CN111560056B - 小麦抗条锈病相关蛋白TaERF8及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦抗条锈病相关蛋白TaERF8及其编码基因与应用。本发明公开的小麦抗条锈病相关蛋白为A1)或A2)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白质具有相同功能的蛋白质。实验证明，将本发明的抗条锈病相关蛋白的编码基因干涉后可以提高植物对条锈病的抗病性。本发明抗条锈病相关蛋白及其基因对培育抗条锈病植物具有重要的意义，适合于推广应用。

Description

小麦抗条锈病相关蛋白TaERF8及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及小麦抗条锈病相关蛋白TaERF8及其编码基因与应用。

背景技术

小麦是一种禾本科谷物，其为世界上仅次于水稻的第二大粮食作物。我国是世界上小麦生产与消费大国,常年种植面积为2400万公顷左右,年产量近1.3亿吨。小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp tritici)引起的一种世界性气传病害，也是我国发生范围最广、危害程度最重的麦类病害之一，一般减产20％～30％，最严重时几乎颗粒无收。选育抗病品种才是防治小麦条锈病最经济、安全、有效的方法。当前，通过基因工程育种获得具有抗病性的作物品种是一种行之有效的方法。而该方法中最关键的技术瓶颈问题是有效抗病基因的筛选与功能发现。

转录水平的调控是基因表达调控最关键的步骤，转录因子在内源激素和外源刺激的信号传导过程中发挥重要的作用，参与许多基因在不同条件下、不同时期表达调控，它们在植物的生长、发育以及对外界的各种生物和非生物因子的胁迫作出应答中起关键调控作用，因而转录因子成为人们研究的重点领域之一。转录因子在真核生物的发育、适应逆境因子等过程中起着非常重要的作用，而转录因子本身的表达也受到各种方式的调控。植物各种诱导型基因的表达主要受相应特定转录因子在转录水平上调控，这种转录水平上的调控在植物防卫和抗逆反应中起非常重要的作用。

AP2/ERF8是植物中特有的一个大的转录因子家族,因具有约58个氨基酸残基组成的AP2结构域而得名。根据含有的AP2结构域的数量及其氨基酸序列的特异性,将AP2/ERF8超家族分类为AP2、ERF8、DREB、RAV亚家族和其它成员，其中ERF8结构域是只含有AP2/ERF8结构域。ERF8转录因子是AP2/ERF8转录因子的一个亚家族，最初由Ohme-Takagi和Shinshi在1995年从烟草中分离得到。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦抗条锈病相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的抗条锈病相关蛋白来源于普通小麦(Triticum aestivm L.)，为如下A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白质具有相同功能的蛋白质。

序列表中序列2由243个氨基酸残基组成。

为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A1)或A2)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第1-732位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述抗条锈病相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

优选的，所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)：

1)编码序列是序列表中序列1的第1-732位的cDNA分子或DNA分子；

2)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述抗条锈病相关蛋白的cDNA分子或DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述抗条锈病相关蛋白的cDNA分子或DNA分子。

上述抗条锈病相关蛋白在调控植物抗病性中的应用，也属于本发明的保护范围。

与所述抗条锈病相关蛋白相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用，也属于本发明的保护范围；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码所述抗条锈病相关蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)抑制所述抗条锈病相关蛋白编码基因表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下1)或2)或3)或4)：

1)编码序列是序列表中序列1的第1-732位的cDNA分子或DNA分子；

2)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述抗条锈病相关蛋白的cDNA分子或DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗条锈病相关蛋白的cDNA分子或DNA分子。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

B8)所述核酸分子具体可为与序列表中序列1的第1-732位核苷酸所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子，如与序列表中序列1的390-529位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子。

B9)所述重组载体可为pCaBS-γ-TaERF8-VIGS，所述pCaBS-γ-TaERF8-VIGS为利用限制性内切酶在pCaBS-γ载体的多克隆位点中反向插入序列表中序列1的第390-529位所示的DNA片段得到的重组载体。所述限制性内切酶可为ApaI。

所述微生物具体可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为农杆菌，如农杆菌EHA105。

B9)所述重组微生物可将所述pCaBS-γ-TaERF8-VIGS导入所述微生物中得到。

所述转基因细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括植物的繁殖材料。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦，如小麦丰产3号。

所述抗病性可为条锈病抗性。所述条锈病可为由小麦条锈菌引发的病害，如条锈菌生理小种CYR32引发的病害。

本发明还提供了培育抗病性转基因植物的方法，所述方法包括：抑制目的植物中所述抗条锈病相关蛋白的编码基因的表达得到抗病性高于所述目的植物的感病性转基因植物。

所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦，如小麦丰产3号。

所述降低目的植物中所述抗条锈病相关蛋白的编码基因的表达是通过将与序列表中序列1的第390-529位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。

与序列表中序列1的第390-529位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子通过BMSV病毒导入所述目的植物中。

所述抗病性为条锈病抗性。所述条锈病可为由小麦条锈菌引发的病害，如条锈菌生理小种CYR32引发的病害。

实验证明，将本发明的抗条锈病相关蛋白的编码基因干涉(即抑制基因的表达)后可以提高了植物对条锈病的抗病性，如条锈病的条锈菌孢子堆固定长度的数量减少，可获得对条锈病抗性提高的转基因植株，以作为筛选的防止植物条锈病药物的模型植物。因此，本发明抗条锈病相关蛋白及其基因对培育抗条锈病植物具有重要的意义，适合于推广应用。

附图说明

图1为病毒介导基因沉默小麦的抗条锈病鉴定结果。包括3种植株：未接种病毒(Mock，即空白对照)、接种空载体病毒(BSMV)和接种干涉片段插入到病毒序列的重组病毒(BSMV-TaERF8)。A为接种亲和条锈菌生理小种CYR3218d后的2cm叶片的孢子堆数目；B为接种亲和条锈菌生理小种CYR32 18d时的表型观察。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

Taichung29*6/Yr5：记载在文献“徐世昌,吴立人,万安民,王凤乐,赵文生,牛永春.以Taichung29为背景的小麦抗条锈病近等基因系转育进展[J].植物保护,2004，30(02):19-22.”中。

下述实施例中的pCaBS-γ载体为文献“Yuan,C.,C.Li,L.Yan,A.O.Jackson,Z.Liu,C.Han,J.Yu and D.Li(2011).A high throughput barley stripe mosaic virusvector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.PLoS One 6(10):e26468”中pCa-γbLIC的载体。

pCaBS-α载体：记载在文献“Yuan,C.,C.Li,L.Yan,A.O.Jackson,Z.Liu,C.Han,J.Yu and D.Li(2011).A high throughput barley stripe mosaic virus vector forvirus induced gene silencing in monocots and dicots.PLoS One 6(10):e26468”中。

pCaBS-β载体：记载在文献“Yuan,C.,C.Li,L.Yan,A.O.Jackson,Z.Liu,C.Han,J.Yu and D.Li(2011).A high throughput barley stripe mosaic virus vector forvirus induced gene silencing in monocots and dicots.PLoS One 6(10):e26468”中。

本生烟：记载在文献“Yuan,C.,C.Li,L.Yan,A.O.Jackson,Z.Liu,C.Han,J.Yu andD.Li(2011).A high throughput barley stripe mosaic virus vector for virusinduced gene silencing in monocots and dicots.PLoS One 6(10):e26468”中。

小麦条锈菌为条锈菌生理小种CYR32，记载在文献“万安民,吴立人,金社林,姚革,王保通.中国小麦条锈菌条中32号的命名及其特性[J].植物保护学报,2003，30(04):347-352”中。

小麦丰产3号：记载在文献“淦爱华,蔺瑞明,徐世昌,万安民,马占鸿.中国小麦条锈菌鉴别寄主丰产3号抗条锈性遗传分析[J].植物保护学报,2006，33(04):369-373”。

实施例1、小麦中抗条锈病相关蛋白TaERF8可以调控小麦对条锈病的抗性

本实施例提供了一种来源于小麦抗条锈病近等基因系Taichung29*6/Yr5的抗条锈病相关蛋白(名称为TaERF8)，其序列为序列表中序列2，在小麦抗条锈病近等基因系Taichung29*6/Yr5中，TaERF8基因的CDS序列为序列表中序列1，序列1的第1-732位编码TaERF8蛋白质。

基因干涉载体的构建：

以小麦抗条锈病近等基因系Taichung29*6/Yr5的cDNA为模板，使用引物VIGS-TaERF8-F1/VIGS-TaERF8-R1进行PCR扩增，回收纯化得到目的片段TaERF8-VIGS；将目的片段TaERF8-VIGS利用ApaI限制性内切酶进行酶切，回收得到TaERF8-VIGS酶切产物。利用ApaI限制性内切酶将pCaBS-γ载体线性化，回收纯化得到载体骨架。将10ng的载体骨架和100ng TaERF8-VIGS酶切产物混合均匀，利用T4 DNA聚合酶进行连接反应，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。提取阳性克隆中对的重组载体，将序列正确的重组载体记为pCaBS-γ-TaERF8-VIGS。pCaBS-γ-TaERF8-VIGS为利用ApaI限制性内切酶在pCaBS-γ载体中反向插入序列表中序列1的第390-529位所示的DNA片段得到的重组载体。所用引物序列如下：

VIGS-TaERF8-F1：5’-AAGGAAGTTTAAGTACGATACGGCGGAGGAG-3’(斜体为接头序列)；

VIGS-TaERF8-R1：5’-AACCACCACCACCGTTAGAGTCCAAGGTGCTGTTGC-3(斜体为接头序列)。

小麦接种病毒进行基因干涉：

将pCaBS-α载体、pCaBS-β载体、pCaBS-γ载体、pCaBS-γ-TaERF8-VIGS载体分别导入EHA105农杆菌细胞中，将得到的重组菌分别记为EHA105/pCaBS-α、EHA105/pCaBS-β、EHA105/pCaBS-γ和EHA105/pCaBS-γ-TaERF8-VIGS。

将EHA105/pCaBS-α、EHA105/pCaBS-β和EHA105/pCaBS-γ-TaERF8-VIGS等浓度混合后注射生长良好的本生烟，本生烟过渡寄主，建立BSMV介导的基因干涉小麦系统。注射7-10天后，分别取本生烟注射叶和注射叶片上位叶1-2片，每克加入3mL 50mM PB(pH7.0)和少许纯化的硅藻土，研磨，蘸取汁液接种小麦丰产3号。接种后7天观察病毒症状。将EHA105/pCaBS-α、EHA105/pCaBS-β和EHA105/pCaBS-γ-TaERF8-VIGS得到的病毒记为BSMV-TaERF8。

按照上述方法，将EHA105/pCaBS-γ-TaERF8-VIGS替换为EHA105/pCaBS-γ，其他步骤均不变，进行实验，作为对照。将EHA105/pCaBS-α、EHA105/pCaBS-β和EHA105/pCaBS-γ得到的病毒记为BSMV。

按照上述方法，将未注射菌的本生烟接种小麦作为空白对照。

基因干涉植株抗条锈病鉴定：

接种BSMV和BSMV-TaERF8以及空白对照的小麦材料在接种小麦14天后，利用“喷接法”接种亲和的小麦条锈菌，每种小麦的接种量均相等。接种后10±1℃黑暗保湿24h，然后转入培养箱内(22-24℃)潜育培养，直至发病产生夏孢子，观察潜育期、统计条锈病孢子堆密度和大小。

基因干涉后TaERF8基因的表达水平检测：接种条锈菌8天小麦叶片取样，利用TRIZOL提取小麦总RNA，以MMLV反转录试剂盒合成第一链cDNA采用实时定量PCR(Real-timeQuantitative PCR,qRT-PCR)方法检测TaERF8基因的表达水平。以组成型表达的基因为内参，设计了qRT-PCR的引物。内参基因为小麦ADP-RF(ADP-RIBOSYLATION FACTOR,Ta54227物序列为TaADP-RF1：5’-GCTCTCCAACAACATTGCCAAC-3’，TaADP-RF2：5’-GCTTCTGCCTGTCACATACGC-3’。TaTaERF874基因的引物序列为TaERF811-3Bf:5’-GGTTACCCGGTGGCATC-3’,TaERF811-3Br:5’-ATCCAGATCAAACGTGACCG-3’。

实验设3次重复，结果取平均数。结果显示，接种BSMV-TaERF8的小麦材料中TaERF8基因的相对表达量均显著低于接种BSMV以及空白对照的小麦材料。

干涉植株对小麦条锈病的抗病性测定结果如图1所示。接种BSMV-TaERF8的小麦材料接种条锈菌后12d孢子堆破裂、可见，潜育期比接种BSMV的小麦材料和空白对照均显著缩短；接菌后16d，三种小麦材料间的孢子堆密度出现显著差异，但接种BSMV-TaERF8的小麦材料的孢子堆的长度和数量均显著低于接种BSMV的小麦材料和空白对照，说明其条锈菌的严重度比接种BSMV的小麦材料和空白对照更低。表明，TaERF8基因的表达受到抑制后显著提高了小麦的条锈病抗性，TaERF8及其编码基因可以调控小麦的条锈病抗性。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 小麦抗条锈病相关蛋白TaERF8及其编码基因与应用

<130> WHOI201019

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 732

<212> DNA

<213> 普通小麦（Triticium aestivum L.）

<400> 1

atggcgccta gagcggcgga gaaggcgcct gtctccccgc ccaccaggct cggccttggc 60

gttggcggcg gggtcggagt cgtcgccggt ggcgcgcact acaggggcgt ccggaagcgc 120

ccatggggac gttacgccgc ggagatccgt gacccggcca agaagagcag ggtctggctc 180

ggcacgtacg atacggcgga ggaggccgcg cgcgcctacg acaccgccgc gcgcgagttc 240

cgcggcgcca aggcgaaaac taacttcccg ttcccttcgt cgtcgtcgtc gtcccctgtc 300

gccggcggcg gcagcccgag cagcaacagc accttggact ctagcggggg agggagcggc 360

ggctgcgccc aggcgcccat gcaggccatc ccgctgccgc ccgccctcga cctggacctc 420

ttccaccgcg cggcggccgt gacggccgtc gccggcggcg gcatgcgctt cccgttcaac 480

ggttacccgg tggcatcgcg ccagcctctg cacccgtact tcttctacga acaggccgcg 540

gccgccgcgg cggcggcgtc ggggtatcgc gcgctgaagg tggcgcagcc ggtcaccgtg 600

gcggccgttg cccagagcga ctccgactcc tcgtcggtcg ttgatctgtc cccgtcgccc 660

cccgcggtga cagcgcataa ggcggtcacg tttgatctgg atctgaacgg gccgccgcct 720

tcggaggact ag 732

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> 普通小麦（Triticium aestivum L.）

<400> 2

Met Ala Pro Arg Ala Ala Glu Lys Ala Pro Val Ser Pro Pro Thr Arg

1 5 10 15

Leu Gly Leu Gly Val Gly Gly Gly Val Gly Val Val Ala Gly Gly Ala

20 25 30

His Tyr Arg Gly Val Arg Lys Arg Pro Trp Gly Arg Tyr Ala Ala Glu

35 40 45

Ile Arg Asp Pro Ala Lys Lys Ser Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr Asp

50 55 60

Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Ala Arg Glu Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ala Lys Ala Lys Thr Asn Phe Pro Phe Pro Ser Ser Ser Ser

85 90 95

Ser Ser Pro Val Ala Gly Gly Gly Ser Pro Ser Ser Asn Ser Thr Leu

100 105 110

Asp Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Cys Ala Gln Ala Pro Met Gln

115 120 125

Ala Ile Pro Leu Pro Pro Ala Leu Asp Leu Asp Leu Phe His Arg Ala

130 135 140

Ala Ala Val Thr Ala Val Ala Gly Gly Gly Met Arg Phe Pro Phe Asn

145 150 155 160

Gly Tyr Pro Val Ala Ser Arg Gln Pro Leu His Pro Tyr Phe Phe Tyr

165 170 175

Glu Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Tyr Arg Ala Leu

180 185 190

Lys Val Ala Gln Pro Val Thr Val Ala Ala Val Ala Gln Ser Asp Ser

195 200 205

Asp Ser Ser Ser Val Val Asp Leu Ser Pro Ser Pro Pro Ala Val Thr

210 215 220

Ala His Lys Ala Val Thr Phe Asp Leu Asp Leu Asn Gly Pro Pro Pro

225 230 235 240

Ser Glu Asp

Claims (5)

1.抗条锈病相关蛋白在调控小麦条锈病抗病性中的应用；所述抗条锈病相关蛋白，为氨基酸序列是SEQ ID NO.2的蛋白质。

2.抗条锈病相关蛋白的编码基因在调控小麦条锈病抗病性中的应用；所述编码基因为如下1）或2）：

1）编码序列是SEQ ID NO.1的第1-732位的cDNA分子或DNA分子；

2）SEQ ID NO.1所示的cDNA分子或DNA分子。

3.抗条锈病相关蛋白相关的生物材料在调控小麦条锈病抗病性中的应用；所述生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：

B1）编码权利要求1中所述抗条锈病相关蛋白的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；

B7）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官；

B8）抑制权利要求1中所述抗条锈病相关蛋白编码基因表达的核酸分子；

B9）含有B8）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；

所述抗病性为条锈病抗性。

4.培育抗病性转基因小麦的方法，包括：抑制目的小麦中权利要求1中所述抗条锈病相关蛋白的编码基因的表达得到抗病性高于所述目的小麦的感病性转基因小麦；所述抗病性为条锈病抗性；所述条锈病为由小麦条锈菌引发的病害。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：降低目的植物中权利要求1中所述抗条锈病相关蛋白的编码基因的表达是通过将与序列表中序列1的第735-913位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的小麦实现的。

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