CN115873087A - 木薯转录因子MebZIP34及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木薯转录因子MebZIP34及其应用，木薯转录因子MebZIP34的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的转录因子MebZIP34的基因的亚细胞定位均分别定位于细胞核和细胞质中，采用其片段构建沉默系统能够有效沉默目标基因，而且能够有效调控植株抗氧化酶基因的表达，调控植株体内H₂O₂含量和MDA含量。本发明为丰富育种基因资源以及创制耐采后生理变质的木薯品种奠定了良好的基础。

Description

木薯转录因子MebZIP34及其应用

技术领域

本发明涉及木薯生物技术领域，具体涉及一种木薯转录因子MebZIP34及其应用。

背景技术

木薯(Manihot esculenta Crantz，Cassava)是全球三大重要薯类作物之一，被誉为“淀粉之王”，也是我国热带和亚热带地区最重要的经济作物之一。木薯块根极不耐贮藏，采收后2-3天就会出现采后生理变质并迅速加剧，导致木薯无法长距离运输，销售区域局限，大量上市供应期短，采后综合利用压力大。因此，采后生理变质严重制约木薯产业的可持续发展。

已有研究表明，活性氧积累是木薯采后生理变质发生的根本原因之一。有效激活活性氧清除系统，控制木薯采后块根活性氧水平，则成为延缓木薯采后生理性变质的有效途径。

目前，常规延缓木薯采后生理变质的发生的方法有两种：

1.通过降低木薯块根储存空间的氧气含量，

2.在块根涂上石蜡等方法；

但这些方法的经济成本较高，且操作繁琐，无法大规模应用于实际生产。

研究表明：具有较高抗氧化剂含量(例如筛选富含β-胡萝卜素的品种或者通过转基因技术在木薯超表达抗氧化酶)的木薯块根能显著延缓发生采后生理变质的时间。

因此，鉴定参与活性氧清除系统的功能基因，能为后续创制耐采后生理变质的木薯品种奠定良好的基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种木薯转录因子MebZIP34及其在延缓采后腐烂上的应用。

为实现上述目的，本发明所设计一种木薯转录因子MebZIP34，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

编码上述木薯转录因子MebZIP34的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种重组载体pTRV2-MebZIP34，所述重组载体pTRV2-MebZIP34为含有上述的基因的载体pTRV2；

或者所述重组载体pTRV2-MebZIP34为含有上述的基因部分序列的载体pTRV2。

进一步地，所述含有上述的基因部分序列VIGS-MebZIP34的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

再进一步地，获得所述基因部分序列的引物对为：

Forward引物：ATGGGGAAAAGAAGTCGAGGG，

Reverse引物：GGTATGAAACGTCCATTACAGGAC。

本发明还提供了一种重组宿主菌，所述重组宿主菌为含有权利要求3所述重组载体pTRV2-MebZIP34的宿主菌。

本发明还提供了下述各项之一在调控木薯内活性氧清除系统中的应用；其中，

1)上述的木薯转录因子MebZIP34；

2)上述的基因；

3)上述的重组载体pTRV2-MebZIP34；

4)上述的重组宿主菌。

本发明还提供了下述各项之一在调控木薯采后腐烂中的应用；

其中，

1)上述的木薯转录因子MebZIP34；

2)上述的基因；

3)上述的重组载体pTRV2-MebZIP34；

4)上述的重组宿主菌。

本发明还提供了下述各项之一在培育木薯新品种中的应用；其中，

1)上述的木薯转录因子MebZIP34；

2)上述的基因；

3)上述的重组载体pTRV2-MebZIP34；

4)上述的重组宿主菌。

本发明的有益效果：

本发明的转录因子MebZIP34的基因的亚细胞定位均分别定位于细胞核和细胞质中，采用其片段构建沉默系统能够有效沉默目标基因，而且能够有效调控植株抗氧化酶基因的表达，调控植株体内H₂O₂含量和MDA含量。本发明为丰富育种基因资源以及创制耐采后腐烂的木薯品种奠定了良好的基础。

附图说明

图1为MebZIP34基因PCR电泳结果。其中，M：DL2000 marker，1：MebZIP34基因。

图2为转录因子MebZIP34亚细胞定位结果。

图3为利用酵母单杂技术鉴定转录因子MebZIP34下游调控的抗氧化酶MeMDAR1。

图4为利用VIGS技术瞬时沉默MebZIP34基因，15天后植株在氧化胁迫(浇灌10％过氧化氢液体)下的表型。其中，Mock：注射空载pTRV1+pTRV2的木薯植株；pTRV-MebZIP34：沉默MebZIP34的木薯植株。

图5为MebZIP34基因及其下游调控的MeMDAR1基因在pTRV-MebZIP34植株中的相对表达情况。

图6为pTRV-MebZIP34植株以及阴性对照植株中过氧化氢和丙二醛含量的测定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1木薯转录因子MebZIP34基因的获得

以木薯块根cDNA为模板，根据MebZIP34基因CDS序列设计引物(F1引物ATGGGAGTGCAGACAATGGG，R1引物GAATGGGGCAGATGTTGTTCTG)，通过PCR方法扩增获得目的基因(图1)。PCR反应体系为2×Taq Master Mix 12.5μl：cDNA 1μl，10μM引物F1μl，10μM引物R1μl，ddH₂O，9.5μl。其反应程序为：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，33个循环；72℃，10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化正确的片段并连接至pMD18-T载体上，然后转化大肠杆菌TOP10。

将菌液PCR鉴定为阳性的菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证；即得到木薯转录因子MebZIP34基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQID NO:2所示；具体如下：

MGVQTMGSQGDGSSDGKQSQFQSLARQNSMYSLTLDEVQNHLGDLGKPLSSMNLDELLKNVWTVEANHSMGAEVEGTQLANQTALQRQASLSLTGALSKKTVDEVWRDIQQNKNNGEKKSRERQPTLGEMTLEDFLVKAGVVAEASLEKKDGDPVLGVDTNIGPQFPQQQGQWMQYPHPQYQHPQQQMMGVYMPAQPMPQPLHVGAGPVMDVSYPENQVALPLPSPLMGTLSDVQTHARKRGTPEDMIEKTVERRQKRMIKNRESAARSRARKQAYTNELENKVSRLEEENERLRKRKQLENMLPCVPIPEPKYQLRRTTSAPF；

ATGGGAGTGCAGACAATGGGATCTCAAGGTGATGGTAGCAGTGATGGAAAACAGTCTCAGTTCCAGTCGCTGGCACGGCAAAACTCCATGTATAGTCTAACTCTGGATGAGGTTCAAAATCATTTAGGCGACCTTGGGAAGCCTTTGAGCAGCATGAACCTTGATGAACTGCTCAAGAATGTATGGACAGTTGAGGCTAACCATTCTATGGGTGCGGAAGTTGAGGGCACACAATTGGCCAATCAAACTGCTCTGCAGCGTCAGGCAAGCCTGTCATTGACTGGTGCTCTGAGCAAGAAGACTGTCGATGAGGTTTGGAGAGACATTCAACAAAATAAAAACAATGGGGAAAAGAAGTCGAGGGAACGGCAGCCTACCTTGGGAGAGATGACTTTAGAGGATTTCTTGGTTAAAGCTGGAGTTGTTGCTGAAGCATCCTTGGAGAAAAAGGATGGCGATCCTGTTCTTGGGGTAGATACAAATATAGGACCACAGTTCCCACAACAGCAAGGTCAATGGATGCAATACCCGCATCCGCAGTATCAGCATCCTCAACAACAGATGATGGGGGTATATATGCCAGCTCAGCCAATGCCACAGCCACTTCATGTGGGGGCCGGTCCTGTAATGGACGTTTCATACCCTGAGAATCAAGTGGCCTTACCTTTACCTTCACCTTTGATGGGAACATTATCGGATGTACAGACACATGCGAGAAAGCGAGGCACACCAGAGGATATGATAGAGAAGACTGTGGAGAGGAGGCAGAAGAGGATGATTAAGAATCGGGAATCTGCTGCCCGTTCACGGGCAAGAAAGCAGGCTTACACAAATGAGCTTGAGAACAAAGTTTCTCGGCTGGAAGAGGAAAATGAAAGGCTGAGGAAACGGAAGCAGCTGGAAAATATGTTGCCTTGTGTTCCTATTCCTGAACCAAAATATCAACTCCGCAGAACAACATCTGCCCCATTC；

同时以木薯转录因子MebZIP34回收产物为模板设计下述引物，

Forward引物：ATGGGGAAAAGAAGTCGAGGG，

Reverse引物：GGTATGAAACGTCCATTACAGGAC；

进行PCR扩增，测序；得到基因部分序列VIGS-MebZIP34，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，具体如下：

ATGGGGAAAAGAAGTCGAGGGAACGGCAGCCTACCTTGGGAGAGATGACTTTAGAGGATTTCTTGGTTAAAGCTGGAGTTGTTGCTGAAGCATCCTTGGAGAAAAAGGATGGCGATCCTGTTCTTGGGGTAGATACAAATATAGGACCACAGTTCCCACAACAGCAAGGTCAATGGATGCAATACCCGCATCCGCAGTATCAGCATCCTCAACAACAGATGATGGGGGTATATATGCCAGCTCAGCCAATGCCACAGCCACTTCATGTGGGGGCCGGTCCTGTAATGGACGTTTCATACC。

实施例2木薯转录因子MebZIP34的亚细胞定位

以此前MebZIP34的回收产物为模板，设计同源重组引物(F2引物agtggtctctgtccagtcctATGGGAGTGCAGACAATGGGAT，R2引物ggtctcagcagaccacaagtGAATGGGGCAGATGTTGTTCTG，其中小写字母为接头序列，大写字母为基因引物)对MebZIP34进行PCR扩增，利用NimbleCloning试剂盒将回收后的PCR产物与亚细胞定位载体pNC-Green-SubC进行连接并转化大肠杆菌TOP10，测序正确后扩繁提取质粒，通过冻融法转化至农杆菌GV3101(PSoup+P19)中，注射烟草叶片。48h后用FluoViewTM FV1000激光共聚焦显微镜观察烟草叶片中荧光蛋白的分布情况。

结果显示：MebZIP34在细胞核和细胞质中均有表达(图2)。

实施例3木薯转录因子MebZIP34下游调控抗氧化酶的鉴定

以此前MebZIP34的回收产物为模板，设计同源重组引物(F3引物gccatggaggccagtgaattcATGGGAGTGCAGACAATGGG，R3引物cagctcgagctcgatggatccGAATGGGGCAGATGTTGTTCTG，其中小写字母为接头序列，大写字母为基因引物)对MebZIP34进行PCR扩增、回收；以木薯块根基因组DNA为模板，设计同源重组引物(F4引物gactcactatagggcgaattcTTGAACCTGGTTAAGGTGTCCAG，R4引物ataatgccaggaattactagtTGCGCGTCCTGTAACTGAAA，其中小写字母为接头序列，大写字母为启动子引物)对抗氧化酶基因MeMDAR1上游启动子序列进行PCR扩增、回收。根据ClonExpressII One Step Cloning Kit试剂盒(诺唯赞)说明书进行将MebZIP34连接到PGADT7载体、MeMDAR1启动子连接到pHIS2.1载体，随后转化大肠杆菌TOP10，测序正确后扩繁提取质粒。按照Matchmaker One-Hybrid Library Construction&Screening Kit(Clontech)的操作说明，将质粒转化至酵母感受态Y187中，鉴定互作关系。

结果显示：MebZIP34与MeMDAR1启动子互作，表明MebZIP34可能通过调控抗氧化酶的表达进而延缓木薯块根采后腐烂的发生(图3)。

实施例4病毒诱导基因沉默(VIGS)及RT-qPCR验证

通过VIGS-Tool在线软件筛选300bp MebZIP34的特异性片段，如SEQ ID NO：3所示。设计特异性引物(F5引物gtgagtaaggttaccgaattcATGGGGAAAAGAAGTCGAGGG，R5引物cgtgagctcggtaccggatccGGTATGAAACGTCCATTACAGGAC，其中小写字母为接头序列，大写字母为基因引物)对目的序列进行PCR扩增、回收。根据ClonExpressII One Step Cloning Kit试剂盒(诺唯赞)说明书进行将目的片段分别连接到pTRV2载体并转化大肠杆菌TOP10，测序正确后扩繁提取质粒，通过冻融法转化至农杆菌GV3101中。挑选阳性单克隆在28℃培养至菌液OD600值达到0.8左右，5000rpm离心收集菌体，随后用MMA液体(10mM MES、10mM MgCl2和20mM乙酰丁香酮)重悬，避光静置2-3小时。使用注射器将菌液注入木薯叶片背面后，将植株置于26℃的培养室生长。14天后，对植株浇灌10％过氧化氢溶液模拟氧化胁迫，3天后观察植株表型。

结果表明：沉默MebZIP34植株(转染pTRV2-MebZIP34)对氧化胁迫表现出更高的敏感性，叶片几乎掉光；阴性对照则表现出较好的耐受性，仅有部分叶片发黄(图4)。

为了验证目的基因的沉默效果，取植株最顶上的三片叶子提取RNA，经反转录为cDNA后进行荧光定量PCR，以MeEF1为内参(F6引物TGAACCACCCTGGTCAGATTGGAA，R6引物AACTTGGGCTCCTTCTCAAGCTCT)，根据特异性引物检测MebZIP34(F7引物CCGGTCCTGTAATGGACGTT，R7引物TCGCTTTCTCGCATGTGTCT)和MeMDAR1(F8引物TCGGTGTTCTTTGGGGACAG，R8引物TGCTCCAACAACCTTTCCGT)的相对表达量。具体反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μl，10μM引物F1μl，10μM引物R1μl，cDNA 1μl，ddH₂O 7μl。其反应程序为：95℃，3min；95℃，10s，56℃，30s，72℃，30s，40个循环。每个样品均包含三个生物学重复。

结果表明：MebZIP34及其下游调控的MeMDAR1的表达均被显著沉默(图5)。

实施例5沉默植株叶片过氧化氢及丙二醛含量测定

取沉默植株顶端的三片叶子，经液氮速冻后研磨至粉状，称取0.1g粉末，加入0.9ml预冷(4-8℃)的生理盐水，随后根据过氧化氢测定试剂盒以及丙二醛测定试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)说明书进行这两种生理指标的测定。

结果显示：在氧化胁迫处理前，沉默植株中过氧化氢以及丙二醛的含量与对照相差不大；而经过氧化胁迫处理后，沉默植株中过氧化氢以及丙二醛的含量大幅提升，且显著高于对照。上述结果表明MebZIP34可能通过调控抗氧化酶基因MeMDAR1的表达进而影响植株体内过氧化氢及丙二醛的含量(图6)。

由上可知：本发明的转录因子MebZIP34定位于细胞核和细胞质中，采用其片段构建VIGS载体能够有效沉默目标基因，而且能够有效调控抗氧化酶基因的表达，进而调控植株体内过氧化氢以及丙二醛含量；为后续解析木薯采后生理变质的分子机制奠定基础；为后续创制采后生理变质显著延缓的木薯材料提供重要基因资源。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种木薯转录因子MebZIP34，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码木薯转录因子MebZIP34的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组载体pTRV2-MebZIP34，其特征在于：所述重组载体pTRV2-MebZIP34为含有权利要求2所述的基因的载体pTRV2；

或者所述重组载体pTRV2-MebZIP34为含有权利要求2所述的基因部分序列的载体pTRV2。

4.根据权利要求3所述重组载体pTRV2-MebZIP34，其特征在于：所述含有权利要求2所述的基因部分序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求4所述重组载体pTRV2-MebZIP34，其特征在于：获得所述基因部分序列的引物对为：

Forward引物：ATGGGGAAAAGAAGTCGAGGG，

Reverse引物：GGTATGAAACGTCCATTACAGGAC。

6.一种重组宿主菌，其特征在于：所述重组宿主菌为含有权利要求3所述重组载体pTRV2-MebZIP34的宿主菌。

7.下述各项之一在调控木薯内活性氧清除系统中的应用；其特征在于：

1)权利要求1所述的木薯转录因子MebZIP34；

2)权利要求2所述的基因；

3)权利要求3所述的重组载体pTRV2-MebZIP34；

4)权利要求6所述的重组宿主菌。

8.下述各项之一在调控木薯采后生理变质中的应用；其特征在于：

1)权利要求1所述的木薯转录因子MebZIP34；

2)权利要求2所述的基因；

3)权利要求3所述的重组载体pTRV2-MebZIP34；

4)权利要求6述的重组宿主菌。

9.下述各项之一在培育木薯新品种中的应用；其特征在于：

1)权利要求1所述的木薯转录因子MebZIP34；

2)权利要求2所述的基因；

3)权利要求3所述的重组载体pTRV2-MebZIP34；

4)权利要求6述的重组宿主菌。

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