CN1169424C - 透明颤菌血红蛋白基因在植物耐涝中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了透明颤菌血红蛋白基因在植物耐涝中的应用。我们将透明颤菌血红蛋白基因构建在表达载体中，并将表达载体转入植物细胞，使透明颤菌血红蛋白基因在植物细胞中表达。由转化的植物细胞再生的转基因植物产生了耐涝性。尤其是将透明颤菌血红蛋白基因转入旱生植物并表达后，其耐涝性显著增强。

Description

透明颤菌血红蛋白基因在植物耐涝中的应用

                          技术领域

本发明涉及透明颤菌血红蛋白基因的用途，更具体涉及一种透明颤菌血红蛋白基因在转基因植物中耐涝性的用途。

                          背景技术

一些生物体内存在着一种O₂结合蛋白——血红蛋白。血红蛋白现在已在细菌、酵母、植物和动物中都有发现。所有的血红蛋白有一个共同点：即含有一个结合铁离子的血红素群，负责与氧的结合。植物、动物及细菌性血红蛋白可能由同一个最原始的血红球蛋白演变而来，基因序列分析表明：植物和动物血红蛋白的分化大约在9亿-14亿年前。而氨基酸序列数据显示：大肠杆菌和酵母黄素血红蛋白是目前发现的最原始的血红蛋白，这两种生物的血红蛋白至少在18亿年前就已分化(Hardison RC 1996 Proc Natl Acad Sci USA，93：5675-5679)。植物界中，最早是KUBO于1939年(Kubo H(1939)in Appledy CA(1992)Sci Prog，76：365-398)在豆科植物固氮根瘤中发现豆血红蛋白。随着研究的不断深入，人们发现植物界中就象动物界一样普遍存在着血红蛋白和非共生血红蛋白两大类，前者包括豆科植物根瘤共生血红蛋白。共生血红蛋白只存在于固氮的根瘤中，其它器官和其它非氮植物中不存在，主要功能是加强O₂的运输，一方面使固氮能够得到足够的氧气用于自身在固氮过程中的增殖，另一方面又要确保O₂敏感的固氮酶隔绝O₂，所以共生血红蛋白的主要功能是O₂的运输及其再分配。非共生血红蛋白与O₂、CO、NO等小配体的亲和力非常高而解离常数低，作为O₂载体或O₂感受体，结合并运输一些有机小分子如脂肪酸，厌氧条件下参加有机物的合成。DUFF等(Duff SM G，Guy PA，Nie X Z，Durnin D C，Hill R D 1998 Seed Science Research，8(4)：431-436；Duff S M G，Wittenberg J B，Hill R D 1997 J Biol Chem，272：16746-16752)根据大麦血红蛋白(Hemoglobin)表达的时空特性，推测非共生血红蛋白可能是植物对缺氧反应的一个组分。在大部分高等植物中，正常生长条件下，非共生血红蛋白(Hemoglobin)的表达量都很低。关于非共生血红蛋白的生理功能现在还不是很清楚，有2个主要假说：1、加强根组织中O₂的扩散和O₂浓度的感知；2、使得植物细胞从需氧代谢转向厌氧代谢。该类蛋白可能还具有充当末端氧化酶、负责金属离子的还原等功能。最初人们试图将植物或人类的血红蛋白转入原来不具有血红蛋白的植物中，以加强固氮或者植物的供氧。但是，人们却未能看到预期的结果。例如，其它种类的血红蛋白在烟草中的表达并没有显著效应(Landsmann J.Liewellyn D，Dennis ES，Peacock WJ 1988 Mol Gen Genet，214：68-73；Dieryck W et al 1997Nature，3386：29-30)。

有研究者发现一种严格需O₂的革兰氏阴性菌—透明颤菌(Viteoscilla.Sp.)能够生活在O₂受限的环境，如沼泽、淤泥、腐烂蔬菜植物中，它们的代谢限于氨基酸氧化，而不能使蔗糖酵解。它之所以能够生活在这样的环境中，是因为它能合成一种细菌性的可溶性血红蛋白—透明颤菌。透明颤菌血红蛋白有两个相同的亚基，分子量约为15.8KDa。透明颤菌血红蛋白在结构上与植物和动物的血红蛋白同源，关于它的三维结构已有报道(Tarricone C，Galizzi A，Coda A，Ascenzi P，Bolognesi M 1997 Structure，5：497～507)。

通过VHB和其它植物血红蛋白的氨基酸序列的比较，发现透明颤菌血红蛋白与lupinleghemoglobin的氨基酸相同性最大，有35个氨基酸相同，最大的序列相同性达到24％，而与其血红蛋白的相同序列则仅限于血红蛋白的序列保守区。所以结构上的差异决定了透明颤菌血红蛋白可能与其它血红蛋白在功能上可能存在的差异。分析比较透明颤菌血红蛋白与其它动植物血红蛋白的与O₂结合解离常数后可以更加肯定它们之间的功能差异。透明颤菌血红蛋白与O₂的结合速率虽然较共生血红蛋白低(也许因为共生血红蛋白需要确保固氮酶处于无氧状态)，与其它非共生血红蛋白相比还是最高的。另一方面，透明颤菌血红蛋白与氧结合解离速率常数却是最高的，透明颤菌血红蛋白的相对较低的亲和力使它非常适合作为氧的运输载体，快速地结合氧，并将其运输至需要的地方，再进行快速释放。不少研究表明，在工程菌中转入透明颤菌血红蛋白后，细胞生长的速率提高，细胞的密度增加，克隆的蛋白或者抗生素产量提高。可能原因是透明颤菌血红蛋白加强了末端氧化酶细胞色素O的含量、比活性，细胞质膜的PH值差异，以及ATP转换的效率，使得细胞内部处于更高的氧合状态，改变碳代谢途径中碳的流向(Bailey J E 1995 Chem.Eng Sci，50：4091-4108；Patel S M，Stark B C，Hwang K W，Dikshit K L，Webster D A 2000 Biotechnology Progress，16(1)：26-30)。

Holmberg等(Holmberg N，lilius G，bailey J E et al 1997 Nature Biotechnology，15：244-247)最早将透明颤菌血红蛋白转入植物中表达，阐述了透明颤菌血红蛋白在促进植物生长和发育方面的潜力，但未对透明颤菌血红蛋白在植物中发挥作用的机理以及透明颤菌血红蛋白与植物抗逆性之间可能存在的某种关系作任何研究。其研究表明透明颤菌血红蛋白的表达促进烟草干物质的积累，叶绿素增加，种子萌发和开花提前，同时使自身代谢物尼古丁和假木贼碱含量提高。但是，Holmberg和人们万万没有想到透明颤菌血红蛋白基因在转化的植株中具有耐涝性的新用途，而且这种新用途正是这类植物不具备的，人们做梦都在寻找与抗涝性相关的基因，并以此设法改进，改良和提高作物的优良性状，但一直没有收获或效果不明显。

                          发明内容

本发明的目的在于提供一种透明颤菌血红蛋白基因在植物中的应用。

实际上，本发明涉及透明颤菌血红蛋白基因在烟草耐涝中的应用。

涉及透明颤菌血红蛋白基因在油菜耐涝中的应用。

还涉及透明颤菌血红蛋白基因在玉米耐涝中的应用。

通过研究发现，透明颤菌血红蛋白基因在转基因植物中表现具有明显的抗涝作用，而且这种新的用途是人们没有想到的，也正是人们苦苦寻求的基因。人们很早就发现透明颤菌血红蛋白基因并将其转导入烟草植株，通过基因的结构和在转基因植物中的性状表现，仅仅发现其在增加植物干物质重量，缩短生长周期，增加叶绿素，尼古丁和新烟碱含量的功能，而其表现的对水的耐涝性能是无法通过基因的结构和该基因在原生物中功能推导出。

按照本发明的第一个方面，提供了透明颤菌血红蛋白基因在转基因植物中表现耐涝性的用途。

在本发明中，透明颤菌血红蛋白基因来源于透明颤菌的可溶性血红蛋白基因。

本发明中所指的转化包括基因枪注射法，细菌转导法，更优选农杆菌导入法。具体的。在有利于表达载体导入的条件下，表达载体与植物细胞混合，将含有包括透明颤菌血红蛋白基因的表达载体导入植物细胞。

在本发明中通过选择性筛选出表达透明颤菌血红蛋白的转基因植物，并进一步筛选出对水有耐涝性的植物。在此基础上更进一步筛选出显现耐涝性植物的种子。

在本发明中，经编码透明颤菌血红蛋白基因表达载体转化的植物细胞再生的转基因植物，其中透明颤菌血红蛋白在由所述的转化植物细胞再生的转基因植物中产生对水的耐涝性。

本发明也包括从耐涝植物得到的种子。

众多文献报道已经分离了上面特别提到的透明颤菌血红蛋白基因，其核苷酸序列是已知的，在基因序列登记机构与Gene bank^TM已经登记了该核苷酸的序列，本领域的技术人员可以通过在基因序列中的数据库进行检索得到透明颤菌血红蛋白基因。

根据已知的核苷酸序列，利用本领域技术人员已知的方法，可以直接从各种细菌中分离用于本发明的透明颤菌血红蛋白基因。可选择地，可以利用已经分离和克隆到载体的透明颤菌血红蛋白基因。可选择地，可根据已知的核苷酸序列合成该基因。

通过从透明颤菌中分离的mRNA，并从中构建透明颤菌血红蛋白基因cDNA文库，杂交法筛选基因文库，可从中筛选并分离目的基因。对于杂交，可根据已知的核酸序列合成探针，或直接利用已知的全长或片段探针，也可利用已有的含有透明颤菌血红蛋白基因的质粒直接提取该目的基因，构建表达载体。

在本发明中的一个具体实施例中，直接从质粒RED2获得透明颤菌血红蛋白基因，用限制性内切酶HindIII酶切，得到2.2Kb和2.7Kb的两个片断。通过引物设计的方法在透明颤菌血红蛋白基因的5’和3’端分别接上BamHI和SacI酶切位点序列，用PCR方法进行透明颤菌血红蛋白基因的扩增，扩增产物回收后用BamHI/SacI双酶切，胶纯化，得到目的DNA片断。质粒pBI121也用BamHI/SacI双酶切，5’端去磷酸化后，将前面得到目的DNA片断与之连接，构建成表达载体pBI121/RED2。

本发明提供的启动子的种类不受限制，只要它能够在透明颤菌血红蛋白基因导入的植物细胞中能将该基因转录成mRNA，这样的启动子可以是非植物来源的启动子如椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)RNA等，或植物来源的启动子。通过选择合适的启动子，可以生产表现出高耐涝性的植物，优选的启动子是CaMV35S启动子和玉米泛素Ubiquitin启动子。

本发明的表达载体还包括导入的启动子，终止子，选择性标记等，而且这些都是在转基因植物中常用的。

在本发明中，用于透明颤菌血红蛋白基因的表达载体可以包括能够将含有可在植物中稳定表达的透明颤菌血红蛋白基因和选择性标记基因的区域或能掺入到植物细胞的染色体中的区域，如来自TI质粒的RB序列区域和LB序列区域，和在农杆菌内复制所需要的区域。

通过利用具有植物感染能力的土壤细菌如土壤农杆菌或利用基因枪注射法等可以完成在表达透明颤菌血红蛋白基因的载体中导入植物细胞。或通过钙处理导入，冰冻和融化方法，或电穿孔方法在农杆菌中导入构建的载体，并利用常规方法培养导入植物细胞。

通过植物细胞与含有表达透明颤菌血红蛋白基因表达载体的农杆菌的接触，在适当的条件下，可将目的基因导入植物细胞。这些方法是本领域的技术人员公知的技术。如利用叶片的叶盘法，具体的如用含有表达载体的土壤农杆菌菌株LBA4404感染易感染的双子叶植物，特别是烟草，就可获得所需要的转基因植物。为了保证农杆菌的感染，叶片在农杆菌中浸泡5-10小时，然后共培养2-3天，再在选择性培养基上培养，选择性培养基为含有Carb的MS培养基。叶盘转移至选择培养基上每隔10-15天继代1次，待再生芽长至1cm时切取小芽移至生根培养基上。苗生根后，移栽入蛭石。10天后移栽下土钵。从而获得植物和种子。

在本发明中，通过将栽有转基因植物T1代植株的盆钵整体移入大的不漏水盆钵中，灌水高度至土面上方3-4cm处，于室外培养，直到野生型植株萎蔫。对所有的转基因植株都进行筛选。

本发明具有如下优点：①指出了透明颤菌血红蛋白基因不曾发现和记载的新性能和用途，而且这种新的性能是旱生植物不具有，在洪涝灾害时严重威胁其正常其生长和繁殖。②生产含有包括透明颤菌血红蛋白基因并能表达该基因的植物，从而提供了一种表现耐涝性的转基因植物，③而且获得的这些性状能够在子代稳定遗传的植物和种子。

本文中所用的术语“耐涝性”，“对水的耐涝性”指植物的根部全部在水下3-4厘米处或在水下超过3-4厘米处，植物能够生长和繁殖。

本文中所用的术语“透明颤菌血红蛋白”是指一类从严格需O₂的革兰氏阴性菌(透明颤菌)中分离的血红蛋白，该蛋白质具有两个相同的亚基，分子量约为15.8Kda，该蛋白与O₂的结合速率较共生血红蛋白低，但较其它非共生血红蛋白高，而且与氧结合解离速率常数为最高的一类血红蛋白。

本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地或瞬时地表达所导入的基因并产生具有特定的生物学性状的植物。

本发明中的“植物细胞”是指植物的各种未成熟胚，或愈伤组织，或悬浮细胞，或原生质体。这些植物细胞在适当的条件下均能再生成植物。

本文中的“基因”是指将编码构成蛋白质或多肽的氨基酸的核苷酸序列，这些序列可以是DNA形式或者RNA形式，DNA形式包括cDNA，基因组DNA，或人工化学合成的DNA。DNA可以是单链的或者是双链的。

本发明中所用的术语“载体”是指将前面指出的基因转移到宿主细胞中的DNA。多种表达载体可以从商业途径获得，常用的载体包括但不限于质粒，噬菌体，病毒等，但最常见的首选质粒。

                          附图说明

图1：T₁代烟草的Kan抗性分离比

图2：pBI121/RED2质粒图谱

RB：左臂

NOS-Pro：NOS启动子

NPTII(Kan R)：Kan抗性基因

NOS-Ter：终止子

CaMV35S-Pro：35S启动子

VHB：透明颤菌血红蛋白基因

LB：右臂

图3：Vhb转基因植株的核酸分析

1.PCR鉴定：左起1-8为来自8个独立株系的强抗淹水植株，9为野生型植株

2.提取的RNA：左起2-7为来自6个独立株系的强抗淹水植株，1，8为野生型植株

3.2提取的RNA的Northern杂交分析

图4：淹水2天后的烟草植株表型  左：转基因植株  右：野生型植株

图5：淹水12天后的烟草植株表型  上：野生型植株  下：转基因植株

图6：烟草不同时期淹水SOD酶活性测定

图7：烟草不同时期淹水Pro含量测定

图8：野生型烟草水淹10天后上表皮气孔

图9：野生型烟草水淹10天后下表皮气孔

图10：vhb转基因烟草水淹10天后上表皮气孔

图11：vhb转基因烟草水淹10天后下表皮气孔

                           具体实施方式

实施例1(透明颤菌血红蛋白基因在烟草耐涝性方面的应用)

构建VHB表达载体及表达盒

1.载体的构建

质粒RED2中含有VHB基因，我们将质粒RED2提取和纯化后，用限制性内切酶HindIII酶切，得到两个片断(2.2Kb和2.7Kb)。由于已知的VHB序列两端没有有效的克隆用酶切位点，通过引物设计的方法在VHB的5’和3’端分别接上BamHI和SacI酶切位点序列，用PCR方法进行VHB基因的扩增，扩增产物回收后用BamH/SacI双酶切，胶纯化，得到目的DNA片断。质粒pBI121也用BamHI/SacI双酶切，5’端去磷酸化后，将前面得到目的DNA片断与之连接，构建成表达载体PBI121/RED2。在导入农杆菌LBA4404后，用于烟草的转化。

2.重组质粒的酶切鉴定，测序鉴定

1)PCR引物

P1(5’to 3’，29bp)for Vhb

CGG GAT CCA TAA TAA TGA ACT TAA GGA AG

P2(5’to 3’，30bp)for Vhb

GGA CGA GCT CAT TCA ACC GCT TGA GCC TAC

P3(5’to 3’，30bp)for CaMV35S promoter

CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG ATT GAT GTG

P4(5’to 3’，25bp)for NOS-terminator

TCG CCA GAC CGG CAA CAG GAT TCAA

P5(5’to 3’，23bp)for NPTII

CCG CTT GGG TGG AGA GGC TAT TC

2)菌落PCR

牙签碰取转化的划线少许，置于PCR反应管中替代模版DNA，进行PCR检测，PCR程序同前。

3)质粒DNA的提取

碱法提取质粒DNA(金冬雁等译，J.萨姆布鲁克等编，1996)。

4)酶切鉴定

限制性内切酶(BamHI，SacI，EcoRI，EcoRV，Xhol，HindIII)组合酶切质粒DNA鉴定每一步构建的质粒。

5)对表达构件pBI121/RED2、pCAMBIA1300/AHC15/RED2中的VHB进行测序分析，以证实构建过程中VHB中没有发生碱基变异。采用PE公司的ABI100测序仪进行分析。反应试剂盒：ABI PRISM BIGDYETM Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit with Ampli TaqrR DNA Polymerase FS Protocol(PEApplied Biosystems)

重组质粒的农杆菌LBA4404，EHA105转化(冻融法)

1.感受态农杆菌的制备

1)接种农杆菌LBA4404或EHA105于YM培养基中，28℃，200rpm振荡培养，至OD₆₀₀约0.9

2)4000g，4℃，离心10min

3)100mM NaCl(4℃)悬浮菌体

4)4000g，4℃，离心10min

5)20mM CaCl₂(4℃)重悬(加入的CaCl₂体积相当于离心前菌培养液的1/50)

6)分装每管100ul菌悬液，-80℃保存或立即使用

2.农杆菌的转化

1)每管感受态细菌中(100μl)加入1ul DNA(约1μg)

2)冰上放置30min

3)液氮冷冻1min

4)37℃水浴加热融化约5min

5)加入1ml YM液体培养基，28℃，200rpm振荡培养2-4hr

6)菌液均匀涂布于固体YM+Strep(25mg/L)平板，28℃培养约48hr

烟草的农杆菌转化

1.无菌苗的准备：种子经70％乙醇30sec，ddH₂O洗，5％NaClO浸泡30min，ddH₂O洗5次后，平铺于MS于培养基(PH5.8)中，琼脂浓度0.8％。烟草无菌苗备用。

2.烟草叶盘转化：接种LBA4404(含pBI121/RED2)于固体培养基YM上，两天后挑取单菌落于50mlYM液体培养基中培养。取无菌苗叶片，保留中脉，切成大小的叶盘，于菌液中浸泡10min。叶上表皮朝下，置于共培养基上，每皿6-7片，共培养2-3天。

3.共培养结束后，用液体MS培养基洗叶片两次，再用加Carb的液体MS培养基洗一次。叶盘转移至选择培养基上。每隔15天继代1次。

4.待再生芽长至1cm时切取小芽移至生根培养基上。

5.苗生根后，移栽入蛭石。10天后移栽下土钵。

转基因植物耐涝性筛选

将栽有转基因烟草T1代植株的盆钵整体移入大的不漏水盆钵中，灌水高度至土面上方3-4cm处，于室外培养，直到野生型植株萎蔫。对所有的转基因植株都进行筛选。并统计耐涝植株的比例和测定胁迫生理参数的测定。

转基因植株的核酸分析

1.PCR鉴定

1)用于PCR的转化植株总DNA的提取

A.70％乙醇擦洗叶片，称取大约100mg。

B.加入600ul抽提缓冲液(0.2M Tris-Cl，0.25 MNaCl，25mMEDTA，0.5％SDS，pH 7.5)，室温快速研磨。

C.5ml Ependorff管中涡旋混匀5～10s。

12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，上下颠倒混匀。-20℃，沉淀过夜。

D.2000rpm，15min，室温。去异丙醇，倒置于纸巾上。加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀。

E.2000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。

F.TE(pH 7.5)100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。

G.以总DNA为模板，进行PCR。

2)PCR程序

PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，反应的时间和温度作如下调整：

A.94摄氏度5min

B.94℃ 1min，65℃，50s，72℃，1min30s，30cycles

C.72℃10min

2.Northen杂交

1)RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)

A.液氮研磨100mg材料。

B.加1mlTRIZOL，室温放置5min。

C.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。

D.12000g，15min，4℃。取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀，室温放置15min。

E.12000g，15min，4℃。去上清，加入1ml70％乙醇。

F.7500g，7min，4℃。去上清，空气干燥。

G.DEPC-H₂O溶解，55摄氏度温浴10分钟。

2)RNA电泳

1.2％琼脂糖电泳

3)Northen杂交

A.DNA探针的³²P标记

a.于第一个1.5mlEP管中按下列顺序加样配制反应混合液：

10×PCR Reaction Buffer           2.0ul

MgCl₂(25mM)                       1.2ul

Primer 1(10uM)                    0.2ul

Primer 2(10uM)                    0.2ul

dNTP(dATP，dGTP，dTTP each 1.5mM) 2.0ul

32P-dCTP(60u Ci)                  6.0ul

65℃3min，置于室温。

b.于第二个管中加入DNA模板3.0ul(128ng)加入7.5ul，混匀，煮沸3min，置于冰上。

c.将2ul用冰预冷的稀释Taq DNA Polymerase(1U/ul)和dNTP及引物混合物迅速加入到变性的模板DNA中，总反应体积21ul。

d.混合物置42℃反应30min。

e.加入4ul 0.5MEDTA(pH 8.0)于探针反应混合液中终止反应。放射性标记的探针过Sephades R-25M柱中纯化。该柱子事先用STE溶液(980ul TE pH 7.5+20ul5.0M NaCl)平衡。分管收集用STE溶液洗脱的探针，合并2管放射性比活性最高的洗脱液作为杂交用探针。在加入杂交液之前煮沸10min，立即置于冰上。

B.预杂交

含有RNA的尼龙膜，先用3×SSC(10×SSC：1.5M NaCl和0.15M柠檬酸钠，pH 7.0)湿润，将膜正面朝上，置于杂交管中。鲑鱼精子DNA(ssDNA)100ul(10mg/ml)煮沸5min，置于冰上10min，加入到10ml预杂交液(同杂交液成分相同，为0.5M Na₂PO₄ pH 7.4，7％SDS)中，65℃预杂交2～3小时。

C.杂交

将探针加入新换的10ml杂交液中，65℃过夜。

D.洗膜

a.1×SSC，0.1％SDS，65℃，15～30min，2次。

b.0.1×SSC，0.1％SDS，65℃，15～30min，2次。

E.放射自显影

将膜用保险膜包裹，用盖革计数器检测膜上的放射性水平，置暗室中进行X光片的放射性自显影。

F.X光片的放射自显影。

转基因植株的淹水试验及耐涝性植株的获得

1.淹水试验

将栽有转基因烟草T1代植株的盆钵整体移入大的不漏水盆钵中，灌水高度至土面上方3-4cm处，于室外培养，直到野生型植株萎蔫。对所有的转基因植株都进行筛选。

2.统计耐涝植株的比例。

Vhb转基因植株耐涝的表现

1.胁迫生理参数SOD和PRO的测定

取不同淹水时期的植株叶片磨样提取SOD和PRO，进行淹水胁迫条件下的生理参数分析

1)SOD酶活性的测定

A酶液的制备

每克鲜重材料加5倍于样品量的0.05M PH7.8磷酸缓冲液(含0.1MEDTA，0.3％(w/v)TritionX-100，4％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)进行研磨，匀浆。13000rpm(10500g)，4℃，20min，上清液即为植物SOD粗提液。

B.酶活性测定

酶活性测定的方法进行，利用SOD抑制硝基氮蓝四唑(NBT)在荧光下的还原作用。在盛3ml反应混合液的试管中，加入适量的酶粗提液。3ml反应混合液中含：1.3uM核黄素；13mM甲硫氨酸；63uMNBT(即在54mi 14.5mMdl-Met中分别入均以50mMPH708磷酸缓冲液配制的3uMEDTA，2.45mMNBT和60uM核黄素各2ml，各溶液均在用前配制，避光保存)。反应总混合液在4000lux荧光下光照15min，并迅速在PERKIN-ELMER Bio20/1.0nmUV/VISSPECROMETER(1.20)的560NM下测定光密度，以不加酶液的反应管作空白对照。酶活性单位采用抑制NBT光化还原50％为一个酶活性单位表示。

2)游离脯氨酸含量的测定

A.游离脯氨酸的提取

称取新鲜叶片0.05-0.5g，剪碎后置试管中，加3％磺基水杨酸溶液研磨提取，磺基水杨酸溶液的终体积为5ml。匀浆液转入玻璃试管中，于沸水浴浸提10min，冷至室温。3000rpm，10min，吸上清2ml浴试管中，再加入2ml水，2ml冰乙酸和4ml2.5％酸性茚三酮溶液(以3∶2的冰乙酸和6M磷酸为溶剂进行配制)，置沸水中显色60min，冷却后加入4ml甲苯，振荡萃取红色物资。静止后吸取甲苯层浴分光光度计，PERKIN-ELMER Bio20/1.0nmUV/VIS SPECROMETER(1.20)的520nm处OD值。

B.标准曲线的绘制

配制浓度为1-10ug/ml10个系列的脯氨酸标准溶液。取标准溶液2ml(对照为2ml水)和2ml3％磺基水杨酸，按上述程序进行显色、萃取、比色，绘制标准曲线。

2.气孔开度分析

在植株的上表皮和下表皮均匀涂布无色透明指甲油，溶剂挥发后，撕取指甲油薄膜层，于显微镜下观察上、下表皮的气孔开度。

3.根系活力观察

小心洗取淹水的野生型和转基因型植株和作为对照的非淹水型植株的完整根系，观察根系的色泽及根的皮层增生状况。

结果与分析

1.表达构件的质粒pBI21/RED2图谱(图2)

2.表达构件的酶切、PCR鉴定和Vhb的测序鉴定

表达载体pBT121/RED2经PCR和限制性内切酶BamHI/SacI、SacI/EcoRI、HindIII、BamHI、HindIII/PstI组合酶切证实后，进行测序。结果证明vhb在构建过程中没有产生任何碱基的变异。vhb的DNA序列如前所示。

3.To代vhb转化植株的获得

烟草的T1代vhb转化植株外形与野生型的对照无显著差异，并且能完全正常地进行开花和结籽。共获得来自于80个独立株系的109个vhb转化植株。

提取它们的叶片DNA进行PCR鉴定，结果所鉴定的96株全部为PCR阳性，野生型对照为阴性，所以这些转基因植株中都有vhb基因的DNA。

4.转基因植株T1代的分离比

T1代烟草的Kan抗性分离比(图1)：由图中数据可以看出烟草中vhb的插入为1-3个拷贝，大部分为单拷贝插入，也有2～3个拷贝的，平均拷贝数为1.5个。

5.转基因耐涝植株的获得及核酸分析

由于转入的vhb基因是编码细菌性血红蛋白的，而该蛋白能够高效地结合低浓度O₂，而又能快速地释放O₂。植物在滞水或淹水状态下，根部生活于缺O₂的环境中，如果能改善根部的供氧条件则将增强植物对于淹水的抗性。为此，设计了植物的淹水试验，以探索vhb与植物的抗涝性的关系。结果发现：气温25℃～35℃时，14叶期的烟草，淹水2天后，野生型的植株叶片已经完全萎蔫，除两片新叶依然挺立外，老叶已完全萎蔫下垂(设定为不耐涝)，而一部分转基因植株叶片依然与正常生长状态没有区别(设定为耐涝)，另一部分的转基因植株叶片状态介于两者之间，只是2-3片老叶的叶缘下垂(设定为中等耐涝)。在T1代种植的17个株系中，有9个株系可以筛选到耐涝植株。这些株系是：预期单拷贝插入的Tr12、Tr13、Tr19、Tr27、Tr46、Tr49和Tr77，预期3拷贝插入的Tr15和Tr45。在单拷贝插入的株系中耐涝与中等耐涝的比例接近于1∶2，在多拷贝插入的株系中则这个比值较低，约为1∶4。同时观察了不同生长期(6叶期、12叶期、开花期)的烟草，耐涝情况趋势相同。所以推测这种耐涝性可能与vhb的表达相关。随机选取8个独立株系的耐涝淹水植株叶片DNA进行PCR鉴定，结果全部为阳性，野生型为阴性。提取的来自6个独立株系的植株的叶片RNA及其vhbNorthern杂交结果亦证明这些耐涝植株都为vhb表达的植株(图3)。

6.vhb转基因植株的核酸分析

1)PCR鉴定：左起1～8为来自8个独立株系的的强抗淹水植株，9为野生型植株

2)提取的RNA：左起2～7为来自6个独立株系的强抗植株，1，8为野生型植株

3)2)提取的RNA的Northern杂交分析

7.耐涝植株的抗性表现

转基因耐涝植株在水淹2天和12天后的植株表型如图4和图5。烟草为抗干旱植物，不耐涝。可以看出vhb的表达使得转基因植株的耐涝性显著增强，即使在淹水12天后叶片仍维持绿色，而且形态上与正常无异，此时野生型植株叶片的老叶已经枯黄脱落，顶部叶片发黄，茎部也已经开始收缩。在自然界的洪涝灾害时，一般在持续10天左右也就能得到排水，所以模拟洪涝滞水的实验大多为10天左右。这就是说转入vhb基因的烟草在洪涝灾害发生时，可能会受损较小。

1)胁迫生理参数SOD活性和Pro含量的测定  vhb基因之所以能增强植物的耐涝性，必定存在着生理基础。为此，作了一些生理参数的测定，以分析vhb基因是否与植物的胁迫保护系统(例如，SOD酶，脯氨酸等)有关。从图6可以看出，无论是野生型(CK)，还是耐涝的Tr12和Tr13，都随着淹水时间的延伸，SOD活性升高，但耐涝植株增加量高于CK。有趣的是，在水淹12天后，转基因植株的SOD)活性开始下降，有逐渐恢复至正常生长条件下SOD活性状况的趋势。这说明，植物可能已经产生淹水适应性，自身的活性氧自由基已经减少，不再需要SOD酶的活性升高了。从图7的Pro含量与淹水时间的关系更可以看出，尽管在水淹初期，植物通过脯氨酸含量的升高调节细胞的渗透压等，以维持自身的生存。但随着时间的推移，至淹水12天时，转基因植物的脯氨酸含量已完全下降回复至正常生长水平，推测植物由于自身已经产生淹水适应性而不再需要过多的脯氨酸了。

所以，从SOD酶活性和脯氨酸含量的变化进程可以看出，随着淹水时间的延伸，野生型植株受到了不可逆转的伤害；而转基因植株可能由于自身发达的O₂运输系统在根部低氧压条件下发挥了作用，使得转基因植株在持续淹水12天以后仍能继续生存。

2)气孔开度观察及韧皮部的环切试验

转基因植物在淹水过程中除了勉力生存外，是否还能执行一些正常生长所需要的功能，例如光合作用。而气孔的开度从一定程度上能反映植物对CO₂、O₂和H₂O的利用能力。为此，在水淹10天以后观察野生型和转基因植株的气孔开度。图8、9分别为野生型烟草上、下表皮的气孔，图10、11分别为vhb转基因型烟草的上、下表皮气孔。从图中可以看出在淹水10天后野生型的烟草上表皮的气孔已经关闭，下表皮部分气孔关闭、部分气孔仍维持一定的开度；图9、10显示转基因植株上表皮气孔开度较大，下表皮气孔开度比野生型的稍大。气孔的的关闭是植物为了减少蒸腾防止植物脱水的一种形态适应。然而气孔的关闭同时妨碍了CO₂，通过气孔进入叶肉细胞，光合作用被中断。相反转基因植株中可能没有遭遇失水的危险，因而气孔仍能维持一个较大的开度，成为光合作用能够正常进行的必要条件。转基因植株光合功能的维持亦可以从茎韧皮部的环切实验得以证实。环切的植株在淹水12天以后，转基因植物中环切以上、以下部位的叶片均能保持正常的生长状态，这说明即使韧皮部的有机物运输被中断，转基因植物中，根系吸收的营养和水分仍能够通过木质部的运输到达环切部位以上的叶片，为叶片提供光合作用所需的原料，叶片继续进行光合作用，从而维持了叶片的正常状态。相应地，环切部位以下的叶片，尽管与植株上部功能叶的能量和信号交换被阻碍，它们仍能依靠自身的光合作用而维持正常的形态。另一方面也说明vhb基因是植株各部位整体表达，构成了极发达的氧运输系统，使得植株每个部位均能得到相对充足的氧气。

3)根系活力观察

根系是淹水受害最直接也最严重的部位，所以转基因植物之所以能耐涝，根系应该发挥极大的作用。取根后发现：在野生型和转基因植株之间根系状况大不相同，以不淹水的野生型植株根系作对照(根系比较发达，淡黄色)；淹水12天的野生型根系已经褐化，开始腐烂、降解；而转基因植株的根系色泽浅黄，从根系的色泽和长度可以判定为一套新生根系。而且无论是野生型还是转基因型，根系均出现皮层增生现象，不淹水的对照中无这种现象发生。皮层增生是一种淹水适应性，可以加强氧在根部的运输，使更多的O₂能进入根际，氧化在根际积累的有毒的还原性物质，保护根系本身免受毒害。值得注意的是，在转基因植物的根系，产生的皮层增生部位更多。这说明在水淹的早期，无论是野生型还是转基因型，根系都力图通过产生相应的适应性(例如，皮层增生)保护根系免受窒息，免受毒害，只是野生型根系可能后援不足，根系本身的代谢受阻，最终无法摆脱遭降解的命运；而转基因植株可能由于根系能得到较正常的O₂供应，而渐渐适应了淹水缺氧的状况。根系的不同形态从根本上解释了野生型和转基因型植株的耐涝程度的显著差异。

4)茎横切面观察

正因为根系形态和功能在野生型和转基因型植株之间产生了根本性的差异，所以植株地上部的营养和水分供应可能也存在着天壤之别。为此，观察了茎横切面的细胞失水状态。以不水淹的野生型植株作对照，可以看出在淹水12天以后，转基因的植株茎横切面与不淹水的对照无显著区别，茎韧皮部绿色，各部位含水丰富，淹水的野生型茎横切面失水状况严重，韧皮部失绿，木质部发白，而茎髓细胞已经失水收缩，产生海绵状空洞结构。这从另一个侧面说明了在转基因植株中，地上部水分营养供应基本正常，不因淹水而受害。综合转基因植株的核酸分析、淹水状态下vhb转基因植株的SOD活性、Pro含量变化趋势、气孔开度分析、韧皮部坏切试验、根系活力观察及茎横切面的观察结果，证明vhb的导入和表达有利于淹水时根系氧气的供应，最终使烟草由不耐涝的植物转变成耐涝型转基因植物。

实施例2(透明颤菌血红蛋白基因在油菜耐涝性方面的应用)

(一)油菜表达载体pBI121/RED2构建，重组质粒的酶切鉴定、测序鉴定以及农杆菌LBA4404的转化过程同上。

(二)油菜的农杆菌转化(程振东等，1994；郭学兰等，1999)

(1)种子表面消毒：油菜“中油821”种子用70％乙醇消毒1min，无菌水洗，0.1％HgCl₂。浸泡10min，无菌水洗5遍，种子平铺于MS固体培养基上。光照培养箱中培养(12hr光/12hr暗)。

2)萌发4-5天后从实生苗切取子叶柄(长度1-2mm)的完整子叶(严格去除腋芽)，作以下

A.对照1：直接将子叶柄插入诱导分化苗的分化培养基中约2mm深(分化培养基为MS+4.5mg/L6-BAP+20uMAgNO₃)。子叶柄插入培养基内，子叶留在培养基外。4周后统计苗再生频率。

B.对照2：把带有1-2mm子叶柄的子叶浸入到处于对数生长期的根癌农杆菌LBA4404的菌悬液(经12-24小时培养的根癌农杆菌，用MS液体培养基稀释10倍，置培养皿中薄薄一层)中5秒后，随后转入无菌滤纸上吸掉多余的菌液。在分化培养基上共培养72小时后，转到附加500mg/L羧苄青霉素(Carb)和25mg/L Kan的相同培养基上。

C.处理：将子叶柄插入含重组质粒pBI121/RED2的LBA4404菌悬液中，其他同对照2。

3)2周后把分化的再生苗切下，插入生根培养基中(MS+2mg/L IAA或0.2mg/LIBA+3mg/L PP₃₃₃+25mg/L Kan+200mg/L噻口亏头孢霉素(Cx)+0.7％琼脂)。

4)待根系发达后，练苗3天，移栽到花盆中，置于25℃，12小时光照/天的人工气候室中培养。植株进入正常营养生长后在转到室外自然条件下生长。

结果与分析

和转基因烟草一样，转入了vhb基因的油菜也表现了良好的耐涝性。

实施例3(透明颤菌血红蛋白基因在玉米耐涝性方面的应用)

(一)玉米和小麦表达载体pCAMBIA1300/AHC15/RED2构建

将来自于pBI121/RED2构件的vhb基因酶切回收，连接，置于pAHC15的玉米泛素Ubiquitin启动子的调控之下，以含有潮霉素(hyg)和卡那霉素(kan)筛选基因的质粒pCAMBIA1300作载体，构建成表达载体pCAMBIA1300/AHC15/RED2，以pCAMBIA1301作转化对照，用于玉米和小麦的转化。

(二)玉米的基因枪转化.

取玉米骨干自交系齐319和N10-6的幼胚为外植体，在加有2mg/L 2，4-D的MS培养基上诱导胚性愈伤组织的产生。取不同生长时期的胚性愈伤组织进行转化。基因枪型号为Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System(Bio-Rad)。轰击参数为可裂圆片与载体的距离2.5cm，载体与阻挡网的距离0.8cm，阻挡网与靶细胞的距离6cm，氦气压力7.58×103kPa，真空度1137.8kPa，金粉直径1mm，金粉剂量分别为100mg金粉(167ng DNA)/枪和370mg金粉(625ng DNA)/枪，每皿120块左右愈伤组织。轰击后的愈伤组织继代培养1次，再转入含潮霉素(hyg)和卡那霉素(kan)的培养基上进行筛选，3周后，选择生长正常的愈伤组织继续筛选，连续筛选3代。抗性愈伤组织在分化培养基上再生植株。小苗在生根培养基上根系变发达，3-4叶期移栽入盆钵中。

结果与分析

和转基因烟草一样，转入了vhb基因的玉米也表现了良好的耐涝性。

Claims (4)

1.透明颤菌血红蛋白基因在植物耐涝中的应用。

2.透明颤菌血红蛋白基因在烟草耐涝中的应用。

3.透明颤菌血红蛋白基因在油菜耐涝中的应用。

4.透明颤菌血红蛋白基因在玉米耐涝中的应用。

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