CN104744578B

CN104744578B - 一种与植物耐逆性相关蛋白及其编码基因ScMYB3R1与应用

Info

Publication number: CN104744578B
Application number: CN201510055516.0A
Authority: CN
Inventors: 曹新有; 刘建军; 程敦公; 王灿国; 刘爱峰; 李豪圣; 宋健民; 刘成; 孙正娟; 赵振东
Original assignee: CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2018-03-02
Anticipated expiration: 2035-02-03
Also published as: CN104744578A

Abstract

本发明公开了一种与植物耐逆性相关蛋白及其编码基因ScMYB3R1与应用。该蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且能提高植物耐逆性相关的蛋白质。本发明通过实验证明，本发明提供的蛋白具有提高植物抗逆性的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。

Description

一种与植物耐逆性相关蛋白及其编码基因ScMYB3R1与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物耐逆性相关蛋白及其编码基因ScMYB3R1与应用。

背景技术

温度是植物生长重要的环境因子之一，其限制植物的分布、生长和产量。当外界环境温度降低到一定程度时，植物体就会受到伤害，甚至死亡。植物在低温胁迫条件下，会自然产生一系列生理生化反应，诱导一系列相关基因的表达。不同植物对低温的反应不同，一些植物表现为原有蛋白质表达水平的增加，一些植物则产生低温诱导蛋白。

低温胁迫诱导基因的表达产物按其作用可分成两大类。一类是保护基因，直接保护细胞免受环境胁迫伤害的具有编码功能蛋白的基因，如LEA蛋白、渗调蛋白、抗冻蛋白、水通道蛋白、伴侣蛋白、脂肪酸去饱和酶和脂肪迁移蛋白等功能蛋白，为各种渗透保护剂的生物合成所需的酶以及清除活性氧自由基；另一类则是调控基因，编码调节蛋白的基因，包括转录因子(如bZIP转录因子、MYC转录因子、MYB转录因子及DREB转录因子等)、蛋白激酶和与磷酸肌醇代谢有关的酶等，它们在调控基因表达、感应和转导胁迫信号中起重要作用。

黑麦属(Secale cereale L.)属于禾本科小麦族小麦亚族，具有抗逆性强、抗病性强、根系发达、分蘖能力强等特性，是改良作物抗逆性和抗病性的重要基因资源，也是目前用于小麦遗传改良最成功的物种之一。而目前对黑麦特性的研究则主要集中在表型鉴定、图谱构建及基因定位上，对黑麦优良基因的克隆及功能研究相对较少，因此对黑麦优良基因的深入挖掘与应用，对提高植物的抗逆性具有重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质。

为了使上述a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种：

B1)编码上述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒或含有B2)所述表达盒的重组质粒；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子的为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述严格条件可为如下：在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa₃PO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为在50℃，在7％SDS、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为在50℃，7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为在50℃，7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为在50℃，7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为在65℃，6×SSC，0.5％SDS的溶液中中杂交，在2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述生物材料中，B6)所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。

上述生物材料中，所述重组载体可用现有的植物表达载体构建；所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。本发明的重组载体具体为在pBI121载体的Sma I和Spe I位点间插入如序列表中序列表1所示的ScMYB3R1得到的重组载体。

上述蛋白质或上述相关生物材料在提高植物耐逆性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述耐逆性为耐低温胁迫。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。

本发明最后一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的培育转基因植物的方法包括如下步骤：向出发植物中导入上述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物耐逆性高于所述出发植物。

上述方法中，所述蛋白质的编码基因序列如序列表中序列1所示。

上述方法中，所述转基因植物耐逆性高于所述出发植物体现在提高存活率和/或降低相对导电率。

上述方法中，所述耐逆性为耐低温胁迫；所述低温为-10℃。

上述方法中，所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。

本发明的实验证明：本发明发现了新蛋白ScMYB3R1，将其编码基因导入拟南芥中得到的转ScMYB3R1拟南芥，在低温处理后，转ScMYB3R1拟南芥植株的存活率明显高于野生型拟南芥植株与转空载的拟南芥植株，并且相对电导率低于野生型拟南芥植株与转空载的拟南芥植株，表明蛋白ScMYB3R1具有抵御低温胁迫的作用，为改良作物的抗逆性提供新的基因资源。

附图说明

图1为ScMTB3R1在低温处理不同时间段的表达情况。

图2为T₃代的转ScMTB3R1拟南芥植株的PCR检测。从左至右分别为:1：T-1；2：T-2；3：T-3；4：T-4；5：T-5；6：T-6；7：H₂O；8：T-7；M：DL2000marker；9：T-8；10：T-9；11：T-10；12：野生型拟南芥(Columbia0)植株；13：T-11；14：转入pBI121空载体的拟南芥植株。其中，T-1、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T-7、T-8、T-9、T-10和T-11为T₃代的转ScMTB3R1拟南芥植株。

图3为低温处理后T₃代的转ScMTB3R1拟南芥的生长情况、存活率及相对电导率。图3A为野生型拟南芥植株与转ScMTB3R1拟南芥植株低温处理后的表型；图3B为低温处理后，野生型拟南芥植株与转ScMTB3R1拟南芥植株存活率的统计，结果为三次重复的平均值；图3C为低温处理前后，野生型拟南芥植株与转ScMTB3R1拟南芥植株的相对电导率，结果为三次重复的平均值。其中，WT为野生型拟南芥植株；T-2、T-9和T-11为T₃代的转ScMTB3R1拟南芥植株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

黑麦(Secale cereale)AR132在文献“陈雪燕，曹新有，张羽.ScMYB原核蛋白诱导表达的影响因素研究.安徽农业科学.2012.40(3):1307-1308,1317”中公开过，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得。

pBI121载体为Biovector CO.,LTD公司产品，产品目录号为Biovector pBI121。

农杆菌C58C1为Biovector CO.,LTD公司产品，产品目录号为Biovector009。

实施例1、ScMTB3R1的获得

一、ScMTB3R1的获得

1、将生长2周的黑麦AR132的幼苗在4℃冰箱处理5h，得到处理后的幼苗；提取处理后的幼苗的总RNA，按宝生物cDNA Library Construction Kit说明书构建cDNA文库；用12％琼脂糖胶电泳检测，回收并纯化。

2、将纯化的cDNA和NTT载体连接，转化E.coli菌株DH5α，把长出来的大肠杆菌菌落全部收集起来，提取混合质粒转化酵母EGY48，涂营养缺陷平板(SD/His2/Leu2)，30℃培养2～4d，利用NTT筛选核定位蛋白。

3、从筛选出来的酵母克隆中提取酵母质粒，并转化大肠杆菌，经测序后获得一批克隆，其中一个蛋白含有MYB结构域，将该蛋白在NCBI进行比对，发现为一类新的MYB类基因，命名为ScMYB3R1。通过RACE的方法，获得ScMYB1基因编码区的全长，该基因编码区的大小为1815bp(如序列表中序列1所示)；该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

二、ScMTB3R1在低温条件下的表达分析

1、植物材料的处理

将黑麦AR132种子用双氧水浸泡1min，然后无菌水洗3次，每次洗1min，点播于装有蛭石的营养盆中。浇透水，放于人工培养箱中。待黑麦生长2周后，挑选大小一致的小苗放入4℃冰箱，进行低温处理，处理时间分别设为0h、1h、2h、5h、12h和24h。

2、黑麦总RNA的提取

将步骤1中处理过的黑麦用TRNzol法提取总RNA，所提取的RNA经2％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，用M-MLV反转录酶(TaKaRa公司)对总RNA进行反转录获得cDNA，-20℃保存备用。

3、RT-PCR检测ScMTB3R1的表达

以步骤2中的cDNA为模板，采用引物ScMYB3R1-F和ScMYB3R1-R进行实时荧光定量PCR扩增。

实时荧光定量PCR采用比较CT法(ΔΔCT)计算基因表达量，以Actin基因为内参，引物为FC和RC，以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和技术重复，数据取3次重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2^-ΔΔCT＝2^{-(ΔCT处理-ΔCT对照)}＝2^{-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]}。上述引物的序列(5’-3’)如下：

ScMYB3R1-F:5'-TGGTGAACCGAACACTGACA-3'；

ScMYB3R1-R:5'-AGAACCACAAGTGCCCAATC-3'；

Act-F:5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；

Act-R:5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。

结果如图1所示：ScMTB3R1受低温诱导表达，且在低温胁迫诱导1h时，ScMTB3R1的表达量最大。

实施例2、转ScMTB3R1拟南芥的获得及其功能分析

一、重组表达载体的构建

1、RNA的提取

以苗期黑麦AR132为实验材料，用TRNzol法提取总RNA，检测合格的RNA用TaKaRa公司的反转录试剂盒反转录为cDNA，-20℃保存备用。

2、PCR扩增

以上述获得的cDNA为模板，采用引物ScMYB3R1-F2和ScMYB3R1-R2进行PCR扩增，得到目的基因ScMYB3R1。引物序列如下所示：ScMYB3R1-F2：5’-TCCCCCGGGATGGGGGCCATGGCGGAGG-3’(下划线部分为Sma I的识别位点)；

ScMYB3R1-R2：5’-GGACTAGTTTAGGTTACATCCATGTTTGTCG-3’(下划线部分为Spe I的识别位点)。

PCR反应体系：2×GC Buffer 25μl，dNTP Mix 4μl，上下游引物各1μl，primerstar0.3μl，ddH₂O 16.7μl，模板cDNA 2μl(以上PCR反应试剂均来自于TaKaRa公司PCR扩增试剂盒)。

PCR扩增程序：94℃预变性10min；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸1min，40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

3、电泳及纯化

将步骤2获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到大小为1815bp的PCR扩增产物，即为目的基因ScMYB3R1；用TaKaRa公司的DNA凝胶回收试剂盒回收纯化目的基因ScMYB3R1。

4、重组载体的获得

用限制性内切酶Sma I和Spe I对步骤3中目的基因ScMYB3R1和pBI121载体进行双酶切，连接，得到重组载体pBI121-ScMYB3R1。

对重组载体pBI121-ScMYB3R1进行测序验证，结果表明：重组载体pBI121-ScMYB3R1为将pBI121载体的Sma I和Spe I酶切位点间的DNA替换为序列表中序列1所示的ScMTB3R1，保持pBI121载体的其他序列不变得到的重组载体，表达ScMTB3R1编码的蛋白。

二、转ScMTB3R1拟南芥的获得及鉴定

采用冻融法将上述获得的重组表达载体pBI121-ScMYB3R1转化农杆菌C58C1，得到重组菌。以转pBI121空载体为对照。

用引物ScMYB3R1-F2和ScMYB3R1-R2对获得的重组菌进行菌液PCR鉴定，将经鉴定表明含有大小为1815bp的ScMTB3R1的重组农杆菌命名为C58C1/pBI121-ScMYB3R1；

将转入pBI121空载体的重组农杆菌命名为C58C1/pBI121(不含有大小为1815bp的DNA片段)。

采用农杆菌花序侵染的方法将上述所得的重组农杆菌C58C1/pBI121-ScMYB3R1和C58C1/pBI121分别转化拟南芥生态型Columbia0，经含50mg/mL Kan的MS₀固体培养基筛选，共筛选出11株T₀代转ScMTB3R1植株，分别记作T-1～T-11。将筛选出的阳性植株移栽至营养土中在温室进行培养，繁殖出的每代种子都在含有50mg/mL Kan的MS₀固体培养基上进行筛选，直至繁殖得到T₃代转ScMTB3R1拟南芥株系。

对得到的T₃代的转基因拟南芥植株进行PCR检测：以T₃代的转基因拟南芥植株苗的基因组DNA为模板，采用ScMYB3R1-F2和ScMYB3R1-R2引物进行PCR扩增。

结果如图2所示：11个不同的转ScMTB3R1拟南芥株系均扩增得到了长度约为1815bp的片段。而用同样的引物对野生型拟南芥Columbia0植株以及转入pBI121空载体的拟南芥植株进行PCR检测，均未得到上述扩增片段。

三、转ScMTB3R1拟南芥植株的功能验证

以如下3种拟南芥植株为实验材料：野生型拟南芥Columbia0(WT)、3个上述步骤二中得到的T₃代转ScMTB3R1株系和转入pBI121空载体的拟南芥株系。在MS₀固体培养基上发苗后，转移至土里种植，共计培养5周后，放入-10℃低温处理2小时，转入正常条件下培养。7天后统计存活率及相对电导率。实验重复3次，结果取平均值。每个株系10株，实验重复3此，结果取平均值。

1、存活率

结果如图3A和图3B所示：经过低温处理后，野生型拟南芥植株存活率统计仅为30％，而转ScMTB3R1拟南芥植株存活率达83-90％；当转入正常条件下培养时，野生型拟南芥植株表现一定程度的叶片损伤，且比转ScMTB3R1拟南芥恢复的更慢。

2、相对导电率

分别在低温处理前后测定野生型拟南芥与转ScMTB3R1拟南芥的相对电导率。相对电导率测定方法：首先取0.4g新鲜叶片浸泡在300mM Nacl溶液4h，然后将叶片分成2等份：1份浸入在5ml ddH₂O中，在25℃，170rpm的条件下振荡2h；第2份在沸水中煮沸30min，然后运用DDS-12D精密电导率仪(上海理达仪器厂)进行对两份叶片测定，第一份叶片测定的电导率用Rc表示，第2份叶片测定的电导率用Rc’表示；相对电导率＝Rc’/Rc×100％。

结果如图3C所示：低温处理前后，两者相对电导率均增高，但在低温处理后转ScMTB3R1拟南芥的相对电导率值(18.6–19.2％)还是明显低于野生型拟南芥的相对电导率值(36.7％)。因此过量表达ScMTB3R1能够减少转ScMTB3R1拟南芥的低温损伤及增强低温抗性活力。

对于以上各方面的检测，转入pBI121空载体的拟南芥与野生型拟南芥相比无显著差异。

Claims

1.蛋白质，氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B4)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；所述耐逆性为耐低温胁迫。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.一种培育转基因植物的方法，包括向出发植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到耐逆性高于所述出发植物的转基因植物的步骤；所述耐逆性为耐低温胁迫。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因序列如序列表中序列1所示。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。