG TCC AAG GAG AAA GAA    1104Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Cys Ile Asp Leu Ser Lys Glu Lys Glu
    355                 360                 365CCT GAT ATC TGG AAC GCC ATC ACG TTT GGA ACA GTG CTG GAA AAC GTC    1152Pro Asp Ile Trp Asn Ala Ile Thr Phe Gly Thr Val Leu Glu Ash Val
370                 375                 380GTC TTC AAC GAG CGC ACT CGT GAA GTT GAC TAC GCC GAC AAA TCT ATC    1200Val Phe Asn Glu Arg Thr Arg Glu Val Asp Tyr Ala Asp Lys Ser Ile385                 390                 395                 400ACC GAG AAC ACC CGG GCC GCC TAC CCG ATC GAG TTC ATC CCC AAC GCC    1248Thr Glu Asn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro Ile Glu Phe Ile Pro Ash Ala
            405                 410                 415AAG ATC CCA TGC GTC GGG CCG CAC CCC AAG AAC GTC ATC CTC CTG GCC    1296Lys Ile Pro Cys Val Gly Pro His Pro Lys Asn Val Ile Leu Leu Ala
        420                 425                 430TGC GAC GCG TAC GGC GTG CTC CCG CCG GTG AGC AAG CTC AAC CTG GCG    1344Cys Asp Ala Tyr Gly Val Leu Pro Pro Val Ser Lys Leu Asn Leu Ala
    435                 440                 445CAG ACC ATG TAC CAC TTC ATC AGC GGC TAC ACT GCC ATC GTC GCC GGC    1392Gln Thr Met Tyr His Phe Ile Ser Gly Tyr Thr Ala Ile Val Ala Gly
450                 455                 460ACG GAG GAC GGC GTC AAG GAG CCG ACG GCG ACC TTC TCG GCC TGC TTC    1440Thr Glu Asp Gly Val Lys Glu Pro Thr Ala Thr Phe Ser Ala Cys Phe465                 470                 475                 480GGC GCG GCC TTC ATC ATG TAC CAC CCC ACC AAG TAC GCC GCC ATG CTC     1488Gly Ala Ala Phe Ile Met Tyr His Pro Thr Lys Tyr Ala Ala Met Leu
            485                 490                 495GCC GAG AAG ATG CAG AAG TAC GGC CGC ACC GGG TGG CTT GTC AAC ACC     1536Ala Glu Lys Met Gln Lys Tyr Gly Arg Thr Gly Trp Leu Val Asn Thr
        500                 505                 510GGC TGG TCC GGC GGC AGG TAC GGT GTG GGC AAC AGG ATC AAG CTG CCG     1584Gly Trp Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Val Gly Asn Arg Ile Lys Leu Pro
    515                 520                 525TAC ACC AGG AAG ATC ATC GAC GCC ATC CAC TCC GGC GAG CTC CTC ACC     1632Tyr Thr Arg Lys Ile Ile Asp Ala Ile His Ser Gly Glu Leu Leu Thr
530                 535                 540GCC AAC TAC AAG AAG ACC GAG GTG TTC GGG CTG GAG ATC CCC ACC GAG     1680Ala Asn Tyr Lys Lys Thr Glu Val Phe Gly Leu Glu Ile Pro Thr Glu545                 550                 555                 560ATC AAC GGC GTG CCG TCG GAA ATC CTC GAC CCC GTC AAC ACC TGG ACG     1728Ile Asn Gly Val Pro Ser Glu Ile Leu Asp Pro Val Asn Thr Trp Thr
            565                 570                 575GAC AAG GCC GCG TAC AAG GAG ACT CTC CTG AAG CTT CCC GGG CTC TTC     1776Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Lys Leu Ala Gly Leu Phe
        580                 585                 590AAG AAC AAC TTC GAG GTG TTC GCC AGC TAC AAG ATC GGG GAC GAC AAC     1824Lys Asn Asn Phe Glu Val Phe Ala Ser Tyr Lys Ile Gly Asp Asp Asn
    595                 600                 605AGC CTG ACC GAA CAG ATC CTT GCC GCA GGC CCC AAC TTC TGATTCCAAG      1873Ser Leu Thr Glu Gln Ile Leu Ala Ala Gly Pro Ash Phe   610                   615                 620CAATGGATCC GGAACGGCGA GGCGTTGGAG TTGGTTCAGA ATGAACCAGT GGTGCGTGTG 1933TGCGTGCGTG TGTTACGATG ATGATGATGA TGGCGAAAAA AAAACTGTTG GACTGATGAT 1993GTGCCAACAT GGAGTAGACC AGCTCTGTAT GCTATCATGT GTGTGTGGTG TTGTTACCTG 2053TGGTTTGTTC TATCTGGGCG TGGTCCTGGT GTAAATCTGT ATGCCTGTTC GGCGGC     2109

Claims (28)

1.编码序列表SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的克隆DNA，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
2.根据权利要求1的DNA，它编码序列表SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。
3.编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第57氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外，与从SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第57氨基酸Ser到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
4.根据权利要求3的DNA，它编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第57氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列。
5.编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第61氨基酸Glu到C-末端的氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外，与从SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第61氨基酸Glu到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
6.根据权利要求5的DNA，它编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第61氨基酸Glu到C-末端的氨基酸序列。
7.编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第66氨基酸Leu到C-末端的氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外，与从SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第66氨基酸Leu到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
8.根据权利要求7的DNA，它编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第66氨基酸Leu到C-末端的氨基酸序列。
9.编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第69氨基酸Gly到C-末端的氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外，与从SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第69氨基酸Gly到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
10.根据权利要求9的DNA，它编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第69氨基酸Gly到C-末端的氨基酸序列。
11.编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第75氨基酸Gly到C-末端的氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外，与从SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第75氨基酸Gly到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
12.根据权利要求11的DNA，它编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第75氨基酸Gly到C-末端的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-12中任一项的DNA，它具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列区的核苷酸序列，所述的区域编码权利要求1-12所述的氨基酸序列。
14.编码序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的克隆DNA，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
15.根据权利要求14的DNA，它编码序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。
16.编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的第57氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外，与从SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的第57氨基酸Ser到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
17.根据权利要求16的DNA，它编码SEQ ID NO：2所示第57氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列。
18.根据权利要求14-17中任一项的DNA，它具有SEQ IDNO：2所示核苷酸序列区的核苷酸序列，所述的区域编码权利要求14-17所述的氨基酸序列。
19.编码序列表SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的克隆DNA，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
20.根据权利要求19的DNA，它编码序列表SEQ ID NO：3所示氨基酸序列。
21.编码SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第52氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列或编码除加入、缺失、插入或取代一个或多个氨基酸外，与从SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第52氨基酸Ser到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，条件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
22.根据权利要求21的DNA，它编码SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第52氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列。
23.根据权利要求19-22中任一项的DNA，它具有SEQ IDNO：3所示核苷酸序列区的核苷酸序列，所述的区域编码权利要求19-22所述的氨基酸序列。
24.含有权利要求1-23中任一项所述DNA的重组载体，它可以在所述的宿主细胞中表达所述的DNA。
25.用权利要求24的重组载体转化的植物细胞，它可产生磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。
26.根据权利要求25的植物细胞，它是水稻细胞。
27.权利要求1-23中任一权项的DNA在制备能够产生磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的植物中的用途。
28.权利要求27的用途，其中所述植物是水稻。
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