CN101041821A - 甘蓝型油菜木质素单体合成基因f5h及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H及应用。该基因合成首先是在NcBI数据库中检索与F5H同源的核苷酸序列，对检索到的序列设计正向和反向引物；其次以cDNA为模板进行扩增，得到了基因序列SEQ ID NO：1，该甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H在油菜抗菌核病和抗倒伏中的应用，转基因植物表现为木质素含量增加，抗菌核病和抗倒伏能力提高10－30％。

Description

甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H及应用

                        技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H序列，同时本发明还涉及这种甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H在油菜中的用途。

                        技术背景

木质素是由多种苯基类丙烷醇缩合而成的多聚物，是植物维管组织次生细胞壁的主要组分，决定细胞壁的强度和刚性，其代谢途径与植物其它次生物质代谢途径相互交叉，故其代谢与植物的抗病、抗倒等抗逆生理都有一定的相关性，在与病原菌相互作用中，寄主细胞壁木质化是抗病反应的特征之一，木质素作为植物体内一种重要的物理抗菌物质，能够沉积于细胞壁中富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGP)上，作为结构屏障，加固细胞壁，保护细胞免受病原菌的侵染。被子植物中，木质素主要为G-木质素(愈创木基木质素)和S-木质素(紫丁香基木质素)的混合体。G-木质素相比S-木质素，结构单元间含更大比例不易断裂的C-C连接，从而使木质结构更加致密。被子植物具不同S/G比值，可通过转基因的方法改变S/G比值。

近年来，突变体及通过转基因植物对木质素生物合成调控的研究主要表现在3个方面：一是苯丙酸途径上的调控，涉及3种酶：PAL(phenylalanineammonia-lyase)、C4H(cinnamate 4-hydroxylase)和4CL(4-coumarate：CoA ligase)，它们的表达决定木质素总量；二是木质素特异合成途径上的调控，主要集中于3种酶，即COMT(caffeic acid O-methyltransferase)、CCoAOMT(caffeoyl-CoAO-methyltransferase)和F5H(ferulate 5-hydroxylase)，这些酶类的表达对木质素含量尤其木质素单体的特异合成影响较大，决定了各种单体在木质素总量中的比例；三是对木质素特异合成途径下游酶类的调控，包括两种还原酶：CAD(cinnamylalcohol dehydrogenase)和CCR(cinnamoyl-CoA reductase)，它们负责将各种羟基肉桂酰-辅酶A(CoA)酯最终还原成各种木质素单体。在小麦中克隆的COMT基因在根、茎、叶中均有表达，茎秆中COMT基因的表达水平与小麦的抗倒性相关，COMT基因的表达可能增强了茎秆的硬度和抗倒伏的能力。对玉米抗倒伏性进行QTL定位研究中，在与茎杆强度QTL置信区间相互重叠的基因中，发现有参与木质素合成的基因。

F5H是G结构单元向S结构单元转化反应的关键酶，对木质素单体的特异合成起决定性作用。在缺乏F5H活性的拟南芥突变体中，仅含有微量的S-木质素，并且由于不能合成主要在叶表皮近轴积累的荧光次生代谢物芥子苹果酸酯(sinapoyl malate)，仅表现叶腋叶肉内叶绿素的暗红荧光，野生型则为浅蓝荧光；将F5H应用拟南芥C4H启动子在该突变体中过量表达时，转基因植物中的木质素基本上都是由S木质素组成的；将该基因应用拟南芥C4H启动子在正常植株过量表达，也会使S木质素含量增多，且使其在植物中的组织分布特异性消失。调控F5H的转基因研究均为过量表达以提高S/G比值，即会提高S木质素在木质素总量中的比例，以提高制浆效率为目标，对纸浆生产极为有利。

RNA干涉(RNAi)是由双链RNA分子介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。RNAi技术简单易行，抑制基因表达效率高，已被广泛应用于真核生物基因功能的研究。理论上，几乎所有生物中的基因表达都可能被RNAi阻断，同样RNA沉默也可能使基因表达的抑制子失活，从而使某些基因顺利表达，这为RNAi技术提供了广阔的应用前景。目前将此技术应用于植物木质素合成调控的研究还未见报导。

总之，在本发明申请之前，国内没有人公开或发表过甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H基因序列及其在植物中的用途。

                        发明内容

本发明的目的是在于提供了一种甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H。该基因是调控S木质素合成的关键基因，该基因在油菜中抗菌核病和抗倒伏的能力强，对于植物木质素的组分改造很有意义。

本发明的另一个目的在于提供了一种甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H在油菜抗菌核病中的应用。

本发明的再一个目的在于提供了一种甘蓝油菜木质素单体合成基因F5H在油菜抗倒伏中的应用。

为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施：一种甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H，它包括下列步骤：

1)在NCBI数据库中检索与F5H(Ferulate 5-hydroxylase)同源的核苷酸序列并下载其mRNA序列及CDs(coding domain)。用DNAMAN及DNAStar软件(通过商业途径市场购买获得，下同)对检索到的完整mRNA序列进行比对分析，在基因编码序列的两侧及保守区段设计(引物正向引物：[5’-ATGGAGTCTTCTATATCACAAACACTAAG-3’]；表反向引物：[5’-TTA(a，g)A(c，g)AG(a，c)ACA(a，g)AT(a，c)AGGCG(t，c)GTG-3’]，下同)。

2)以cDNA为模板进行RT-PCR扩增，扩增得到的片段进行测序，得到了F5H基因序列(SEQ ID NO：1)。

通过上述方法获得了甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H，该基因在油菜抗菌核病和抗倒伏中有广泛的应用，采用一种反义RNA技术抑制F5H基因表达活性的转基因油菜，其特征在于转基因植物表现为木质素含量增加，比受体对照(非转基因植株)木质素含量增加5％以上，抗菌核病和抗倒伏能力提高，转基因植株比受体对照(非转基因植株)病斑扩展面积变小30％以上，茎杆强度则比对照(非转基因植株)增强在10％以上。

在本发明中为了达到上述目的采用以下技术方法，提供了一种质粒表达载体pBI121(从商业途径获得，中国科学院遗传与发育研究所购置，下同)，它含有特异表达启动子(木质部特异表达的C4H启动子)和翻译控制件。

在本发明的另一个方面，提供了一种可在植物中表达的宿主菌，本发明优先的是农杆菌，更优选的是根癌农杆菌LBA4404(从商业途径获得，中国科学院遗传与发育研究所购置，下同)。本发明也提供了一种将所述载体导入植物细胞的方法，如基因枪注射法，细菌导入法。本发明优选农杆菌导入法，如农杆菌LBA4404油菜子叶柄导入法。

本发明提供了一种反义RNA技术抑制F5H基因表达活性的转基因油菜的方法，其特征在于油菜木质素含量增加，抗菌核病和抗倒伏能力增强。该方法包括下列步骤

1)克隆的油菜木质素单体合成基因F5H连接到质粒pBI121上，形成可转化或表达的载体；

2)将步骤1)中制备的载体转入根癌农杆菌LBA4404，再导入甘蓝型油菜植株中；

3)筛选阳性植株。

在本发明中，①取油菜mRNA，用DNAMAN及DNAStar软件对检索到的完整mRNA序列进行比对分析，在基因编码序列的两侧及保守区段设计特异引物进行RT-PCR扩增，得到了基因序列(SEQ ID NO：1)。用HindIII/BamHI分别双酶切C4H启动子PCR产物和PBI121质粒，将PCR酶切片段和PBI121质粒酶切大片段连接后，转化到感受态细胞DH5α(从商业途径获得，如从由中国农业科学院油料作物研究所购置)中扩增，然后再将F5H基因引入到该载体(PBI121)中，并取代载体中原有的GUS序列，而载体中的35S启动子序列则被C4H启动子序列所取代，构建植物反义表达载体重新命名为pC4HBnF5。②将含有F5H基因的载体转染根癌农杆菌LBA4404，培养农杆菌于YEP液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，NaCl5g)，并将无菌苗在农杆菌菌液中浸泡。③在加Kan的选择培养基筛选阳性克隆。

在本发明的一个具体实施例中，植株无菌苗选自油菜，通过选择培养基最后筛选到油菜木质素单体合成基因F5H反义表达的植株，植株表现出木质素含量增加，抗菌核病和抗倒伏能力提高10-30％。

本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地增强或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。

本发明中的“植物细胞”是指植物的各种末成熟胚，或愈伤组织，或悬浮细胞，或原生质体。这些植物细胞在适当的条件下均能再生成植物。

克隆本发明中所述的油菜木质素单体合成基因F5H的方法是本领域中所常采用的方法。提取mRNA的方法也有多种成熟的技术(如采用TRIzol Reagent，Invetrogen)，提取mRNA试剂盒如可从商业途径获得，而构建cDNA文库也是常用的分子生物学技术。构建本发明中所述的载体和将载体转染入植株也是本领域中所常采用的方法。其中所涉及的质粒(如质粒表达载体pBI121)，转染用媒体(如根癌农杆菌LBA44040和所用试剂可从商业途径获得)。

本发明是国内首次公开甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H序列及其在油菜中的应用，并首次利用RNAi技术调控植物木质素的合成，增加提高G/S比值，即提高了G木质素在木质素总量中的比例，转基因植物木质素含量比受体对照(非转基因植株)木质素含量增加5％以上，转基因植株比受体对照(非转基因植株)病斑扩展面积变小30％以上，茎杆强度比对照(非转基因植株)增强在10％以上，大大地提高了油菜的抗菌核病和抗倒伏的能力。此方法也为作物抗病、抗倒伏研究及育种开辟了一条新的思路。

                        附图说明

图1RT-PCR扩增的F5H cDNA目标片段示意图

图2植物表达载体示意图

Kan为卡那抗性，C4H为启动子，反义的F5H基因为克隆基因插在C4H启动子之后。

图3C4H启动子的转反义F5H基因油菜的PCR结果

1-11样为转基因植株，12为对照野生植株，14为阳性对照。结果显示转基因植株2，3，4，7，98成功导入了反义基因。

                      具体实施方式

通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J等人(Blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1(基因的克隆及测序)

利用NCBI数据库，用DNAMAN及DNAStar软件对检索到的序列进行比对分析，在基因编码序列的两侧及保守区段设计引物(正向引物：[5’-ATGGAGTCTTCTATATCACAAACACTAAG-3’]；反向引物：[5’-TTA(a，g)A(c，g)AG(a，c)ACA(a，g)AT(a，c)AGGCG(t，c)GTG-3’])，用来从油菜中扩增F5H的对应序列。

1、提取油菜mRNA。

RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)

液氮研磨100mg材料。

A.加1mlTRIZOL，室温(20-25℃，下同)放置5min。

B.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。

C.12000g，15min，4摄氏度。取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀后室温放置15min。

D.12000g，15min，4摄氏度。去上清，加入1ml70％乙醇。

E.7500g，7min，4摄氏度。去上清，空气干燥。

F.DEPC-H₂O溶解。

2、cDNA第一链的反转录采用RevertAid H Minus First Strand cDNASynthesis Kit(Fermentas)，操作参照所用试剂盒说明进行。

3、在NCBI数据库中检索，用DNAMAN及DNAStar软件对检索到的序列进行比对分析，在基因编码序列的两侧及保守区段设计引物，用来从油菜中扩增F5H的对应序列。

4、以cDNA为模板进行RT-PCR扩增，得到了基因序列(SEQ ID NO：1)。实施例2(载体构建)

利用PCR反应在C4H启动子5’端和3’端分别引入HindIII和BamHI酶切位点序列，然后用HindIII/BamHI分别双酶切C4H启动子PCR产物和PBI121质粒，将PCR酶切片段和质粒酶切大片段连接后，转化到感受态细胞DH5α请写明DH5α耒源，中扩增，然后再将反义的F5H片段引入到该载体(PBI121)中并取代载体(PBI121)中原有的GUS序列，而载体中的35S启动子序列则被C4H启动子序列所取代(如图2示)，其插入片段经DNA测序鉴定。

实施例3(植株的转化与筛选)

油菜的农杆菌LBA4404转化

A.无菌苗的准备：种子经70％7醇1min，HgCl₂浸泡13-15min，ddH₂O洗5次后，平铺于MS于培养基(PH 5.8)中，琼脂浓度0.8％。油菜无菌苗备用。

B.油菜子叶柄转化：接种根癌农杆菌LBA4404(含F5H基因)于固体培养基LB上，两天后挑取单菌落于50ml YEP液体培养基中培养。取4-5天无菌苗子叶柄，于菌液中浸泡5-8min，其间轻摇，而后倒去菌液，以无菌滤纸吸去外植体上残留菌液。置于共培养基耒源上培养2-3天。

C.将共培养后的外植体转入只含Car不含Kan的分化培养基中，黑暗条件的温室中进行脱菌与分化培养5-7d。再继代在添加Kan筛选压的选择培养基(MS+3mg/L 6BA+0.1mg/L NAA+5mg/L AgNO₃+400mg/L Car+10～15mg/L Kan；pH5.8)中，进行筛选，待分化出再生绿芽。

D.待再生芽长至1cm时切取小芽移至生根培养基(MS+0.2mg/L NAA+10mg/L Kan+400mg/L Car；pH5.8)上，用加Car与Kan的固体MS培养基筛选。

E.苗生根后，移栽入蛭石。10天后移栽下土钵。

实施例4(转化植株的核酸分析-PCR鉴定)

(1)用于PCR的转化植株总DNA的提取

A.70％乙醇擦洗叶片，称取大约100mg

B.加入600ul抽提缓冲液(0.2M Tris-Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH 7.5)，室温快速研磨。

C.1.5ml Ependorff管中涡旋混匀5~10s

D.12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，-20摄氏度沉淀过夜。

E.12000rpm，15min，室温。加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀。

F.12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。

G.加无菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。

H.以总DNA为模板，进行PCR。

(2)PCR程序

PCR反应混合液的配比同质粒(含F5H基因)PCR鉴定，反向引物[5’-GATTGCTTTGATATTGTCACGGGT-3’]和对应于NOS终止子的正向引物[5’-AAGACCGGCAACAGGATTCAAT-3’]，反应的时间和温度作如下：

94摄氏度3min

94℃30s，55℃1min，72℃1.5min，30cycles

72摄氏度5min    结果如图3示

实施例5(转基因油菜木质素含量及抗菌核病和茎杆强度的测定)

(1)木质素含量的测定

将切取的茎段部分在烘箱中烘干至恒重，用粉碎机充分粉碎后，称取0.3g样品，加入7.5ml 72％的硫酸，30℃消化1h，然后用蒸馏水将消化液稀释至硫酸浓度为4％，121℃下处理1h，冷却至室温后，单层滤纸过滤，最后将残渣烘干后称重，计算木质素的含量(％)。

(2)菌核病抗性鉴定

A)油菜苗期采用离体叶接种菌核鉴定。在油菜抽苔前，从同一部位剪取叶片，将叶片放入白磁盘，每盘两组，每组8片叶，叶柄用湿纱布保湿。菌丝片倒置于叶片的主脉上部叶肉。接种后用透明塑料薄膜覆盖保湿100％，23℃温育2d后，调查病斑直径(cm)。三次重复，每次重复5-7片叶，计算其平均病斑面积(cm²)。

B)油菜终花期采用牙签法进行田间鉴定。牙签在沸水中煮沸15min，捡出放入到PDA液体培养中，高压灭菌，然后成放射状排列于含PDA培养基的培养皿中，中心放上直径为8mm菌丝块。23℃培养3～5d，待牙签上长满菌丝，然后将牙签接种在距地面30cm的油菜茎杆上，一周后测量病斑长度(cm)。每个小区测定15株，计算平均值。

(3)茎杆强度测定

在油菜成熟期间，用倒伏试验器DIK-7401(购置日本)对油菜的茎秆强度进行测定。选取生长正常的油菜，每个小区测定15株，于茎杆中部处截去上层冠层部分，用秆强仪将植株弯成一定的角度(45°)，测定茎杆强度(N/茎)，计算其平均值。

                        SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H及应用

<130>甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H及应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1560

<212>DNA

<213>油菜

<400>1

atggagtctt ctatatcaca aacactaagt caattattag atcccacaac ggctattctc     60

atcatcgtct cacttttcat attcatcggc ctcatcacac gacggcgaag gtcttaccca     120

cccggtccac gtggttggcc catcataggc aatatgttaa tgatggacca actcacccac     180

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ctaaaacggg tccaacaaga actcgctgga gttgtcggac ttgaccgacg tgtggaagaa    1080

tcagacatcg agaagttgac ttttctgaaa tgcacactca aagaaaccct aaggttacac    1140

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tggcctgacg ccgaaacgtt tagaccgtcg aggtttttag aaccgggagt agcggatttc    1320

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caactcgggt tatacgcgct tgagttagcc gttgctcata tattacattg cttcacatgg    1440

aaattacctg atgggatgaa agcgagcgag cttgacatga acgacgtgtt tggtctcacg    1500

gctcctaaag ccactcgtct tttcgccgtg cctagcacac gccttatctg ttctgtctaa    1560

Claims (3)

1、一种分离的基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2、一种甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H在油菜抗菌核病中的应用。

3、一种甘蓝型油菜木质素单体合成基因F5H在油菜抗倒伏中的应用。

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