CN111621516B - 一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，根据NCBI数据库中序列信息，同源克隆获得目的基因，通过酶切‑连接将目的基因整合到植物过表达质粒载体中，再将重组植物载体转入农杆菌GV3101中。在LB培养基中28℃震荡培养农杆菌至OD600达1.0~1.2，离心集菌，倒去LB培养基，使用含有MgCl₂、MES和乙酰丁香酮的渗透液重悬菌体待用。使用医用注射器将农杆菌渗透液注入半红期的在体枣果实。通过观察枣果实表型变化、检测目的基因表达量及相关代谢产物含量，验证目的基因的功能。该方法避开了枣树稳定遗传转化重复性差、转化率低、耗时长等问题，可在短时间内验证基因功能，简单、快速且节约成本。

Description

一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，尤其涉及一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法。

背景技术

枣树（Ziziphus jujuba Mill.）为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus Mill.）植物，原产于我国黄河中下游地区，已有3000多年栽培历史。改革开放以来，枣产业发展迅速，已成为我国第一大干果树种，产量占到世界99%。枣果实营养极为丰富，据测定，枣果的环磷酸腺苷（cAMP）、维生素C、碳水化合物等重要食疗成分的含量居百果前茅。我国在枣树研究上处于国际领先地位。2014年，本课题组在世界上率先完成了枣全基因组测序，组装基因组437.65Mb，注释基因32808个。基于此，大量调控重要性状形成的候选关键基因被相继报道。但是，枣树转基因技术不成熟，枣树的基因稳定遗传转化体系鲜有报道，且转化效率低、可重复性差、耗时长；另一方面，枣树的基因瞬时表达技术体系目前尚无报道，导致枣树基因功能验证研究受到很大限制。

基因瞬时表达技术虽无法获得可遗传的转化植株（目的基因被导入寄主细胞，但未整合到寄主基因组中），但目的基因进入植物细胞后12h就可以表达，并持续80h以上。瞬时表达技术简单、快速的优势是稳定遗传转化所不能比拟的。果实性状对果树而言是最重要的性状。就果实品质性状而言，在果实发育的关键时期，进行基因瞬时表达调控研究是验证品质形成基因功能的一种行之有效的方法。因此，以在体枣果实为材料，建立调控果实品质性状形成相关基因的瞬时表达体系意义重大。本发明首次实现了以在体枣果实为材料的基因瞬时表达。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，利用这种方法可直接在枣树上对众多果实发育相关基因进行功能验证，规避了枣树稳定遗传转化方法存在的重复性差、转化率低、耗时长等诸多问题。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下。

一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，包括以下步骤：

步骤1，克隆待验证的目的基因：提取枣组织器官的RNA，经反转录得到cDNA作为PCR扩增的模版，以待验证目的基因的序列信息设计引物A，进行PCR扩增，获得目的基因的DNA。

步骤2，重组过表达载体的构建：将步骤1克隆的目的基因整合至植物过表达载体，构建植物重组过表达载体，并将所述植物重组过表达载体转入农杆菌GV3101中，获得携带重组质粒的农杆菌。

步骤3，注射侵染在体枣果实：以在体枣果实作为侵染靶目标，用步骤2获得的携带重组质粒的农杆菌进行注射侵染，并避光24h。

步骤4，目的基因的功能验证：进行注射果实的基因表达量分析及功能验证，即可。

进一步的，所述待验证目的基因为腺苷酸环化酶基因。

进一步的，步骤2中所述植物过表达载体采用pCG3301质粒。

进一步的，步骤3中所述枣果实处于半红期。

进一步的，步骤3中，注射侵染时，采用注射器，将携带重组质粒的农杆菌的渗透液从半红期枣果实的果柄处缓慢注满果实，保证含有农杆菌的渗透液注射完全，然后用锡箔纸包裹注射果实所在的结果枝进行避光，24h后取下锡箔纸，即可。

进一步的，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为未知序列，来源于枣全基因组数据库时，采用同源克隆的方法进行待验证的目的基因的克隆。

更进一步的，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为未知序列，来源于枣全基因组数据库时，所述克隆待验证的目的基因的具体操作步骤如下。

步骤1-A：取冬枣半红时期果实，加入液氮研磨成粉后，提取枣果实RNA，并将得到的RNA反转录成cDNA，备用。

步骤1-B：目的基因的获得：根据NCBI中注释的若干植物的候选目的基因的共同保守序列设计同源克隆引物，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，获得特异条带，切胶回收后进行一代测序获得所述特异条带中候选基因的DNA序列；利用获得的所述候选基因的DNA序列的表达标签，搜索枣全基因组数据库，找到与所述候选基因的DNA序列一致的基因序列，即为目的基因。

步骤1-C：以所述枣全基因组数据库中记载的目的基因的序列信息设计引物A。

步骤1-D：PCR 扩增：以步骤1-A获得的cDNA为模版，基于步骤1-C设计的引物A，进行PCR扩增。

步骤1-E：将步骤1-D进行PCR扩增后的体系溶液通过琼脂糖凝胶电泳，获得阳性条带，回收阳性条带的DNA ，对回收的DNA 进行测序验证，获得目的基因的DNA，并对目的基因的序列信息进行更正。

进一步的，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为已知序列时，所述克隆待验证的目的基因的具体操作步骤如下。

步骤1-a：取冬枣半红时期果实，加入液氮研磨成粉后，提取枣果实RNA，并将得到的RNA反转录成cDNA，备用。

步骤1-b：以所述目的基因的序列信息设计引物A。

步骤1-c：PCR扩增：以步骤1-a获得的cDNA为模版，基于步骤1-b设计的引物A，进行PCR扩增。

步骤1-e：将步骤1-c进行PCR扩增后的体系溶液通过琼脂糖凝胶电泳，获得阳性条带，回收阳性条带的DNA ，对回收的DNA 进行测序验证，获得目的基因的DNA。

进一步的，步骤2中所述重组过表达载体的构建的具体的操作步骤如下：

步骤2-1：酶切：植物过表达载体选择携带35S强启动子、GFP标签、卡那霉素抗性基因的质粒载体，使用限制性内切酶切断所述质粒载体，酶切位点位于GFP标签前，获得酶切后的质粒载体，备用。

步骤2-2：以目的基因的序列信息设计引物B，并以步骤1中获得的目的基因的DNA为模版，进行PCR扩增后，获得两端加有15bp载体序列的目的基因。

步骤2-3：采用连接酶将步骤2-2获得的加长目的基因连接至步骤2-1获得的酶切后的质粒载体上，获得重组质粒。

步骤2-4：将步骤2-3获得的重组质粒转入DH5α感受态细胞后，富集培养，获得富集有重组质粒的菌液。

步骤2-5：提取步骤2-4获得的富集有重组质粒的菌液中的重组质粒，并将提取的重组质粒采用冻融转化法转入农杆菌GV3101中，获得携带重组质粒的农杆菌。

更进一步的，步骤2-1中所述限制性内切酶采用SmaI快切酶。

进一步的，步骤3中注射侵染在体枣果实的具体的操作步骤如下：

步骤3-1：将步骤2获得的携带重组质粒的农杆菌活化培养后，悬浮于渗透液中，并调整菌液浓度为OD600 = 0.6 ~ 0.8，即得含有农杆菌的渗透液。

步骤3-2：将步骤3-1获得的含有农杆菌的渗透液从半红期枣果实的果柄处缓慢注满果实，保证含有农杆菌的渗透液注射完全，然后用锡箔纸包裹注射果实所在的结果枝进行避光，24h后取下锡箔纸，即可。

更进一步的，步骤3-1中所述渗透液中包括10mM MES，10mM MgCl₂和200mM乙酰丁香酮，且pH=6.0。

进一步的，步骤4中所述目的基因的功能验证的具体方法为：分别于注射前、注射后24h和注射后72h观察枣果实表观变化，并采集枣果实样品进行RNA提取、荧光定量PCR检测和相关生理指标的测定。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：克服木本植物枣树基因功能验证困难的难题，以枣在体果实为材料进行农杆菌侵染，在短时间内即可验证基因功能，避开了枣树稳定遗传转化体系的诸多问题，简单、快速且节约成本。

附图说明

图1为枣腺苷酸环化酶候选基因（C-ZjAC）电泳图（M为分子量标记泳道，G为C-ZjAC泳道）。

图2为农杆菌注射侵染操作方法展示图。

图3为农杆菌注射侵染后枣果实表型观察结果。其中，CK为未注射农杆菌的对照组，空载为注射带有空质粒载体的农杆菌对照组，C-ZjAC为注射带有重组质粒的农杆菌的处理组。

图4为农杆菌侵染后C-ZjAC的相对表达量变化结果。其中，CK为未注射农杆菌对照组，注射空载体为注射带有空质粒载体的农杆菌对照组，注射C-ZjAC为注射带有重组质粒的农杆菌的处理组。

图5为农杆菌侵染后果实中环磷酸腺苷（cAMP）的含量变化。其中，CK为未注射农杆菌对照组，注射空载体为注射带有空质粒载体的农杆菌对照组，注射C-ZjAC为注射带有重组质粒的农杆菌的处理组。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行进一步详细的叙述。

实施例1

本实施例以候选腺苷酸环化酶基因的瞬时表达为例，介绍一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，包括以下步骤。

步骤1，克隆待验证的目的基因：提取枣组织器官的RNA，经反转录得到cDNA作为PCR扩增的模版，以待验证目的基因的序列信息设计引物A，进行PCR扩增，获得目的基因的DNA。

当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为未知序列，来源于枣全基因组数据库时，采用同源克隆的方法进行待验证的目的基因的克隆，具体操作如下。

步骤1-A：取冬枣半红时期果实1g，加入液氮研磨成粉后，使用天根公司多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取枣果实RNA，使用FastQuant RT Kit反转录试剂盒将得到的RNA反转录成cDNA，备用。

步骤1-B：目的基因的获得：根据美国国家生物信息中心（NCBI）中注释的若干候选目的基因的共同保守序列【本实施例采用拟南芥腺苷酸环化酶基因（NM_126867.2）、孤挺花腺苷酸环化酶基因 （HM991704.1）、牵牛花腺苷酸环化酶基因（HM991705.1）基因的共同保守序列】设计同源克隆引物，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，获得一个特异条带（本实施例的特异性条带的分子量为600 bp 左右），切胶回收后进行一代测序获得候选目的基因序列；利用获得的所述候选目的基因序列的序列表达标签，搜索枣全基因组数据库，找到与所述候选目的基因序列高度同源的基因序列【本实施例为Ziziphus jujuba triphosphatetunnel metalloenzyme 3-like （PREDICTED）基因）】，即为目的基因的预测基因序列。

NCBI中注释的拟南芥腺苷酸环化酶基因（NM_126867.2）CDS序列信息为：5’-atggaagtcgaagtcaagctccgtctcctaaccgccgctgctcatctccgtctcaccactctcctcactccataccacctcaaaacccttcaccaacgcaacaccttcttcgacacacccaaaaacgacctctctctccgccgcgccgtcctccgtctccgcttccttcaaaacgccgccgtttccgcggcttctccttctccgccgcgttgtatcgtctctcttaaagcgaagccaactctagctaatgggattagtcgtgtggaggaagatgaagaggagattgagtattggattggtggctttgagaatgttaggaatgtttatgagtggagaggtgttaaacttgaggttgatgagactaagtatgattttgggaattgttatgagattgaatgtgagacagaggaaccagagcgtgttaagacaatgattgaggagtttcttacagaggagaagattgagttttcgaattccgacatgacaaagtttgctgttttccggtcaggaaaacttccttga-3’（SEQ IDNo.1）。

NCBI中注释的孤挺花腺苷酸环化酶基因 （HM991704.1）CDS序列信息为：5’-atggagatcgagatcaagctccgcctcccttctccctcggcccaccagctcctctccgacgccctttcccccttccacctcaagacccacctccagcacaacctcttcttcgacaccgccgccggagacctcgcctccgtcttctccgccctcaggatccgattctacgacgccaacgccaaatgtgtcctctccctcaagtcccgccccaagctgtccgagggcgtcagccacgttgaggaggatgaagaagagatcgacccccagatcggtcaagaggtcaccgccaacccgtcaaagatgggatctttgcttgagaagtcgaggatttggaggagggtggtggacgagatcggggtggctgatgatggtggggagtttgtgtgtttgggtgggtttaggaatgtcagggcggtgtaccggtgggtggagggtttgattttggagctggacgaaacagaatacgggtttgggacgagttacgagattgagtgcgagacaacagagccggagagggttaaggggttgttagaggggttcttgaaggagaaggggatcccttatgagtactcgggggcttccaagtttgcggtttttcggtctggaaagcttttgccatga-3’（SEQ ID No.2）。

NCBI中注释的牵牛花腺苷酸环化酶基因（HM991705.1）CDS序列信息为：5’-atgtatggctccggcaggctccgtttgctgctagccaatggcaatgctacactccgaagattaaaaaccagcgccgccttctccgccaccgcctccatggaagtcgaagttaagcttcgtttacccgactccgcttctcaccagcgcctctccaccgttctctctccctaccacctcaaaacccacgctcaggaaaacgtcttcttcgacggagccagcgccgagctctcctccaacctcgccgtgcttcggctccgcttctacgacctcgattccagatgcgtcatctccctcaaggcaaaacccgtcatctccaacggaatcagccgcatagaggaggacgaagagcaactcgaccccaccatcgggcgcgcctgcgcggcggagccatggcggctactgctaattgacggttgcaggatcgtagagagagtgaagtcggagtatgaaattggggaaaagggtttggtctgcttgggcgggtttaggaatttgagaggagtgtatgagtggaaaggattgaaattggaggtcgacgagacgcattacgatttcggaacgggttatgagattgaatgcgagagctcggagcccgaaattgccaagaatctgattgaggagctgttaaacagtaatgaaattcagtattcttattctgaagtttcaaaatttgcaattttccgatcgggaaaactgcctcatcaatatcaataa-3’（SEQ ID No.3）。

所述同源克隆引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列为：5’-atggaagtcgaagtcaagct-3’（SEQ ID No.6）；所述下游引物的基因序列为：5’-gatcggaaaacagcgaatttg-3’（SEQ ID No.7）。

所述候选目的基因序列信息为：

所述枣全基因组数据库中记载的目的基因的序列信息为：5’-atgcattcgatggggacggaattgaaactcg

gatccgagactccacggcgcactgccgtctcaccaagcttttgtctgcatttcacgtcgaaactcaacaccaagagaatttcttctttgacggtgcc

aacaacgagctgtcatcacaacaagtcgtgctcttccttcggttctacggtgatgacaccccacaatgcttcatgtcactcaaagccagggcagtc

ctggacgagggtgtgtacagggttgatgaggaggtggaagagaatttcgagccagcggttgggcgcgcctgtgtcgcccaaccggagaagct

ttcgtcggtggagtgtgggatattgaagatgttaaaggagaagtttggggttctcaactttgtggggcttggagggtttgtcaatgtgagggatgtg

tacaagtgggagggcttgaaattggaggttgataagactctgtatgagtttgggactaatcatgagattgagtatgaaactagtgatcctgaagga

gtcaagaaggtgcttgaggagttcttgaaggagaatgggatccaatactcttactcgcaggcctcaaagtttgaggtttttcgatccaagaaacttc

cacagtcagtgaattga-3’（SEQ ID No.4）。

步骤1-C：以所述枣全基因组数据库中记载的目的基因的序列信息设计引物A，所述引物A 包括上游引物A 和下游引物A：

所述上游引物A的基因序列为：5’-atgcattcgatgggga-3’（SEQ ID No.8）；

所述下游引物A的基因序列为：5’-cattcactgactgtgga-3’（SEQ ID No.9）。

步骤1-D：PCR扩增：以步骤1-A获得的cDNA为模版，基于步骤1-C设计的引物A，进行PCR扩增（PCR体系： 2×Taq PCR Mastermix 12.5μL（天根生化科技（北京）有限公司）、上游引物A 1μL、下游引物1μL、cDNA模板1μL和双蒸水9.5μL）。

步骤1-E：将PCR扩增后的体系溶液进行琼脂糖凝胶电泳，获得阳性条带，回收阳性条带的DNA ，并对回收的DNA 进行测序验证，确定并获得目的基因的DNA并对目的基因的序列信息进行更正；更正后的目的基因的序列信息为：5’-atgcattcgatggggacggaattgaaacttc

ggatccgagactccacggcgcactgccgtctcaccaagcttttgtctgcatttcacgtcgaaactcaacaccaagagaatttcttctttgacggtgccaacaacgagctgtcatcacaacaagtcgtgctcttccttcggttctacggtgatgacaccccacaatgcttcatgtcactcaaagccagggcagtcctggacgagggtgtgtacagggttgatgaggaggtggaagagaatttcgagccagcggttgggcgcgcctgtgtcgcccaaccggagaagctttcgtcggtggagtgtgggatattgaagatgttaaaggagaagtttggggttctcaactttgtggggcttggagggtttgtcaatgtgagggatgtgtacaagtgggagggcttgaaattggaggttgataagactctgtatgagtttgggactaatcatgagattgagtgtgaaactagtgatcctgaaggagtcaagaaggtgcttgaggagttcttgaaggagaatgggatccaatactcttactcgcaggcctcaaagtttgaggtttttcgatccaagaaacttccacagtcagtgaattga-3’（SEQID No.5）。

步骤2，重组过表达载体的构建：将步骤1克隆的目的基因整合至植物过表达载体，构建植物重组过表达载体，并将所述植物重组过表达载体转入农杆菌GV3101中，获得携带重组质粒的农杆菌。

具体操作步骤如下：

步骤2-1：酶切：植物过表达载体为pCG3301质粒， pCG3301质粒载体携带35S强启动子、GFP标签、卡那霉素抗性基因；在GFP标签前有数个酶切位点，选择SmaI位点，使用Takara公司QuickCut™ SmaI快切酶对所述pCG3301质粒载体进行单酶切（30 ℃金属浴40min），然后再次通过琼脂糖凝胶电泳回收，获得酶切后的质粒载体，即单酶切线性载体，备用。

步骤2-2：制备具有目的基因的连接载体：依据全式金公司pEASY®-BasicSeamless Cloning and Assembly Kit说明书中的引物设计方法，以目的基因的序列信息（更正后或更正前均可）设计引物B，并以步骤1中获得的目的基因的DNA为模版，进行PCR扩增，然后再次通过琼脂糖凝胶电泳（图1）回收，获得具有目的基因的连接载体。

所述引物B包括上游引物B 和下游引物B：

所述上游引物B的基因序列为： 5’-acgagctcgggtacccatgcattcga-3’（SEQ IDNo.10）；

所述下游引物B的基因序列为：5’-tggggactctagaggatccccattcactgactgtgga-3’（SEQ ID No.11）。

步骤2-3：制重组质粒：使用全式金公司pEASY®-Basic Seamless Cloning andAssembly Kit中的连接酶将步骤2-2获得的具有目的基因的连接载体连接至步骤2-1获得的酶切后的质粒载体上，获得重组质粒；连接体系为：连接酶5μL、目的基因回收产物2μL和单酶切载体回收产物3μL，50℃金属浴中连接15min，即可。

步骤2-4：制携带重组质粒的菌液：利用热激转化法将步骤2-3获得的重组质粒转入DH5α感受态细胞后，加入LB液体培养基于37 ℃摇床中150rpm活化1h后，均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基中进行抗性筛选，37 ℃过夜培养；分别挑取数个阳性单菌落到含有卡那霉素抗性的液体LB中，37 ℃摇床150rpm过夜培养后，取500μL菌液样品，对菌液进行测序验证，验证正确，即获得带有重组质粒的菌液。

步骤2-5：制携带重组质粒的农杆菌：使用天根公司质粒快速提取试剂盒，提取步骤2-4获得的富集有重组质粒的菌液中的重组质粒，然后将提取的重组质粒加入LB液体培养基于28 ℃摇床中150rpm活化1h后，均匀涂布于含有50μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基中进行抗性筛选，28 ℃培养48h；再挑取阳性单菌落到含有利福平和卡那霉素抗性的液体LB中，28 ℃摇床150rpm过夜至菌液浑浊，即得获得携带重组质粒的农杆菌，将所述获得保存于终浓度15%的灭菌甘油中，-80 ℃保存，即GV3101甘油菌。

步骤3，注射侵染在体枣果实：以在体枣果实作为侵染靶目标，用步骤2 获得的携带重组质粒的农杆菌进行注射侵染。

具体操作如下：

步骤3-1：将步骤2获得并保存于-80 ℃的携带重组质粒的农杆菌（GV3101甘油菌）接种于含有50μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基，28 ℃活化培养48h，然后挑取部分菌落于含有利福平和卡那霉素的液体LB培养基中，28 ℃ 150rpm过夜培养，然后将菌液5000rpm离心10min，弃去LB培养基，然后加入渗透液进行重悬，并调整菌液浓度为OD600 = 0.6 ~ 0.8，得含有农杆菌的渗透液；所述渗透液的组成为：10mM MES，10mM MgCl₂和200mM乙酰丁香酮，且pH 为6.0。

步骤3-2：选取果实大小一致，且处于半红期的冬枣果树为材料，用1mL注射器将步骤3-1获得的含有农杆菌的渗透液从冬枣果柄处注入果实中（图2），注射时注意观察果实表皮的细微颜色变化、保证含有农杆菌的渗透液注射完全，然后用锡箔纸包裹注射果实所在的结果枝进行避光，24h后取下锡箔纸，即可。

步骤4，目的基因的功能验证：对注射果实的基因表达量分析及基因功能验证。

具体如下：分别于注射前（即0h）、注射后24h和注射后72h观察枣果实表观变化，并采集枣果实样品进行RNA提取、荧光定量PCR检测和相关生理指标的测定。以候选腺苷酸环化酶基因的瞬时表达为例，腺苷酸环化酶能够将ATP环化为cAMP（环磷酸腺苷），在验证枣候选腺苷酸环化酶基因（C-ZjAC）功能时，除观察处理组枣果实的表型变化、候选腺苷酸环化酶基因的表达量变化外，还需测定枣果实中cAMP的含量变化（即生理指标的测定）。

结果发现，处理组的枣果实的表型与对照组并无差异（图3），但处理组枣果实中候选腺苷酸环化酶基因的表达量急剧升高（图4），并且处理组枣果实中cAMP含量也显著增加（图5），可证明候选枣腺苷酸环化酶基因具有合成cAMP的功能。

实施例2

本实施例以候选腺苷酸环化酶基因的瞬时表达为例，介绍一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，包括以下步骤。

步骤1，克隆待验证的目的基因：提取枣组织器官的RNA，经反转录得到cDNA作为PCR扩增的模版，以待验证目的基因的序列信息设计引物A，进行PCR扩增，获得目的基因的DNA。

当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为已知序列，序列信息来源于实施例1步骤1-E中更正后的目的基因的序列信息时，具体操作如下。

步骤1-a：同实施例1中的步骤1-A。

步骤1-b：以目的基因的序列信息设计引物A；

所述目的基因的基因序列为：5’-atgcattcgatggggacggaattgaaacttcggatccgagactccacggcgcactgcc

gtctcaccaagcttttgtctgcatttcacgtcgaaactcaacaccaagagaatttcttctttgacggtgccaacaacgagctgtcatcacaacaagtc

gtgctcttccttcggttctacggtgatgacaccccacaatgcttcatgtcactcaaagccagggcagtcctggacgagggtgtgtacagggttgat

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ggttgataagactctgtatgagtttgggactaatcatgagattgagtatgaaactagtgatcctgaaggagtcaagaaggtgcttgaggagttcttg

aaggagaatgggatccaatactcttactcgcaggcctcaaagtttgaggtttttcgatccaagaaacttccacagtcagtgaattga-3’（SEQ ID No.5）。

所述引物A 包括上游引物A 和下游引物A ：

所述上游引物A的基因序列为：5’-atgcattcgatgggga-3’（SEQ ID No.8）；

所述下游引物A的基因序列为：5’-cattcactgactgtgga-3’（SEQ ID No.9）。

步骤1-c：进行PCR扩增：同实施例1中的步骤1-D；PCR体系：2×Taq PCR Mastermix12.5μL（天根生化科技（北京）有限公司）、上游引物A 1μL、下游引物1μL、已知序列DNA模板1μL和双蒸水9.5μL。

步骤1-d：将步骤1-c 中PCR扩增后的体系溶液进行琼脂糖凝胶电泳，获得阳性条带，回收阳性条带的DNA ，并对回收的DNA 进行测序验证，确定并获得目的基因的DNA ；当阳性条带中回收的DNA序列信息与步骤1-b中给出的目的基因的序列信息完全吻合时，即确定该阳性条带中所回收的DNA为目的基因的DNA 。

步骤2，重组过表达载体的构建：同实施例1中的步骤2。

步骤3，注射侵染在体枣果实：同实施例1中的步骤3。

步骤4，目的基因的功能验证：同实施例1中的步骤4。

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 522

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atggaagtcg aagtcaagct ccgtctccta accgccgctg ctcatctccg tctcaccact 60

ctcctcactc cataccacct caaaaccctt caccaacgca acaccttctt cgacacaccc 120

aaaaacgacc tctctctccg ccgcgccgtc ctccgtctcc gcttccttca aaacgccgcc 180

gtttccgcgg cttctccttc tccgccgcgt tgtatcgtct ctcttaaagc gaagccaact 240

ctagctaatg ggattagtcg tgtggaggaa gatgaagagg agattgagta ttggattggt 300

ggctttgaga atgttaggaa tgtttatgag tggagaggtg ttaaacttga ggttgatgag 360

actaagtatg attttgggaa ttgttatgag attgaatgtg agacagagga accagagcgt 420

gttaagacaa tgattgagga gtttcttaca gaggagaaga ttgagttttc gaattccgac 480

atgacaaagt ttgctgtttt ccggtcagga aaacttcctt ga 522

<210> 2

<211> 621

<212> DNA

<213> 孤挺花(Hippeastrum hybrid cultivar)

<400> 2

atggagatcg agatcaagct ccgcctccct tctccctcgg cccaccagct cctctccgac 60

gccctttccc ccttccacct caagacccac ctccagcaca acctcttctt cgacaccgcc 120

gccggagacc tcgcctccgt cttctccgcc ctcaggatcc gattctacga cgccaacgcc 180

aaatgtgtcc tctccctcaa gtcccgcccc aagctgtccg agggcgtcag ccacgttgag 240

gaggatgaag aagagatcga cccccagatc ggtcaagagg tcaccgccaa cccgtcaaag 300

atgggatctt tgcttgagaa gtcgaggatt tggaggaggg tggtggacga gatcggggtg 360

gctgatgatg gtggggagtt tgtgtgtttg ggtgggttta ggaatgtcag ggcggtgtac 420

cggtgggtgg agggtttgat tttggagctg gacgaaacag aatacgggtt tgggacgagt 480

tacgagattg agtgcgagac aacagagccg gagagggtta aggggttgtt agaggggttc 540

ttgaaggaga aggggatccc ttatgagtac tcgggggctt ccaagtttgc ggtttttcgg 600

tctggaaagc ttttgccatg a 621

<210> 3

<211> 714

<212> DNA

<213> 牵牛花(Ipomoea nil)

<400> 3

atgtatggct ccggcaggct ccgtttgctg ctagccaatg gcaatgctac actccgaaga 60

ttaaaaacca gcgccgcctt ctccgccacc gcctccatgg aagtcgaagt taagcttcgt 120

ttacccgact ccgcttctca ccagcgcctc tccaccgttc tctctcccta ccacctcaaa 180

acccacgctc aggaaaacgt cttcttcgac ggagccagcg ccgagctctc ctccaacctc 240

gccgtgcttc ggctccgctt ctacgacctc gattccagat gcgtcatctc cctcaaggca 300

aaacccgtca tctccaacgg aatcagccgc atagaggagg acgaagagca actcgacccc 360

accatcgggc gcgcctgcgc ggcggagcca tggcggctac tgctaattga cggttgcagg 420

atcgtagaga gagtgaagtc ggagtatgaa attggggaaa agggtttggt ctgcttgggc 480

gggtttagga atttgagagg agtgtatgag tggaaaggat tgaaattgga ggtcgacgag 540

acgcattacg atttcggaac gggttatgag attgaatgcg agagctcgga gcccgaaatt 600

gccaagaatc tgattgagga gctgttaaac agtaatgaaa ttcagtattc ttattctgaa 660

gtttcaaaat ttgcaatttt ccgatcggga aaactgcctc atcaatatca ataa 714

<210> 4

<211> 624

<212> DNA

<213> 枣(Ziziphus jujuba)

<400> 4

atgcattcga tggggacgga attgaaactt cggatccgag actccacggc gcactgccgt 60

ctcaccaagc ttttgtctgc atttcacgtc gaaactcaac accaagagaa tttcttcttt 120

gacggtgcca acaacgagct gtcatcacaa caagtcgtgc tcttccttcg gttctacggt 180

gatgacaccc cacaatgctt catgtcactc aaagccaggg cagtcctgga cgagggtgtg 240

tacagggttg atgaggaggt ggaagagaat ttcgagccag cggttgggcg cgcctgtgtc 300

gcccaaccgg agaagctttc gtcggtggag tgtgggatat tgaagatgtt aaaggagaag 360

tttggggttc tcaactttgt ggggcttgga gggtttgtca atgtgaggga tgtgtacaag 420

tgggagggct tgaaattgga ggttgataag actctgtatg agtttgggac taatcatgag 480

attgagtatg aaactagtga tcctgaagga gtcaagaagg tgcttgagga gttcttgaag 540

gagaatggga tccaatactc ttactcgcag gcctcaaagt ttgaggtttt tcgatccaag 600

aaacttccac agtcagtgaa ttga 624

<210> 5

<211> 624

<212> DNA

<213> 枣(Ziziphus jujuba)

<400> 5

atgcattcga tggggacgga attgaaactt cggatccgag actccacggc gcactgccgt 60

ctcaccaagc ttttgtctgc atttcacgtc gaaactcaac accaagagaa tttcttcttt 120

gacggtgcca acaacgagct gtcatcacaa caagtcgtgc tcttccttcg gttctacggt 180

gatgacaccc cacaatgctt catgtcactc aaagccaggg cagtcctgga cgagggtgtg 240

tacagggttg atgaggaggt ggaagagaat ttcgagccag cggttgggcg cgcctgtgtc 300

gcccaaccgg agaagctttc gtcggtggag tgtgggatat tgaagatgtt aaaggagaag 360

tttggggttc tcaactttgt ggggcttgga gggtttgtca atgtgaggga tgtgtacaag 420

tgggagggct tgaaattgga ggttgataag actctgtatg agtttgggac taatcatgag 480

attgagtgtg aaactagtga tcctgaagga gtcaagaagg tgcttgagga gttcttgaag 540

gagaatggga tccaatactc ttactcgcag gcctcaaagt ttgaggtttt tcgatccaag 600

aaacttccac agtcagtgaa ttga 624

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

atggaagtcg aagtcaagct 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

gatcggaaaa cagcgaattt g 21

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

atgcattcga tgggga 16

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

cattcactga ctgtgga 17

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 10

acgagctcgg gtacccatgc attcga 26

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 11

tggggactct agaggatccc cattcactga ctgtgga 37

Claims (4)

1.一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、克隆待验证的目的基因：提取枣组织器官的RNA，经反转录得到cDNA作为PCR扩增的模版，以待验证目的基因的序列信息设计引物A，进行PCR扩增，获得目的基因的DNA；

步骤2、重组过表达载体的构建：将步骤1克隆的目的基因整合至植物过表达载体pCG3301质粒中，构建植物重组过表达载体，并将所述植物重组过表达载体转入农杆菌GV3101中，获得携带重组质粒的农杆菌；

所述重组过表达载体的构建的具体的操作步骤为：

步骤2-1、酶切：植物过表达载体选择携带35S强启动子、GFP标签、卡那霉素抗性基因的质粒载体，采用使用限制性内切酶切断所述质粒载体，酶切位点位于GFP标签前，获得酶切后的质粒载体，备用；

步骤2-2、以目的基因的序列信息设计引物B，并以步骤1中获得的目的基因的DNA为模版，进行PCR扩增后，获得两端具有部分载体序列的目的基因；

步骤2-3、采用连接酶将步骤2-2获得的目的基因连接至步骤2-1获得的酶切后的质粒载体上，获得重组质粒；

步骤2-4、将步骤2-3获得的重组质粒转入DH5a感受态细胞后，富集培养，获得富集有重组质粒的菌液；

步骤2-5、提取步骤2-4获得的富集有重组质粒的菌液中的重组质粒，并将提取的重组质粒采用冻融转化法转入农杆菌GV3101中，获得携带重组质粒的农杆菌；

步骤3、注射侵染在体枣果实：以在体枣果实作为侵染靶目标，用步骤2获得的携带重组质粒的农杆菌进行注射侵染，并避光24h；

注射侵染在体枣果实的具体的操作步骤如下：

步骤3-1、将步骤2获得的携带重组质粒的农杆菌活化培养后，悬浮于渗透液中，并调整菌液浓度为OD600＝0.6～0.8，即得含有农杆菌的渗透液；

步骤3-2、注射侵染时，采用注射器，将步骤3-1获得的含有农杆菌的渗透液从半红期枣果实的果柄处缓慢注满果实，保证含有农杆菌的渗透液注射完全，然后用锡箔纸包裹注射果实所在的结果枝进行避光，24h后取下锡箔纸，即可；

步骤4、目的基因的功能验证：分别于注射前、注射后24h和注射后72h观察枣果实表观变化，并采集枣果实样品进行RNA提取，荧光定量PCR检测和相关生理指标的测定。

2.根据权利要求1所述的一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为未知序列，来源于枣全基因组数据库时，采用同源克隆的方法进行待验证的目的基因的克隆。

3.根据权利要求2所述的一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为未知序列，来源于枣全基因组数据库时，所述克隆待验证的目的基因的具体操作步骤如下：

步骤1-A、取冬枣半红时期果实，加入液氮研磨成粉后，提取枣果实RNA，并将得到的RNA反转录成cDNA，备用；

步骤1-B：目的基因的获得：根据NCBI中注释的若干植物的候选目的基因的共同保守序列设计同源克隆引物，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，获得特异条带，切胶回收后进行一代测序获得所述特异条带中候选基因的DNA序列；利用获得的所述候选基因的DNA序列的表达标签，搜索枣全基因组数据库，找到与所述候选基因的DNA序列高度同源的基因序列，即为目的基因；

步骤1-C、以所述枣全基因组数据库中记载的目的基因的序列信息设计引物A；

步骤1-D、PCR扩增：以步骤1-A获得的cDNA为模版，基于步骤1-C设计的引物A，进行PCR扩增；

步骤1-E、将步骤1-D进行PCR扩增后的体系溶液通过琼脂糖凝胶电泳，获得阳性条带，回收阳性条带的DNA，对回收的DNA进行测序验证，获得目的基因的DNA，并对目的基因的序列信息进行更正。

4.根据权利要求1所述的一种以在体枣果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，当步骤1中的待验证的目的基因的序列信息为已知序列时，所述克隆待验证的目的基因的具体操作步骤如下：

步骤1-a、取冬枣半红时期果实，加入液氮研磨成粉后，提取枣果实RNA，并将得到的RNA反转录成cDNA，备用；

步骤1-b：以所述目的基因的序列信息设计引物A；

步骤1-c、PCR扩增：以步骤1-a获得的cDNA为模版，基于步骤l-b设计的引物A，进行PCR扩增；

步骤1-E、将步骤1-c进行PCR扩增后的体系溶液通过琼脂糖凝胶电泳，获得阳性条带，回收阳性条带的DNA，对回收的DNA进行测序验证，获得目的基因的DNA。

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