CN109628463B

CN109628463B - 小麦抗条锈病相关蛋白TabZIP74及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN109628463B
Application number: CN201811550453.6A
Authority: CN
Inventors: 蔺瑞明; 王凤涛; 李媛媛; 冯晶; 徐世昌
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2038-12-18
Also published as: CN109628463A

Abstract

本发明公开了小麦抗条锈病相关蛋白TabZIP74及其编码基因与应用。本发明公开的小麦抗条锈病相关蛋白为A1)或A2)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白质具有相同功能的蛋白质。实验证明，将本发明的抗条锈病相关蛋白的编码基因干涉后可以降低植物对条锈病的抗病性，可获得对条锈病抗性降低的转基因植株，以作为筛选防止植物条锈病药物的模型植物。本发明抗条锈病相关蛋白及其基因对培育抗条锈病植物具有重要的意义，适合于推广应用。

Description

小麦抗条锈病相关蛋白TabZIP74及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及小麦抗条锈病相关蛋白TabZIP74及其编码基因与应用。

背景技术

小麦是一种禾本科谷物，其为世界上仅次于水稻的第二大粮食作物。我国是世界上小麦生产与消费大国,常年种植面积为2400万公顷左右,年产量近1.3亿吨。小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp tritici)引起的一种世界性气传病害，也是我国发生范围最广、危害程度最重的麦类病害之一，一般减产20％～30％，最严重时几乎颗粒无收。选育抗病品种才是防治小麦条锈病最经济、安全、有效的方法。当前，通过基因工程育种获得具有抗病性的作物品种是一种行之有效的方法。而该方法中最关键的技术瓶颈问题是有效抗病基因的筛选与功能发现。

转录水平的调控是基因表达调控最关键的步骤，转录因子在内源激素和外源刺激的信号传导过程中发挥重要的作用，参与许多基因在不同条件下、不同时期表达调控，它们在植物的生长、发育以及对外界的各种生物和非生物因子的胁迫作出应答中起关键调控作用，因而转录因子成为人们研究的重点领域之一。转录因子在真核生物的发育、适应逆境因子等过程中起着非常重要的作用，而转录因子本身的表达也受到各种方式的调控。植物各种诱导型基因的表达主要受相应特定转录因子在转录水平上调控，这种转录水平上的调控在植物防卫和抗逆反应中起非常重要的作用。

bZIP(basic-domain leucine-zipper)转录因子是一类普遍存在于动植物及微生物中的最大的一类转录因子，因其碱性亮氨酸拉链bZIP基元(motif)得名，bZIP基元的长度大约为60-80个氨基酸。bZIP转录因子在N端含有与特异DNA序列相结合的碱性结构域，该区域由16个氨基酸组成，其中包括一个核定位信号区(N)和一个保守的N-x7-R/K结构区，结构分析表明，这些N-x7-R/K结构区内的碱性氨基酸构成一个α-螺旋结构，与DNA大沟结合，碱性结构区决定与bZIP蛋白结合的DNA特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦抗条锈病相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的抗条锈病相关蛋白来源于普通小麦(Triticum aestivm L.)，为如下A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白质具有相同功能的蛋白质。

序列表中序列2由302个氨基酸残基组成。

为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A1)或A2)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第5-913位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

与所述抗条锈病相关蛋白相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用，也属于本发明的保护范围；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码所述抗条锈病相关蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)抑制所述抗条锈病相关蛋白编码基因表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下1)或2)或3)或4)：

1)编码序列是序列表中序列1的第5-913位的cDNA分子或DNA分子；

2)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述抗条锈病相关蛋白的cDNA分子或DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗条锈病相关蛋白的cDNA分子或DNA分子。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

B8)所述核酸分子具体可为与序列表中序列1的第5-913位核苷酸所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子，如与序列表中序列1的第735-913位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子。

B9)所述重组载体可为pCaBS-γ-bZIP-VIGS，所述pCaBS-γ-bZIP-VIGS为利用限制性内切酶在pCaBS-γ载体的多克隆位点中反向插入序列表中序列1的第735-913位所示的DNA片段得到的重组载体。所述限制性内切酶可为ApaI。

所述微生物具体可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为农杆菌，如农杆菌EHA105。

B9)所述重组微生物可将所述pCaBS-γ-bZIP-VIGS导入所述微生物中得到。

所述转基因细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括植物的繁殖材料。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦，如小麦丰产3号。

所述抗病性可为条锈病抗性。所述条锈病可为由小麦条锈菌引发的病害，如条锈菌生理小种CYR32引发的病害。

本发明还提供了培育感病性转基因植物的方法，所述方法包括：抑制目的植物中所述抗条锈病相关蛋白的编码基因的表达得到抗病性低于所述目的植物的感病性转基因植物。

所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦，如小麦丰产3号。

所述降低目的植物中所述抗条锈病相关蛋白的编码基因的表达是通过将与序列表中序列1的第735-913位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。

与序列表中序列1的第735-913位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子通过BMSV病毒导入所述目的植物中。

所述抗病性为条锈病抗性。所述条锈病可为由小麦条锈菌引发的病害，如条锈菌生理小种CYR32引发的病害。

实验证明，将本发明的抗条锈病相关蛋白的编码基因干涉(即抑制基因的表达)后可以降低植物对条锈病的抗病性，如条锈病的潜育期显著缩短、条锈菌孢子堆的长度和数量增加，可获得对条锈病抗性降低的转基因植株，以作为筛选筛选的防止植物条锈病药物的模型植物。因此，本发明抗条锈病相关蛋白及其基因对培育抗条锈病植物具有重要的意义，适合于推广应用。

附图说明

图1为病毒介导基因沉默小麦的抗条锈病鉴定结果。包括3种植株：未接种病毒(Mock，即空白对照)、接种空载体病毒(BSMV)和接种干涉片段插入到病毒序列的重组病毒(BSMV-TabZIP74或vTabZIP74)。A为接种亲和条锈菌生理小种CYR32 11d，16d后的表型；B为接种亲和条锈菌生理小种CYR32的潜育期统计及差异分析；C为接种亲和条锈菌生理小种CYR32 16d时孢子堆数量及孢子堆长度统计及差异分析。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

Taichung29*6/Yr5：记载在文献“徐世昌,吴立人,万安民,王凤乐,赵文生,牛永春.以Taichung29为背景的小麦抗条锈病近等基因系转育进展[J].植物保护,2004，30(02):19-22.”中。

下述实施例中的pCaBS-γ载体为文献“Yuan,C.,C.Li,L.Yan,A.O.Jackson,Z.Liu,C.Han,J.Yu and D.Li(2011).A high throughput barley stripe mosaic virusvector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.PLoS One 6(10):e26468”中pCa-γbLIC的载体。

pCaBS-α载体：记载在文献“Yuan,C.,C.Li,L.Yan,A.O.Jackson,Z.Liu,C.Han,J.Yu and D.Li(2011).A high throughput barley stripe mosaic virus vector forvirus induced gene silencing in monocots and dicots.PLoS One 6(10):e26468”中。

pCaBS-β载体：记载在文献“Yuan,C.,C.Li,L.Yan,A.O.Jackson,Z.Liu,C.Han,J.Yu and D.Li(2011).A high throughput barley stripe mosaic virus vector forvirus induced gene silencing in monocots and dicots.PLoS One 6(10):e26468”中。

本生烟：记载在文献“Yuan,C.,C.Li,L.Yan,A.O.Jackson,Z.Liu,C.Han,J.Yu andD.Li(2011).A high throughput barley stripe mosaic virus vector for virusinduced gene silencing in monocots and dicots.PLoS One 6(10):e26468”中。

小麦条锈菌为条锈菌生理小种CYR32，记载在文献“万安民,吴立人,金社林,姚革,王保通.中国小麦条锈菌条中32号的命名及其特性[J].植物保护学报,2003，30(04):347-352”中。

小麦丰产3号：记载在文献“淦爱华,蔺瑞明,徐世昌,万安民,马占鸿.中国小麦条锈菌鉴别寄主丰产3号抗条锈性遗传分析[J].植物保护学报,2006，33(04):369-373”。

实施例1、小麦中抗条锈病相关蛋白TabZIP74可以调控小麦对条锈病的抗性

本实施例提供了一种来源于小麦抗条锈病近等基因系Taichung29*6/Yr5的抗条锈病相关蛋白(名称为TabZIP74)，其序列为序列表中序列2，在小麦抗条锈病近等基因系Taichung29*6/Yr5中，TabZIP74基因的CDS序列为序列表中序列1，序列1的第5-913位编码TabZIP74蛋白质。

基因干涉载体的构建：

以小麦抗条锈病近等基因系Taichung29*6/Yr5的cDNA为模板，使用引物VIGS-bZIP-F1/VIGS-bZIP-R1进行PCR扩增，回收纯化得到目的片段bZIP-VIGS；将目的片段bZIP-VIGS利用ApaI限制性内切酶进行酶切，回收得到bZIP-VIGS酶切产物。利用ApaI限制性内切酶将pCaBS-γ载体线性化，回收纯化得到载体骨架。将10ng的载体骨架和100ng bZIP-VIGS酶切产物混合均匀，利用T4DNA聚合酶进行连接反应，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。提取阳性克隆中对的重组载体，将序列正确的重组载体记为pCaBS-γ-bZIP-VIGS。pCaBS-γ-bZIP-VIGS为利用ApaI限制性内切酶在pCaBS-γ载体中反向插入序列表中序列1的第735-913位所示的DNA片段得到的重组载体。所用引物序列如下：

VIGS-bZIP-F1：5’-AAGGAAGTTTAACCAACCGAAGTCTGGTGGCT-3’(斜体为接头序列)；

VIGS-bZIP-R1：5’-AACCACCACCACCGTCTAGCAAGCGGCAGCTGCA-3(斜体为接头序列)。

小麦接种病毒进行基因干涉：

将pCaBS-α载体、pCaBS-β载体、pCaBS-γ载体、pCaBS-γ-bZIP-VIGS载体分别导入EHA105农杆菌细胞中，将得到的重组菌分别记为EHA105/pCaBS-α、EHA105/pCaBS-β、EHA105/pCaBS-γ和EHA105/pCaBS-γ-bZIP-VIGS。

将EHA105/pCaBS-α、EHA105/pCaBS-β和EHA105/pCaBS-γ-bZIP-VIGS等浓度混合后注射生长良好的本生烟，本生烟过渡寄主，建立BSMV介导的基因干涉小麦系统。注射7-10天后，分别取本生烟注射叶和注射叶片上位叶1-2片，每克加入3mL 50mM PB(pH7.0)和少许纯化的硅藻土，研磨，蘸取汁液接种小麦丰产3号。接种后7天观察病毒症状。将EHA105/pCaBS-α、EHA105/pCaBS-β和EHA105/pCaBS-γ-bZIP-VIGS得到的病毒记为BSMV-TabZIP74。

按照上述方法，将EHA105/pCaBS-γ-bZIP-VIGS替换为EHA105/pCaBS-γ，其他步骤均不变，进行实验，作为对照。将EHA105/pCaBS-α、EHA105/pCaBS-β和EHA105/pCaBS-γ得到的病毒记为BSMV。

按照上述方法，将未注射菌的本生烟接种小麦作为空白对照。

基因干涉植株抗条锈病鉴定：

接种BSMV和BSMV-TabZIP74以及空白对照的小麦材料在接种小麦14天后，利用“扫接法”接种亲和的小麦条锈菌，每种小麦的接种量均相等。接种后10±1℃黑暗保湿24h，然后转入培养箱内(22-24℃)潜育培养，直至发病产生夏孢子，观察潜育期、统计条锈病孢子堆密度和大小。

基因干涉后TabZIP74基因的表达水平检测：接种条锈菌8天小麦叶片取样，利用TRIZOL提取小麦总RNA，以MMLV反转录试剂盒合成第一链cDNA采用实时定量PCR(Real-timeQuantitative PCR,qRT-PCR)方法检测TabZIP74基因的表达水平。以组成型表达的基因为内参，设计了qRT-PCR的引物。内参基因为小麦ADP-RF(ADP-RIBOSYLATION FACTOR,Ta2291)，内参引物序列为TaADP-RF1：5’-GCTCTCCAACAACATTGCCAAC-3’，TaADP-RF2：5’-GCTTCTGCCTGTCACATACGC-3’。TabZIP74基因的引物序列为qbZIP74f:5’-GGGAGAGGATCAAGCTAGATACTC-3’,qbZIP74r:5’-AGATAGTCATGGATAAAGCC-3’。

实验设3次重复，结果取平均数。结果显示，接种BSMV-TabZIP74的小麦材料中TabZIP74基因的相对表达量均显著低于接种BSMV以及空白对照的小麦材料，接种BSMV的小麦材料和空白对照间TabZIP74基因的相对表达量无显著差异。

干涉植株对小麦条锈病的抗病性测定结果如图1所示。接种BSMV-TabZIP74的小麦材料接种条锈菌后11d孢子堆破裂、可见，潜育期比接种BSMV的小麦材料和空白对照均显著缩短；接菌后16d，三种小麦材料间的孢子堆密度没有显著差异，但接种BSMV-TabZIP74的小麦材料的孢子堆的长度和数量均显著高于接种BSMV的小麦材料和空白对照，说明其条锈菌的严重度比接种BSMV的小麦材料和空白对照更高。表明，TabZIP74基因的表达受到抑制后显著降低了小麦的条锈病抗性，TabZIP74及其编码基因可以调控小麦的条锈病抗性。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 小麦抗条锈病相关蛋白TabZIP74及其编码基因与应用

<130> WHOI180087

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1096

<212> DNA

<213> 普通小麦(Triticium aestivum L.)

<400> 1

acccatggac accgacctcg acctggacgc cctcctcgcc tccttcgccg gcgagtccgc 60

cgcagtctcc gagctcctcg ccccgcctcc gcttgatgcg gcggaggcgg ggtcgccgga 120

gtcggtgacc tcccggtcca gccccgccgg cgaggaggtg ctgtcggaga tcgagaggtt 180

tctgatgcag gaggaggagg cggcgggggc ggagccggtg gacgggatca gcgtggacga 240

gttcttggac acgctgttcg acggcgccga ggaggggggc gagaagggga acgggagtga 300

ggctgaggct gggggcagca ccgatgggga ctctaggagg ggggaagacg gggtggaggt 360

ggtgacgccg gagacagagg cggaggtggt gacgcccgag acggaggtcg atggcgatga 420

tcccatcagc aagaagaaga ggaggcaaat gaggaatagg gattctgcca tgaagtccag 480

ggagaggaag aagtcatatg tgaaggactt ggagacgaag agcaagtatc tcgaggcaga 540

gtgtcgccgc ctcagctacg cacttcagtg ctgcgcagct gagaacatgg cactgcgcca 600

gaacatgttg aaggataggc ctattggtgc tcacacagcc atgcaggagt ctgccgtact 660

ttcggaaacc ctgccgctgg tttccctgct ttggctagtg agcatcgtgt gcctattcct 720

aacgcccggt ctacccaacc gaagtctggt ggctccaagg agagccgaaa gagatctcgc 780

aatggtagcc ggaaagccaa gcagtgatca accagagacc ttggagcttc tgctccatgg 840

aaggcgctgg aggggcacaa gggagaggat caagctagat actccgccat tgcgtgcagc 900

tgccgcttgc tagactagtg ccggcttatt cgcaagtttc cagtatgtag tgtagttagc 960

aatgaatgtc tattatgtgt tctcttgctg ccaccgtggc tttatccatg actatctttc 1020

tgctctctct gttccctttg ttctatgatc atctaatcag atgctagttt tgaaaccaaa 1080

aaaaaaaaaa aaaaaa 1096

<210> 2

<211> 302

<212> PRT

<213> 普通小麦(Triticium aestivum L.)

<400> 2

Met Asp Thr Asp Leu Asp Leu Asp Ala Leu Leu Ala Ser Phe Ala Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Ala Pro Pro Pro Leu Asp Ala

20 25 30

Ala Glu Ala Gly Ser Pro Glu Ser Val Thr Ser Arg Ser Ser Pro Ala

35 40 45

Gly Glu Glu Val Leu Ser Glu Ile Glu Arg Phe Leu Met Gln Glu Glu

50 55 60

Glu Ala Ala Gly Ala Glu Pro Val Asp Gly Ile Ser Val Asp Glu Phe

65 70 75 80

Leu Asp Thr Leu Phe Asp Gly Ala Glu Glu Gly Gly Glu Lys Gly Asn

85 90 95

Gly Ser Glu Ala Glu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Gly Asp Ser Arg Arg

100 105 110

Gly Glu Asp Gly Val Glu Val Val Thr Pro Glu Thr Glu Ala Glu Val

115 120 125

Val Thr Pro Glu Thr Glu Val Asp Gly Asp Asp Pro Ile Ser Lys Lys

130 135 140

Lys Arg Arg Gln Met Arg Asn Arg Asp Ser Ala Met Lys Ser Arg Glu

145 150 155 160

Arg Lys Lys Ser Tyr Val Lys Asp Leu Glu Thr Lys Ser Lys Tyr Leu

165 170 175

Glu Ala Glu Cys Arg Arg Leu Ser Tyr Ala Leu Gln Cys Cys Ala Ala

180 185 190

Glu Asn Met Ala Leu Arg Gln Asn Met Leu Lys Asp Arg Pro Ile Gly

195 200 205

Ala His Thr Ala Met Gln Glu Ser Ala Val Leu Ser Glu Thr Leu Pro

210 215 220

Leu Val Ser Leu Leu Trp Leu Val Ser Ile Val Cys Leu Phe Leu Thr

225 230 235 240

Pro Gly Leu Pro Asn Arg Ser Leu Val Ala Pro Arg Arg Ala Glu Arg

245 250 255

Asp Leu Ala Met Val Ala Gly Lys Pro Ser Ser Asp Gln Pro Glu Thr

260 265 270

Leu Glu Leu Leu Leu His Gly Arg Arg Trp Arg Gly Thr Arg Glu Arg

275 280 285

Ile Lys Leu Asp Thr Pro Pro Leu Arg Ala Ala Ala Ala Cys

290 295 300

Claims

1.抗条锈病相关蛋白在调控小麦条锈病抗性中的应用，所述抗条锈病相关蛋白为氨基酸序列是序列2的蛋白质。

2.与抗条锈病相关蛋白相关的生物材料在调控小麦条锈病抗性中的应用，所述与抗条锈病相关蛋白相关的生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：

B1）编码权利要求1中所述抗条锈病相关蛋白的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；

B7）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官；

B8）抑制权利要求1中所述抗条锈病相关蛋白编码基因表达的核酸分子；所述核酸分子为与序列表中序列1的第735-913位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子；

B9）含有B8）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下1）或2）：

1）编码序列是序列表中序列1的第5-913位的cDNA分子或DNA分子；

2）序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子。

4.培育感病性转基因小麦的方法，包括：抑制目的小麦中权利要求1中所述抗条锈病相关蛋白的编码基因的表达得到条锈病抗性低于所述目的小麦的感病性转基因小麦；所述条锈病为由小麦条锈菌引发的病害。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：降低目的小麦中权利要求1中所述抗条锈病相关蛋白的编码基因的表达是通过将与序列表中序列1的第735-913位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的小麦实现的。