CN110699368A - 小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因及其扩增引物和应用 - Google Patents

小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因及其扩增引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及小麦肉桂酸‑4‑羟基化酶基因及其扩增引物和应用。本发明所提供的的小麦肉桂酸‑4‑羟基化酶基因具有如SEQ ID NO：1‑3所示的核苷酸序列，扩增所述基因的引物具有如SEQ ID NO：4‑9核苷酸序列，应用所述引物可以检测、扩增小麦肉桂酸‑4‑羟基化酶基因，为小麦分子辅助育种提供重要的研究价值。

Description

小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因及其扩增引物和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因及其扩增引物和应用。
背景技术
小麦是世界上最主要的粮食作物之一，在人们的日常生活中占据了很高的地位。在陆生植物体内，木质素存在于次生细胞壁内，为植物提供结构支持，增加细胞壁的强度和茎秆的抗弯折力。同时木质素还具有保护植物免受生物和非生物侵害的能力，通过将大豆GmC4H基因转基因到烟草中发现，转基因阳性植株提高了对病原菌的侵害，并通过对正常大豆植株敲除GmC4H基因，正常大豆植株的表型明显比GmC4H基因沉默植株好；甘薯C4H基因转基因到烟草中发现，在抵抗干旱胁迫时表现较好的抗性。
黄酮类化合物是植物重要的次生代谢产物，广泛存在于植物的根、茎、叶、花和果实中，在植物生长过程中占有重要地位，对植物抵御病虫害的能力也起着举足轻重的作用，另外，黄酮类化合物还具有抗氧化、抗癌、降血脂血压、提高免疫力等诸多保健功效，进食富含黄酮的食品可提高机体免疫力，对人体健康有诸多益处。
肉桂酸-4-羟基化酶(Cinnamate 4-hydroxylase，C4H)是木质素合成过程中的关键酶之一，属于p450家族位于上游苯丙氨酸代谢途径的第二部反应，催化反式肉桂酸形成p-香豆酸，继而在不同酶的催化作用下，最终生成黄酮类化合物和木质素单体。
综上所述，小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因与小麦黄酮类物质的含量相关，筛选和鉴定小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因对于富含黄酮类物质的小麦品种的改良尤为重要。在现有文献中没有克隆小麦肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)基因的报道，限制了利用该基因改良小麦黄酮类物质含量的研究进程。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因，所述基因位于小麦A基因组第三染色体，命名为C4H-3A，基因序列如SEQ ID NO：1所示；或者位于小麦B基因组第三染色体，命名为C4H-3B，基因序列如SEQ ID NO：2所示；或者位于小麦D基因组第三染色体，命名为C4H-3D，基因序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明的第二个目的是提供用于扩增小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因的引物，引物序列如下：
C4H-3A基因的引物：
C4H-3A-F：5’-CACAACAACCCAACCGCAAC-3’；
C4H-3A-R：5’-CGTACGTCCGGTACGGGACT-3’；
C4H-3B基因的引物：
C4H-3B-F：5’-ACACAACAGAGCGGTAACAGTTT-3’；
C4H-3B-R：5’-CAATCGTGAAAGTACAACACC-3’；
C4H-3D基因的引物：
C4H-3D-F：5’-AAACAGAACAACCAACCCCAC-3’；
C4H-3D-R：5’-TATCGCAGCATCAGGTTTGG-3’。
本发明的第三个目的是提供利用上述引物检测小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因中的应用。
进一步的，上述应用包括如下步骤：
S1.提取待测小麦的基因组DNA；
S2.以待测小麦的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物进行PCR扩增反应；
S3.检测PCR扩增产物。
进一步的，PCR扩增体系为：共25μl，其中5×TransStart FastPfu Buffer 5μl，dNTPs 2.5μl，上下游引物各0.5μl，TransStart FastPfu DNA Polynerase0.5μl，模板DNA2μl，ddH2O 14μl。
进一步的，PCR程序为：第一步：95℃5min；第二步：95℃45s，Tm 45s，72℃2min30s，35个循环；第三步：72℃10min。
本发明还提供了上述扩增小麦肉桂酸-4-羟基化酶cDNA中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因是首次从小麦中克隆的，小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因与小麦黄酮类物质的含量相关。利用本发明可以通过基因工程技术提高小麦中黄酮类物质的含量，为小麦分子辅助育种提供重要的研究价值。
附图说明
图1为实施例2中扩增DNA的PCR产物电泳图；图中，marker为擎科DL5000 DNAMarker，泳道1、2为C4H-3A，3、4为C4H-3B，5、6为C4H-3D。
图2为实施例3中扩增cDNA的PCR产物电泳图；图中，marker为擎科DL5000 DNAMarker，泳道1、2为C4H-3A，3、4为C4H-3B，5、6为C4H-3D。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因的克隆
1.在NCBI搜索C4H基因，得到小麦近源物种大麦肉桂酸-4-羟基化酶的cDNA序列，进一步将大麦cDNA序列放置小麦数据库blast(http://202.194.139.32/)，在第三染色体得到3条相似度很高的序列，将3条序列5’和3’两边各延伸200bp，下载该序列；
2.根据步骤1)获得的3条序列，使用DNAMAN比对，利用三条同源序列之间的差异，在5’和3’端延伸的200bp内设计特异性引物，所述引物信息如表1所示，扩增出三条染色体序列，如SEQ ID NO：1-3所示；PCR扩增方法为：
使用北京全式金公司的TransStart FastPfu高保真酶，PCR反应体系为25μl：其中5×TransStart FastPfu Buffer 5μl，dNTPs 2.5μl，上下游引物各0.5μl，TransStartFastPfu DNA Polynerase0.5μl，DNA模板2μl，最后加ddH2O至25μl。
PCR反应液的程序为：第一步：95℃5min；第二步：95℃45s，Tm 45s，72℃2min30s，35个循环；第三步：72℃10min，4℃保存。
3.将引物与第三染色体缺体验证，证实为特异性引物，将扩增产物切胶回收，纯化后测序检测通过比对证实为小麦C4H基因，命名为C4H-3A，基因序列如SEQ ID NO：1所示；命名为C4H-3B，基因序列如SEQ ID NO：2，命名为C4H-3D，基因序列如SEQ ID NO：3。
PCR产物胶回收使用通用生物公司胶回收试剂盒，连接转化使用全式金公司pEASYBLUNT载体以及Trans T1感受态细胞，挑选阳性克隆送至上海生工公司测序。
表1引物序列信息
Figure BDA0002282788770000051
实施例2
引物检测小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因中的应用
S1.提取待测小麦的基因组DNA，小麦品种安农0711；
S2.以待测小麦的基因组DNA为模板，表1所述的引物进行PCR扩增反应；
PCR扩增体系为：共25μl，其中5×TransStart FastPfu Buffer 5μl，dNTPs 2.5μl，上下游引物各0.5μl，TransStart FastPfu DNA Polynerase0.5μl，模板DNA2μl，ddH2O14μl。
PCR程序为：第一步：95℃5min；第二步：95℃45s，Tm 45s(具体温度视每对引物而异)，72℃2min30s，35个循环；第三步：72℃10min。
S3.检测PCR扩增产物，结果如图1所示。
实施例3
引物在扩增小麦肉桂酸-4-羟基化酶cDNA中的应用
1)使用天根生物公司的RNA提取试剂盒提取小麦茎秆RNA，并使用擎科生物公司的反转录试剂盒反转录得到cDNA。
2)在NCBI通过大麦cDNA序列比对得到一条相似性很高的小麦cDNA序列(登录号：AK332115.1)，使用DNAMAN软件将克隆测序得到的序列与小麦cDNA序列比对发现，属于小麦C4H基因的转录组数据，同时发现小麦cDNA序列包含已知克隆序列，因此推断通过基因组扩增的引物同样可以扩增cDNA。将扩增产物切胶回收，纯化后测序检测分别得到3条不同的染色体序列，通过DNAMAN将两次测序结果比对发现，分别是小麦C4H基因第三染色体的A、B、D序列，如SEQ ID NO：10-12所示。
3)根据测序得到的C4H的cDNA序列，设计RACE引物，引物为：
5’端：
5’-3D-2r：ACCGTCATGATGCGCCGCATCTTT，SEQ ID NO：13；
qY-3D-r：AGGACGTTGTCCTCGTTGATCTCC，SEQ ID NO：14；
3’端：
3-RACE-5：GGCCAACGGCAACGACTTCAGGTA，SEQ ID NO：15；
根据Takara公司
Figure BDA0002282788770000061
RACE 5’/3’Kit步骤克隆C4H基因5’和3’基因序列(PCR程序作修改)，将扩增产物切胶回收，纯化后测序检测得到5’和3’两端基因序列。
PCR程序修改部分为：
94℃3min；94℃30s，68℃30s，72℃2min 35个循环；72℃5min；4℃保存。
4)根据已知cDNA序列与测序得到的RACE序列，通过DNAMAN软件比对发现，我们从引物5’-3D-2r得到cDNA的5’端序列，从引物qY-3D-r和3-RACE-5中都得到3’端序列，然后依据比对结果，根据重合序列剪辑拼接得到完整的小麦C4H基因完整的cDNA序列，如SEQ IDNO：16-18所示，电泳检测结果如图2所示。
5)由序列分析可以得知C4H基因都含有2个内含子，序列长度分别为3A:186bp、568bp，3B:188bp、672bp，3D:193bp、656bp。测序结果与小麦数据库以及大麦C4H基因序列比对，证实所克隆得到的序列是小麦C4H基因的DNA序列以及cDNA序列，为小麦分子辅助育种提供了重要的研究价值。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因及其扩增引物和应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2384
<212> DNA
<213> 小麦
<400> 1
cacaacaacc caaccgcaac cgttccagag cgccaacaca caacagagcg gcagcagttc 60
ccgggccgtt cccgccccgg ccggcgccat ggacttcgtc ttcgtggaga agctcctcgt 120
gggcctcctc gcggccgtgg tgggcgccat cgtcgtgtcc aagatccggg gccgcaagct 180
gcggctgccg ccgggcccct tcccggtgcc catcttcggc aactggctgc aggtcggcga 240
cgacctgaac caccgcaacc tggcggcgat ggcgcgcaag ttcggcgagg tcttcctcct 300
ccgcatgggc cagcgcaacc tggtggtggt ctcctccccg ccgctggccc gcgaggtgct 360
ccacacgcag ggcgtggagt tcgggtcccg cacccgcaac gtggtgttcg acatcttcac 420
cggcgagggc caggacatgg tgttcaccgt gtacggcgac cactggcgca agatgcggcg 480
catcatgacc gtgcccttct tcaccaacaa ggtggtgcag cagtaccggc ccgggtggga 540
ggccgaggcg gccttcgtgg tggacaacgt ccgcgccgac cccagggccg ccaccgatgg 600
cgtcgtgctc cgccgccacc tgcagctcat gatgtacaac aacatgtacc gcatcatgtt 660
cgaccggcgg ttcgagagca tggacgaccc gctgttcctc cgcctccggg cgctcaacgg 720
cgagcgcagc cgcctcgcgc agagcttcga gtacaactac ggcgacttca tccccgtcct 780
ccgccccttc ctccgcggct acctccggct ctgcaaggag gtcaaggaga cccgcctcaa 840
gctcttcaag gattacttcc tggacgagag gaagtaagct ctccactagt cttaattaat 900
tgagacatct ttcttgatcc atgtcttcct aactttccat gattagctgg gccatttggc 960
tgaaagcgaa aggccaacca tgagaaatca tggggatggc atgatagatt tgctgatatg 1020
ttgaggcccc ttgtgcgtgc ctgcttgtgt gtgtgcagga agctggtgag caccaaggcc 1080
gtggaagaca acggtgggct caagtgcgcc attgatcaca tcctggaggc ggagcagaag 1140
ggggagatca acgaggacaa cgtcctctac atcatcgaga acatcaacgt cgcaggtaca 1200
cttaaatttc tcttcatttc ttttatttct ggcagagatt gcgttgcatt ggcattttcg 1260
tttgtgagat agcaacactg taccatcgcg tcacatctgt ggttggagta tagtgctgtc 1320
ctagaaggtt ggtgaagtgt ctggtccaga agcaccagga ctatagaggc atttgtcagt 1380
tgtcactgta cacctggtca aaaatactcg cctaacctca attcggcgtt ccaaactaca 1440
ccggcctttt tttctccgga acttactaca ccaacctaaa tagcaccagc accaaaccct 1500
gtactgtacc agtcgcttct tcagcagtag tgccaccaat tatctatcta tcggggaaca 1560
gctagcaggc accactctcc cagagtggtc ttcgattggc cctcgtggat ttggccccat 1620
cccttccagg gggccgccct cgtggaggac ggtcagaccg acggcaatgc accaccatgt 1680
ccgtgaaact gtgtcgtgct atgagtgttg aattgatcgg ctgttgaaaa tgatctctga 1740
cgtgttgcct gtgaaccatg cagcgatcga gacgacgctg tggtcgatcg agtgggggct 1800
ggcggagctg gtgaaccacc cggagatcca gcagaagctg cgggacgaga tggacgcggt 1860
gctgggcgtc gggcaccaga tcacggagcc cgacacgcac aagctcccct acctgcaggc 1920
ggtgatcaag gagacgctgc ggctgcgcat ggccatcccg ctgctggtgc cccacatgaa 1980
cctccacgac gccaagctcg ccggctacaa catccccgcc gagagcaaga tcctcgtcaa 2040
cgcctggttc ctcgccaaca accccgagca gtggaagcgg cccgacgagt tccggccgga 2100
gcgcttcctg gaggaggaga agcacgtgga ggccaacggc aacgacttca ggtacctgcc 2160
cttcggcgtc ggccgccgga gctgccccgg catcatcctc gcgctgccca tcctcggcat 2220
caccatcggc cgcctcgtcc agaacttcgt gctcacgccg ccgcccggcc aggacaagct 2280
tgacacgact gagaagggtg gccagttcag cctccacatc ctcaagcact ccaccatcgt 2340
cgccaagccc agagtgttct aagcagtccc gtaccggacg tacg 2384
<210> 2
<211> 2505
<212> DNA
<213> 小麦
<400> 2
acacaacaga gcggtaacag tttcccgggc agttcccgcc ccggccggcg ccatggactt 60
cgtcttcgtg gagaagctcc tcgcgggcct cctcgcggcc gtggtgggcg ccatcgtggt 120
gtccaagatc cggggccgca agctgaggct gccgccgggc cccttcccgg tccccatctt 180
cggcaactgg ctgcaggtcg gcgacgacct gaaccaccgc aacctggcgg cgatggcccg 240
caagttcggc gaggtcttcc tcctccgcat gggccagcgc aacctggtgg tggtctcctc 300
tccgccgctc gcccgcgagg tgctccacac gcagggcgtg gagttcgggt cccgcacccg 360
caacgtggtg ttcgacatct tcacgggcga gggccaagac atggtgttca ccgtgtacgg 420
tgaccactgg cgcaagatgc ggcgcatcat gacggtgccc ttcttcacca acaaggtggt 480
gcagcagtac cggcccgggt gggaggccga ggcggccttc gtcgtcgaca acgtccgcgc 540
cgaccccagg gccgccaccg agggcgtcgt gctccgccgc cacctgcagc tcatgatgta 600
caacaacatg taccgcatca tgttcgaccg gcggttcgag agcatggacg acccgctgtt 660
cctccggctc cgggcgctca acggcgagcg cagccgcctc gcgcaaagct tcgagtacaa 720
ctacggcgac ttcatcccca tcctccgccc cttcctccgc ggctacctca ggctctgcaa 780
ggaggtcaag gagacccgcc tcaagctctt caaggattac ttcctggacg agaggaagta 840
tgctcttcac ctattttact acacataatt gagaatccct gctgacccat gtcttcctaa 900
ctgtccatga ttagctgggc catttggctg aaagcgaaag agcaaccatg agaaatcatg 960
gggatggcat gatagattgc tgatatggtg atgcgccgtg tgcgtgcctg tttgtgtgtg 1020
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gatcacatcc tggaggctga gcagaagggg gagatcaacg aggacaacgt cctctacatc 1140
atcgagaaca tcaacgtcgc aggtatgctt aggtttctct tcatttcttt tatttctggc 1200
agaaattgcg ttgcattggc attttcgctt gtgagatagc aacactgtac catcgcgtca 1260
catctggggt tggagtatag tgctggcctg gaaggttggt gaagtgtttg gtccagaagc 1320
accaggacta taggagcatt tgtcagttgt cactgtgcac tggtcaaaaa tactcaccta 1380
acctcaattc ggtgttccaa actacaccag ccttttttcc tcccgaaact tattacacca 1440
acctaaatag catcagcacc aaactcccct gtatcagtcg cttcttcagc ggtagtgcca 1500
ccaattatct atcggggaac agctagcagg tgccactctg aaaacccaga gtggtcttca 1560
attggccctc gtggattttg ccccatccat tgcagggggg ccgtcctcgt ggaggacggt 1620
cagactgcaa tgcaccacca tgtccgtgaa actatttctg tccatgccga ctgtggcaca 1680
atcaagtgcc atcacgtctg ctctcattga gcaggcggta gcgaccgatc agtacggcga 1740
cctgattgcc agtagaaatg atcgagcgtt tggaatgttc aggcgacggt gtttcccttt 1800
tttttcctaa tttgtttgcc cgtgaactat gcagcgatcg agacgacgct gtggtcgatc 1860
gagtgggggc tggcggagct ggtgaaccac ccggagatcc agcagaagct tcgcgacgaa 1920
atggacgcgg tgctgggcgc ggggcaccag atcacggagc cggagacgca caagctcccc 1980
tacctgcagg cggtgatcaa ggagacgctc cggctgcgca tggccatccc gctgctggtg 2040
ccccacatga acctccacga cgccaagctc gccggctaca acatccccgc cgagagcaag 2100
atcctcgtca acgcctggtt cctcgccaac aacccggagc agtggaagcg gcccgacgag 2160
ttccggccgg agcgcttcct ggaggaggag aagcacgtgg aggccaacgg caacgacttc 2220
aggtacctgc ccttcggcgt cggccgccgg agctgccccg gcatcatcct cgcgctgccc 2280
atcctcggca tcaccatcgg ccgcctcgtc cagaacttcg tgctcacgcc gccgcccggc 2340
caggacaagc tcgacaccac ggagaagggc ggccagttca gcctccacat cctcaagcac 2400
tccaccatcg tcgccaagcc cagagtgttc tagagcagcg acgtacgtgc tctggagttt 2460
ggacttccag cattttggtt tggtggtgtt gtacttcacg atgaa 2505
<210> 3
<211> 2662
<212> DNA
<213> 小麦
<400> 3
aaacagaaca accaacccca ccccccgttc cagagcgcga tcacacaaca gagcggtagc 60
agttcctggg ccgttcccgc cccggccggc gccatggact tcgtcttcgt ggagaagctc 120
ctcgtgggcc tcctggcggc cgtggtgggc gccatcgtgg tgtccaagat ccggggccgc 180
aagctgaggc tgccgccggg ccccttcccg gtccccatct tcggcaactg gctgcaggtc 240
ggcgacgacc tgaaccaccg caacctggcg gcgatggcgc gcaagttcgg cgaggtcttc 300
ctcctccgca tgggccagcg caacctggtg gtggtctcct cgccgccgct ggcgcgcgag 360
gtgctccaca cgcagggcgt ggagttcggg tcccgcaccc gcaacgtggt gttcgacatc 420
ttcaccggcg agggccagga catggtgttc accgtgtacg gcgaccactg gcgaaagatg 480
cggcgcatca tgacggtgcc cttcttcacc aacaaggtgg tgcagcagta ccggcccggg 540
tgggaggccg aggcggcctt cgtggtggac aacgtccgcg ccgaccccag ggccgccacc 600
gacggcgtcg tgctccgccg ccacctgcag ctcatgatgt acaacaacat gtaccgcatc 660
atgttcgacc ggcggttcga gagcatggac gacccgctgt tcctccgcct ccgggcgctc 720
aacggcgagc gcagccgcct cgcgcagagc ttcgagtaca actacggcga cttcatcccc 780
atcctccgcc ccttcctccg cggctacctc cggctctgca aggaggtcaa ggagacccgc 840
ctcaagctct tcaaggatta cttcctggac gagaggaagt aagcagctct tcaccaattt 900
tattatgcat aattgagagt ccctgttgac ccatgtcttc ctaactgtcc atgattagct 960
gggccatttg actgaaagcg aaagaccaac catgagaaat catggggatg gcatgataga 1020
ttgctgatat ggtgaggcgc cttgtgcgtg cctgcttgtg tgtgtgtgca ggaagctggt 1080
gagcaccaag gccatggaca acaacggtgg gctcaagtgc gccattgatc acatcctgga 1140
ggctgagcag aagggggaga tcaacgagga caacgtcctc tacatcatcg agaacatcaa 1200
cgtcgccggt acgctcttca tttcttttat ttccagcaga gattgcattg cattttcgtt 1260
tgtgagatag caacactgca ccatcgcgtc acatctgggg ctggagtgta gtgctggcct 1320
ggaaggttgg tgaagtgttt ggtccagaag caccaggact ataggagcat ttgtcagttg 1380
tcactgtgca ctggtcaaaa atactcacct aacctcaatt cgctgttcca aaccacacca 1440
gccttttttt ctcccgaaac ttattacacc aacctaaata gcaccagcac caaaccctgt 1500
actgtaccag tcgcttcttc agcactcagc agcagtgcca ccaattatct gaaaacccag 1560
ggtagtcttc agttggcctt cgtggatttg gccccatccg ggggccgccc tcgtggagct 1620
cgtgaaagca actggcatcc gggggcaatg caccaccatg tccgtgaaac tatttctgcc 1680
catgccgact gtggcacaat caagtgccat cccatctact ctcattgagc aggcggtagc 1740
gacagatcag tactgcgacc tgattgccag tagaaatgat gattgttgaa atgatcgatc 1800
gttgaaatgt tcaggtgatg gtgtttccca tttttcctaa tttgtttgcc cgtgaaccat 1860
gcagcgatcg agacgacgct gtggtcgatc gagtgggggc tggcggagct ggtgaaccac 1920
ccggagatcc agcagaagct gcgggacgag atggacgcgg tgctgggcgt cgggcaccag 1980
atcacggagc cggacacgca caggctcccc tacctgcagg cggtgatcaa ggagacgctc 2040
cggctgcgca tggccatccc gctgctggtg ccccacatga acctccacga cgccaagctc 2100
gccggctaca acatccccgc cgagagcaag atcctcgtca acgcctggtt cctcgccaac 2160
aaccccgagc agtggaagcg gcccgacgag ttccgccccg agaggttcct cgaggaggag 2220
aagcacgtgg aggccaacgg caacgacttc aggtacctgc ccttcggcgt cggccgtcgg 2280
agctgccccg gcatcatcct cgcgctcccc atcctcggca tcaccatcgg ccgcctcgtc 2340
cagaacttcg tgctctcgcc gccgcccggc caggacaagc ttgacacgac tgagaagggc 2400
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ggtgttgtag tactttcatg attgttcgct cgtcctaagt atacttgatt atagtatctg 2580
tcacagagta gacacacgtt tcgttaatgt tatccgcaag aaacagagga gctgaagaaa 2640
ggccaaacct gatgctgcga ta 2662
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacaacaacc caaccgcaac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgtacgtccg gtacgggact 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acacaacaga gcggtaacag ttt 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caatcgtgaa agtacaacac c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaacagaaca accaacccca c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tatcgcagca tcaggtttgg 20
<210> 10
<211> 1631
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cacaacaacc caaccgcaac cgttccagag cgccaacaca caacagagcg gcagcagttc 60
ccgggccgtt cccgccccgg ccggcgccat ggacttcgtc ttcgtggaga agctcctcgt 120
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cgacctgaac caccgcaacc tggcggcgat ggcgcgcaag ttcggcgagg tcttcctcct 300
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ccgccccttc ctccgcggct acctccggct ctgcaaggag gtcaaggaga cccgcctcaa 840
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ccacatcctc aagcactcca ccatcgtcgc caagcccaga gtgttctaag cagtcccgta 1620
ccggacgtac g 1631
<210> 12
<211> 1645
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acacaacaga gcggtaacag tttcccgggc agttcccgcc ccggccggcg ccatggactt 60
cgtcttcgtg gagaagctcc tcgcgggcct cctcgcggcc gtggtgggcg ccatcgtggt 120
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cctggaggct gagcagaagg gggagatcaa cgaggacaac gtcctctaca tcatcgagaa 960
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ggagaagggc ggccagttca gcctccacat cctcaagcac tccaccatcg tcgccaagcc 1560
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tggtggtgtt gtacttcacg atgaa 1645
<210> 12
<211> 1813
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttacagaaca accaacccca ccccccgttc cagagcgcga tcacacaaca gagcggtagc 60
agttcctggg ccgttcccgc cccggccggc gccatggact tcgtcttcgt ggagaagctc 120
ctcgtgggcc tcctggcggc cgtggtgggc gccatcgtgg tgtccaagat ccggggccgc 180
aagctgaggc tgccgccggg ccccttcccg gtccccatct tcggcaactg gctgcaggtc 240
ggcgacgacc tgaaccaccg caacctggcg gcgatggcgc gcaagttcgg cgaggtcttc 300
ctcctccgca tgggccagcg caacctggtg gtggtctcct cgccgccgct ggcgcgcgag 360
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ctcaagctct tcaaggatta cttcctggac gagaggaaga agctggtgag caccaaggcc 900
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gtgctctcgc cgccgcccgg ccaggacaag cttgacacga ctgagaaggg cggccagttc 1560
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gccgtgccgg acgtacgtgc tctggagttt ggacttccag cattttggtt tggtgttgta 1680
gtactttcat gattgttcgc tcgtcctaag tatacttgat tatagtatct gtcacagagt 1740
agacacacgt ttcgttaatg ttatccgcaa gaaacagagg agctgaagaa aggccaaacc 1800
tgatgctgcg ata 1813
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
accgtcatga tgcgccgcat cttt 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aggacgttgt cctcgttgat ctcc 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggccaacggc aacgacttca ggta 24
<210> 16
<211> 1943
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gagggacaaa acacaacaac ccaaccgcaa ccgttccaga gcgccaacac acaacagagc 60
ggcagcagtt cccgggccgt tcccgccccg gccggcgcca tggacttcgt cttcgtggag 120
aagctcctcg tgggcctcct cgcggccgtg gtgggcgcca tcgtcgtgtc caagatccgg 180
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caggtcggcg acgacctgaa ccaccgcaac ctggcggcga tggcgcgcaa gttcggcgag 300
gtcttcctcc tccgcatggg ccagcgcaac ctggtggtgg tctcctcccc gccgctggcc 360
cgcgaggtgc tccacacgca gggcgtggag ttcgggtccc gcacccgcaa cgtggtgttc 420
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gccaccgatg gcgtcgtgct ccgccgccac ctgcagctca tgatgtacaa caacatgtac 660
cgcatcatgt tcgaccggcg gttcgagagc atggacgacc cgctgttcct ccgcctccgg 720
gcgctcaacg gcgagcgcag ccgcctcgcg cagagcttcg agtacaacta cggcgacttc 780
atccccgtcc tccgcccctt cctccgcggc tacctccggc tctgcaagga ggtcaaggag 840
acccgcctca agctcttcaa ggattacttc ctggacgaga ggaagaagct ggtgagcacc 900
aaggccgtgg aagacaacgg tgggctcaag tgcgccattg atcacatcct ggaggcggag 960
cagaaggggg agatcaacga ggacaacgtc ctctacatca tcgagaacat caacgtcgca 1020
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acggagcccg acacgcacaa gctcccctac ctgcaggcgg tgatcaagga gacgctgcgg 1200
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ttgtactttc atgattgttc gctcgtccta agtatacttg attatagtat ctgtcacaga 1740
gtagacgcac gtttcgttaa tgttatccgc aaggaacaga ggagctgaag aaatgtcgaa 1800
cggggaggaa aagactggac gatttccatc agatgtactc ctgatgctgc cataaattaa 1860
atcctcaaaa tattgatgat tttttcacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1943
<210> 17
<211> 1970
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gagggacaga ccagaacaac ccaaccgcac ccgttccaga gcgcgatcac acaacagagc 60
ggtaacagtt tcccgggcag ttcccgcccc ggccggcgcc atggacttcg tcttcgtgga 120
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gcaggtcggc gacgacctga accaccgcaa cctggcggcg atggcccgca agttcggcga 300
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ccagttcagc ctccacatcc tcaagcactc caccatcgtc gccaagccca gagtgttcta 1620
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actttcacga ttgttcgctc gtcctaagta tacttgatta tagtatccgt cacagagtag 1740
acacacgttt cgttaatgtt atccgcaaga aaacagagga gctgaagaaa tgtcgaacgg 1800
ggaggaaaag actggacgat ttccgtcaga tgtactcctg atgctgccat aaattaaatc 1860
ctcaaaatat tgatgatttt ttcacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1970
<210> 18
<211> 1924
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gagggacaaa acagaacaac caaccccacc ccccgttcca gagcgcgatc acacaacaga 60
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ggggccgcaa gctgaggctg ccgccgggcc ccttcccggt ccccatcttc ggcaactggc 240
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cgcgcgaggt gctccacacg cagggcgtgg agttcgggtc ccgcacccgc aacgtggtgt 420
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ccgccaccga cggcgtcgtg ctccgccgcc acctgcagct catgatgtac aacaacatgt 660
accgcatcat gttcgaccgg cggttcgaga gcatggacga cccgctgttc ctccgcctcc 720
gggcgctcaa cggcgagcgc agccgcctcg cgcagagctt cgagtacaac tacggcgact 780
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agacccgcct caagctcttc aaggattact tcctggacga gaggaagaag ctggtgagca 900
ccaaggccat ggacaacaac ggtgggctca agtgcgccat tgatcacatc ctggaggctg 960
agcagaaggg ggagatcaac gaggacaacg tcctctacat catcgagaac atcaacgtcg 1020
ccgcgatcga gacgacgctg tggtcgatcg agtgggggct ggcggagctg gtgaaccacc 1080
cggagatcca gcagaagctg cgggacgaga tggacgcggt gctgggcgtc gggcaccaga 1140
tcacggagcc ggacacgcac aggctcccct acctgcaggc ggtgatcaag gagacgctcc 1200
ggctgcgcat ggccatcccg ctgctggtgc cccacatgaa cctccacgac gccaagctcg 1260
ccggctacaa catccccgcc gagagcaaga tcctcgtcaa cgcctggttc ctcgccaaca 1320
accccgagca gtggaagcgg cccgacgagt tccgccccga gaggttcctc gaggaggaga 1380
agcacgtgga ggccaacggc aacgacttca ggtacctgcc cttcggcgtc ggccgtcgga 1440
gctgccccgg catcatcctc gcgctcccca tcctcggcat caccatcggc cgcctcgtcc 1500
agaacttcgt gctctcgccg ccgcccggcc aggacaagct tgacacgact gagaagggcg 1560
gccagttcag cctccacatc ctcaagcact ccaccatcgt ggccaagccc agggtgttct 1620
agagcagcgc cgtgccggac gtacgtgctc tggagtttgg acttccagca ttttggtttg 1680
gtgttgtagt actttcatga ttgttcgctc gtcctaagta tacttgatta tagtatctgt 1740
cacagagtag acacacgttt cgttaatgtt atccgcaaga aacagaggag ctgaagaaag 1800
gccaaacctg atgctgcgat aaattaaagt taaattcttg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaa 1924

Claims (7)

1.小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因，其特征在于，所述基因位于小麦A基因组第三染色体，命名为C4H-3A，基因序列如SEQ ID NO：1所示；或者位于小麦B基因组第三染色体，命名为C4H-3B，基因序列如SEQ ID NO：2所示；或者位于小麦D基因组第三染色体，命名为C4H-3D，基因序列如SEQ ID NO：3所示。
2.用于扩增权利要求1所述小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因的引物，其特征在于，所述引物序列如下所示：
C4H-3A基因的引物：
C4H-3A-F：5’-CACAACAACCCAACCGCAAC-3’；
C4H-3A-R：5’-CGTACGTCCGGTACGGGACT-3’；
C4H-3B基因的引物：
C4H-3B-F：5’-ACACAACAGAGCGGTAACAGTTT-3’；
C4H-3B-R：5’-CAATCGTGAAAGTACAACACC-3’；
C4H-3D基因的引物：
C4H-3D-F：5’-AAACAGAACAACCAACCCCAC-3’；
C4H-3D-R：5’-TATCGCAGCATCAGGTTTGG-3’。
3.利用权利要求2所述引物检测小麦肉桂酸-4-羟基化酶基因中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取待测小麦的基因组DNA；
S2.以待测小麦的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物进行PCR扩增反应；
S3.检测PCR扩增产物。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR扩增体系为：共25μl，其中5×TransStartFastPfu Buffer 5μl，dNTPs 2.5μl，上下游引物各0.5μl，TransStart FastPfu DNAPolynerase0.5μl，模板DNA2μl，ddH2O 14μl。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR程序为：第一步：95℃5min；第二步：95℃45s，Tm 45s，72℃2min30s，35个循环；第三步：72℃10min。
7.如权利要求2所述引物在扩增小麦肉桂酸-4-羟基化酶cDNA中的应用。
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