CN114409753B

CN114409753B - 一种耐低温胁迫基因、蛋白及其应用

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Publication number: CN114409753B
Application number: CN202210224838.3A
Authority: CN
Inventors: 张俊卫; 郝晓蒙; 周婵; 陈曼曼; 张�杰; 包满珠
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-03-09
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-03-09
Also published as: CN114409753A

Abstract

本发明公开了一种耐低温胁迫基因、蛋白及其应用，涉及生物技术领域。本发明从低温胁迫的梅花转录组数据中，筛选到的一个受低温诱导的PmMYB3R‑5基因。其属于能够针对性提高植物耐寒能力的转录因子；且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。经过转化培育，能够获得低温胁迫耐受性提高的转基因植株。具有上述PmMYB3R‑5基因的重组菌或重组细胞也均具有耐寒性。本发明的提出，可以用于耐低温胁迫的转基因作物的培育，具有广阔的应用前景。

Description

一种耐低温胁迫基因、蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种耐低温胁迫基因、蛋白及其应用。

背景技术

低温是植物经受的主要逆境胁迫之一，影响植物的生长和发育，也是限制植物地理分布和生长季节的主要环境因素。由于植物不能像动物那样移动，因此，为了适应和抵抗低温胁迫，植物在长期进化过程中形成了许多有效的应答机制，如“冷驯化”，即植物经过一定时间非冻害低温的处理可以获得更强的低温耐受能力。在冷驯化过程中，植物细胞发生了一系列生物化学、生理学和分子水平上的变化。遗传学和分子生物学的迅猛发展，植物耐寒性分子机理的研究取得了空前的进步，获得大量冷驯化相关基因。根据这些基因编码产物功能的不同，可将其分为两类：一类是编码功能蛋白的基因，直接保护生物大分子和膜结构，维持膜水分流动，催化多种渗透调节物质的生物合成；另一类基因包括转录因子(如bZlP、bHLH、MYB、NAC、WRKY和CBF/DREB等)、蛋白激酶以及涉及胁迫信号转导和控制胁迫耐受基因表达的蛋白酶。

MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)类转录因子是高等植物中数量最多的一类基因家族。其N端含有一段由51-52个氨基酸构成的结构保守、串联排列且不完全重复的DNA结合区域。根据所含MYB结构域的数量，可将植物中的MYB转录因子分成4个亚类：1)只含一个(R1/2)或部分MYB结构域的1R-MYB或MYB-related蛋白；2)含有两个MYB结构域的R2R3-MYB蛋白；3)含有3个MYB结构域(R1R2R3)的亚类成员3R-MYB；4)含有4个MYB结构域(4个R1/2-like重复)的4R-MYB蛋白。MYB转录因子生物学功能多样，既可调控细胞分化和植物生长发育，参与初生和次生代谢的调节，也应答激素刺激和外界环境胁迫以及抵抗病原菌的侵害。

目前的研究显示，MYB家族的3个亚类(1R-MYB或MYB-related，R2R3-MYB，3R-MYB)中均有成员参与冷胁迫应答的调控。在梅花低温胁迫响应MYB研究方面，周婵等(2015)对R2R3亚类MYB进行了鉴定，并分析了其在低温胁迫下表达水平的变化以及部分基因的功能。目前还没有关于梅花PmMYB3R-5基因在低温胁迫响应中功能及其应用的报道。

梅花(Prunus mume)是庭院美化的传统花木，也是梅林、梅岭等专类园的骨干树种；既可作盆花、盆景、切花栽培，也是花茶、香精工业的原料。同时，梅文化也在满足人们日益增长的精神文化需求中发挥着重要作用。由于梅起源于川、滇、藏交界的横断山区，低温限制了大多数梅花品种在北方的露地栽培，制约着梅经济、环境和社会效益的进一步发挥。

目前，对梅花抗寒性的研究多集中在选种、引种、育种、抗寒品种区域试验、低温胁迫下生理生化指标分析等，在抗寒分子机制方面，筛选出了PmCBF/DREB1、PmWRKY、PmICE1、PmZAT12、PmBBX32、PmGolS、PmRS、脱水素等低温胁迫响应基因，这些研究为梅花耐寒种质资源的创新提供了一定的参考依据。但抗寒性状受多基因调控，因此，耐寒应答基因有待进一步发掘和分析。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐低温胁迫基因、蛋白及其应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了梅花的一种耐低温胁迫基因编码的蛋白，其包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明提供的耐低温胁迫基因编码的蛋白，原始来源于梅花，通过过表达转化该耐低温胁迫基因的植物不仅具有抗寒性能，而且能够正常生长和发育。可以用于耐低温胁迫的转基因作物的培育，具有广阔的应用前景。

上述蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述的蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。标签包括不限于：Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ、c-myc。也可直接在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上上述标签。

本发明还提供了一种分离的梅花耐低温胁迫核酸分子，其编码上述的蛋白。核酸分子的序列如SEQ ID NO.1所示。

该核酸分子是发明人从低温胁迫的梅花转录组数据中，筛选到的一个受低温诱导的PmMYB3R-5基因。其属于能够针对性提高植物耐寒能力的转录因子；且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。经过转化培育，能够获得低温胁迫耐受性提高的转基因植株。PmMYB3R-5基因还具有抗低温胁迫逆境的功能，本发明的提出为利用该基因在其他植物上的应用并提高植物耐寒性提供了理论依据，具有良好的利用价值。

在本发明提供了上述氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得编码上述耐低温胁迫蛋白的核酸分子。例如，可以在编码耐低温胁迫基因编码的蛋白的核酸序列上作对应的核苷酸突变得到编码上述耐低温胁迫蛋白的核酸序列。这对本领域技术人员来说是容易实现的。

本发明还提供了一种表达盒，其含有上述的核酸分子。

本发明还提供了一种载体，其含有上述的核酸分子或上述的表达盒。载体包括不限于质粒。

本发明还提供了一种重组菌或重组细胞，其含有上述的核酸分子、上述的表达盒或上述的载体。

重组菌可以选自农杆菌或大肠杆菌；重组细胞可以是感受态细胞，例如大肠杆菌DH5α感受态细胞、TOP10细胞。

如上述的蛋白、上述的核酸分子、上述的表达盒、上述的载体或上述的重组菌或重组细胞在培育具有抗寒性的植物品种中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括：将核酸分子送入目的植物细胞，分离的核酸分子含有耐低温胁迫基因。

分离的核酸分子可以是质粒或DNA片段，在可选的实施方式中，可以通过基因枪法将分离的核酸分子送入目的植物细胞。

转化的方法包括不限于农杆菌介导基因转化法、基因枪转化法、花粉管通道法。

将载体转化目的植物，载体含有耐低温胁迫基因。

将重组菌或重组细胞导入目的植物，重组菌或重组细胞含有耐低温胁迫基因。重组菌或重组细胞可通过侵染的方式导入目的植物体内。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括：修饰目的植物的内源PmMYB3R-5基因，使其编码耐低温胁迫基因编码的蛋白。

本领域技术人员容易想到通过本领域常规的转基因技术、基因编辑技术(如通过锌指核酸内切酶(ZFN，zinc-finger nucleases)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN，transcription activator-like effector nucleases)技术或CRISPR/Cas9)、诱变育种技术(如化学、辐射诱变等)等对目标植物的PmMYB3R-5基因进行改造，使目标植物具有抗寒性(或更优的抗寒性)，并能够正常生长和发育，进而得到具有耐低温胁迫的植物新品种。因此，无论采用何种技术，只要其利用了本发明提供的PmMYB3R-5基因赋予植物耐低温胁迫，均属于本发明的保护范围。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括：对植物细胞、组织、个体或群体进行筛选，使其过量表达耐低温胁迫基因编码的蛋白。通过过量表达，以赋予植物较好的低温耐受性。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述目的植物包括不限于梅花、拟南芥、扁桃、桃、小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱或荞麦。

本发明具有以下有益效果：

本发明从低温胁迫的梅花转录组数据中，筛选到的一个受低温诱导的PmMYB3R-5基因。其属于能够针对性提高植物耐寒能力的转录因子；且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。经过转化培育，能够获得低温胁迫耐受性提高的转基因植株。PmMYB3R-5基因还具有抗低温胁迫逆境的功能，本发明的提出为利用该基因在其他植物上的应用并提高植物耐寒性提供了理论依据，具有良好的利用价值。具有上述PmMYB3R-5基因的重组菌或重组细胞也均具有耐寒性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为PmMYB3R-5与其他物种MYB转录因子保守区的氨基酸序列同源比对；

图2是PmMYB3R-5与其他物种MYB转录因子之间聚类分析；

图3是PmMYB3R-5基因在低温胁迫下的表达模式分析；

图4是T3代超表PmMYB3R-5拟南芥开花莲座叶表型；

图5是野生型与T3代超表PmMYB3R-5拟南芥低温处理情况与存活率；

图6是野生型与T3代超表PmMYB3R-5植株叶片的NBT和DAB染色；

图7是野生型与T3代超表PmMYB3R-5拟南芥的生理指标测定。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用植物生理学、植物分子遗传学、细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《植物生理学》(苍晶等人，2017)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《植物分子遗传学》(Monica A.Hughes等人著)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例进行梅花中受低温诱导的PmMYB3R-5基因的筛选和基因克隆。

分析梅花品种‘雪梅’材料在受到低温胁迫时的转录组数据，筛选到一个受低温诱导的PmMYB3R-5基因。利用艾德莱EASYspin植物RNA提取试剂盒，从低温胁迫处理的‘雪梅’叶片中提取总RNA，采用RT reagent Kit With gDNA Eraser(PerfectReal Time)试剂盒(DRR047A，TaKaRa)反转录合成cDNA。根据梅花基因组数据库信息，设计一对引物。

PmMYB3R-5-F：

CGGGGTACCATGGCGAAAGTGAAAAAGGAGAA

PmMYB3R-5-R：

TGCTCTAGAGGCAAAAATTTGAACCGTGGA

以反转录合成cDNA为模板扩增PmMYB3R-5基因，PCR反应采用20μl体系包括：2μl10×Buffer(含Mg²⁺)，0.4μl dNTP(10mm/L)，1μl Primer(10μm/L)，1μl模板(cDNA)，0.2μlEasyTaq DNA polymerase，14.4μl ddH₂O(sterile distilled water)。反应程序设置为：95℃预变性5min；(95℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 1min)×35个循环；72 10min。

扩增产物回收后连接到PMD18-T载体，连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(培养基为LB+氨苄青霉素(Amp，100mg/L))。挑取阳性单克隆送往上海生工以M13F和M13R引物测序。

序列测序结果证明成功克隆出PmMYB3R-5的全长cDNA，PmMYB3R-5全长cDNA为1293bp(SEQ ID NO.1)，编码一个由430个氨基酸组成的蛋白(SEQ ID NO.2)。

将测序所得序列在软件Primer5上推导其氨基酸序列，利用NCBI的BLASTtp软件和其他物种进行序列比对和功能结构域预测，发现PmMYB3R-5与扁桃PdMYB3R-like和桃PpMYB3R具有较高的同源性，具有典型的R1R2R3结构型；PmMYB3R-5与MYB3R类转录因子保守区的氨基酸序列同源比对及聚类分析分别如图1和图2所示。

实施例2

本实施例提供了梅树的枝条在低温处理下的转录因子PmMYB3R-5表达分析。

3月中旬从梅树上采取粗细适中的二年生枝条，留中间部分截成15cm左右的小段插于组培瓶中，每个小枝上保留4-6个壮实的芽，脱驯化后在光照培养箱对水培枝条进行4℃低温胁迫处理。分别在4℃低温胁迫处理0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h后取样，超低温保存，同时保留3次生物学重复。

qRT-PCR验证的总RNA提取采用艾德莱EASYspin植物RNA提取试剂盒，反转录cDNA合成采用RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒(DRR047A，TaKaRa)。实时定量PCR应用/>Premix Ex Taq II。每个处理时间点均设有3个生物学重复和3个机械重复。10μL反应体系含1μL cDNA模板、5μL/>Premix ExTaq II(Tli RNaseH Plus)(2×)、0.2μL ROX Reference Dye II(50×)、3μL ddH₂O和特异引物各0.4μL。采用ABI7500Real-Time PCR System(Applied Biosystems,USA)荧光定量PCR仪。PCR反应程序为：95℃预变性30s；(95℃ 3s，60℃ 30s)×40个循环；95℃ 15s，60℃60s，95℃ 15s。采用2-DDCt方法计算各基因的相对表达量。本实施例中用到的MYB基因及内参基因PmEF1α引物序列如下：

PmMYB3R-q-F:GAACAGGGTTGGAGATTGGTGA；

PmMYB3R-q-R:AAGAGGCTGATAAAGGGCTGTG；

PmEF1α-q-F:CGGATTCAATGTTAAGAATGTTGC；

PmEF1α-q-R:AGAACTGGAGCATATCCGTTACC。

结果参照图3所示，结果显示：低温处理后PmMYB3R-5表达量迅速增加，6小时后达到第一次高峰，12-24h表达量有所下降，48h又迅速增加，表达量达到第二次高峰，表明PmMYB3R-5的表达受到低温诱导。

实施例3

本实施例进行PmMYB3R-5超量表达载体的构建。

从携带有PmMYB3R-5基因的克隆载体中筛选正向插入的阳性克隆，37℃摇床上培养后抽提质粒，对该质粒和表达载体pCAMBIA2300s质粒用相应的内切酶双酶切，回收目标片段，将目的基因和表达载体质粒酶切回收产物连接，连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态，抗性培养基上涂皿培养(LB+卡那霉素(Km，100mg/L))。PCR检测后，挑取阳性克隆37℃摇床培养后提取质粒，双酶切验证正确后，热激转化农杆菌EHA105感受态，抗性培养基上涂皿培养(LB+Km(100mg/L))。对单克隆用35S-F与目的基因下游引物PCR检测。阳性克隆可用于下一步遗传转化。

热激转化农杆菌EHA105感受态并将其在抗性培养基上涂皿培养(LB+Km(100mg/L))后，挑取单克隆用35S-F与目的基因下游引物PCR检测到了阳性克隆，载体构建成功，摇菌后用于拟南芥的遗传转化。

实施例4

本实施例进行拟南芥的转化及转基因拟南芥纯合植株筛选。

1)拟南芥侵染：

取拟南芥侵染种子浸泡水中并4℃春化2d后撒播于培养土表面，覆膜保证湿度，出现2对真叶后揭膜移植到小方盆中。长日照生长条件下栽培，待抽出2-3个花薹，较多花蕾出现时准备侵染。

农杆菌菌液浸花法转化拟南芥。将PCR检测阳性的已转化35s::PmMYB3R-5重组质粒的农杆菌，在含有Km(100mg/L)的LB培养基中28℃、200rpm活化备用。取对数期的农杆菌菌液50mL4℃，6000r/min离心10min，弃上清，加入等体积的重悬液(5％蔗糖，0.02％SilwetL-77)震荡重悬。将植株上部花序侧放浸入重悬液中30s，擦去过多菌液，喷少许水保湿，覆膜保湿暗培2d后去掉塑料膜。正常管理，待荚果成熟收集种子，加入干燥剂，4℃保存。

2)转基因拟南芥阳性苗筛选。

拟南芥筛选培养基配方为MS+Km(50mg/L)+Cef(50mg/L)，消毒方法如下：

①取适量种子于1.5mL离心管中，加入1mL的8％次氯酸钠，浸泡4min，期间持续颠倒摇匀。

②移液器吸出8％次氯酸钠，加入1mL的95％的乙醇，颠倒摇匀1min，重复3次。

③倒掉95％的乙醇，加入1mL的双蒸水清洗，重复3次。

④按试实验要求将种子均匀分布或点播于相应培养基。

4℃春化2d后，组培室培养10d，将筛选培养基上长出真叶并生根的拟南芥小苗移栽至盆土，盖上薄膜保湿，在光照培养箱培养5d取下薄膜继续培养。约1周后提取转基因拟南芥DNA，以35S-F和相应特异下游引物PCR检测，扩增出与阳性对照(重组质粒)相同目的条带的被认为是T1代阳性转基因植株。拟南芥DNA简易提取步骤如下：

①2mLPE管中加入0.5cm*0.5cm大小新鲜叶片和2个钢珠，液氮速冻后剧烈震荡将样品磨成粉末。

②取500μL2×CTAB裂解缓冲液，迅速加入磨好的样品中，融化后摇匀在65℃水浴锅内温浴20-30min。

③温浴完成后稍微降温，PE管中加入500μL氯仿，反复颠倒混匀，10000rpm离心10min。

④吸取上清液120μL，依次转移至新的PCR板孔中，加入80μL异丙醇，4℃，4000rpm离心40min。

⑤离心完成后，轻轻倒出上清废液，每孔各加入150μL70％乙醇漂洗一次，4000rpm离心10min。

⑥弃上清，吹干溶于40μL无菌水中，37℃溶解30min，4℃保存备用。

3)转基因拟南芥目的基因相对表达量检测。

转基因拟南芥总RNA提取和反转录方法同实施例3。用半定量RT-PCR检测目的基因相对表达水平，以拟南芥AtEF1α为内参。

引物序列为：

PmMYB3R-F:GAACAGGGTTGGAGATTGGTGA；

PmMYB3R-R:AAGAGGCTGATAAAGGGCTGTG；

PmEF1α-F:CGGATTCAATGTTAAGAATGTTGC；

PmEF1α-R:AGAACTGGAGCATATCCGTTACC。

RT-PCR反应的体系及程序设置见实施例2。其中内参基因RT-PCR程序中循环数改为27，目的基因的循环数改为30。

4)纯合株系筛选。

纯合株系筛选的流程如下：

①单拷贝株系筛选：T1代阳性植株所收的种子记为T2代种子，将T2代种子消毒后点播在筛选培养基上(MS+Km(50mg/L)+Cef(50mg/L))，每次实验都需野生型对照。组培室培养12d后统计阳性苗的数量，卡方验证符合3:1的，认为是单拷贝插入的T2代株系。

②纯合系筛选：T2代植株所收的种子记为T3代种子。T3代种子消毒后播于相应筛选培养基上，统计每个株系中抗性苗的数量，100％为阳性的株系，认为是纯合系。每组实验重复3次。

通过对超表PmMYB3R-5基因拟南芥植株的鉴定、目的基因表达量分析、纯合植株筛选，获得3个T3代纯合株系(#15，#26，#30)。

实施例5

转基因拟南芥开花表型观测。

播种实施例4获得的超表PmMYB3R-5基因T3代拟南芥纯合株系和野生型拟南芥，在培养土中生长4week左右开花时，分别拍照和记录每个植株莲座叶叶片数量和叶片长度，其中叶片长度测量两个最长叶片之间的距离，每个株系至少重复3棵。

开花表型参照表1和图4所示。结果显示，与野生型相比，T3代超表PmMYB3R-5拟南芥的1-2周转基因幼苗，无明显差异；3-4周开花的时间上没有明显差别，但转基因植株的莲座叶生长更为健壮，表现出叶片数量和叶片长度增加(图4中的A和B均为开花后在不同角度拍摄的实物图片)。

表1生长4week左右开花时转基因拟南芥和野生型拟南芥的叶片数量和叶片长度统计表。

实施例6

本实施例进行转基因拟南芥抗寒表型检测。

取实施例4获得的转基因和野生型拟南芥在培养土中培养3week时提前浇透水，黑暗条件下-8℃处理拟南芥6h-7h，具体时间根据生长状态判定；结束后4℃解冻12h，再转到人工气候箱恢复培养10d左右，统计各株系存活率；低温处理前、解冻后及恢复后分别观察表型并拍照，每个株系处理3-6盆拟南芥，每盆9棵。

生长状况图参照图5所示：生长状态一致的野生型和超表PmMYB3R-5拟南芥植株进行-8℃处理、4℃恢复后，大部分叶片都萎蔫，但野生型的萎蔫更严重，#26株系萎蔫程度最小(图5-A)；如图5-B所示，培养箱恢复培养8d后，野生型拟南芥存活率最低，为62.96％；超表株系的存活率高于野生型，其中#26株系的最高，为83.33％，与野生型相比达到极显著差异。

此外，发明人低温胁迫处理超表R2R3亚类MYB基因(Pm005332、Pm011057、Pm014372、Pm024326)的拟南芥和野生型株系，并统计存活率，转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，植株萎蔫程度和存活率无明显差异(表2)，初步验证这4个基因的转化株系抗寒能力与野生型无差异，上述4种MYB基因的超表不能增强转化植株低温抗性。各株系存活率统计结果参照表2所示。

表2低温处理下野生型和超表R2R3亚类PmMYBs拟南芥存活率。

实施例7

本实施例进行转基因拟南芥抗寒性生理指标分析。

转基因和野生型拟南芥在培养土中培养3-4week时提前浇透水，黑暗条件下-4℃处理拟南芥6h，一部分取出4℃解冻12h，再在培养箱里恢复培养1d后，随机采集处理前和恢复后的叶片进行ROS组织化学染色。另一部分植株继续-4℃低温处理至10h，然后4℃解冻12h，转到培养箱中恢复培养3d；分别采集处理前、解冻后和恢复后的叶片，迅速放入液氮速冻，保存于-70℃超低温冰箱中，用于抗氧化酶酶活和脯氨酸的测定。具体方法如下：

1)ROS组织化学检测

低温下拟南芥活性氧(ROS)累积越多，则叶片染色越深，植株氧化损伤越严重。H₂O₂的检测采用DAB(二氨基联苯胺)染色法：DAB溶于0.01M的磷酸缓冲液中(pH 3.8)，终浓度1‰(w/v)，每100ml溶液加入100ul 30％的过氧化氢溶液；叶片完全浸没染液，抽真空30min后黑暗处孵育4-5h直至棕色斑点的出现。O^2·-的检测采用NBT(氮蓝四唑)染色法：NBT溶于0.01M的磷酸缓冲液中(pH7.8)，终浓度1‰(w/v)，叶片浸入后抽真空30min黑暗处孵育1-2h。染色结束后，倒去液体加入脱色液(乙醇：冰醋酸：甘油体积比＝3：1：1)，在95℃水浴锅中煮15min脱去叶绿素，可重复1-2次至完全去除；结束后保存在无水乙醇中以便观察拍照。

实验结果参照图6所示：处理前超表株系和野生型的O^2·-含量都很少且差异不大；-4℃低温处理后，转化植株和野生型的O^2·-含量明显增加，其中野生型叶片染色最深，#26的染色最浅，差异较大(图6-A)。H₂O₂的检测采用DAB法染色，结果与O^2·-的积累相似，未进行低温处理时野生型的染色稍微深一点，-4℃后比超表株系深(图6-B)。以上两种染色结果显示，低温胁迫后野生型植株ROS积累量高于超表植株，表明超表PmMYB3R-5拟南芥可能通过降低O^2·-和H₂O₂的积累，来减少对植物细胞膜以及蛋白质反应的损害，以此增强植株抵抗低温的能力。

2)抗氧化物酶活性和脯氨酸检测

植物受到低温胁迫后积累活性氧产物，对其结构和功能有一定损害，因此植物组织产生活性氧清除酶来去除这些有害物质；超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是其中重要酶类；温度较低时，植物组织会释放大量游离脯氨酸(PRO)来抵御寒冷，研究表明PRO积累的量和速度均与抗性相关。

采集时每个株系在处理前、解冻后和恢复3d后分别取3次重复；试验时在冰浴上称取0.1g样品于2ml的离心管中并放入小钢珠，用磨样机磨碎后加入1ml浓度为50mM的磷酸缓冲液(pH 7.8)。10000r/min，4℃离心10min，得到的上清液即为粗酶液提取液，根据考马斯亮蓝法测量每个样品中蛋白的含量。超氧化物歧化酶(SOD)用总活力表示(U/gFW)、过氧化氢酶(CAT)用比活力表示(U/mg prot)；采用南京建成生物工程所的SOD(A001-4)、CAT(A084-3)及脯氨酸(A107)测定试剂盒。

随机采集对照和低温处理拟南芥的叶片，进行SOD、CAT、PRO的含量测定，实验结果参照图7所示：各株系在处理前SOD活性无显著差异，-4℃处理10h后SOD活性都增加，其中株系#26的活性极显著提高；培养箱恢复培养3d后，SOD活性均有所下降，株系之间没有显著差异。CAT活性在植株没有胁迫时无显著性差异，-4℃处理后和恢复后也没有显著差异。脯氨酸含量变化，-4℃处理和常温恢复后，各株系含量都比低温处理前高，但转化株系与野生型拟南芥株系间无显著差异。

以上结果表明PmMYB3R-5基因具有抗低温胁迫逆境的功能，本发明的提出为利用该基因在其他植物上的应用并提高植物耐寒性提供了理论依据，具有良好的利用价值。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种耐低温胁迫基因、蛋白及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1293

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgaaag tgaaaaagga gaagctgcag gaggtggttg tggatccata cgagaaaatg 60

ggtttccttt tgcaagcatt atatgaaact gaaggctgtt ttgactcccc tgcgtccaag 120

ccaagctctg ctactcggag agccactggt ccgatgagac ggtcagcgaa atgctggaca 180

gaggaagagg acgatcttct aggagagctg gtcagaaagt ttaacaagag taattggaag 240

gaaatagctt catgtctccc tgggcgcaca gatgttcagt gcctgcagcg ctggcaaaag 300

gttctaaatc ctgaaattgt gaagggaccc tggacaaagg aggaagacga ctgcataatc 360

aaacaagttg agagtcatgg tgctaaaaga tggtctgtta ttgcaaagtt cttaccaggt 420

cgaatgggca agcaatgccg agaaaggtgg tacaatcact tatgcccggc tataaataga 480

aatgcatgga cagaagaaga ggagtgggtt cttacttact accaccaact ctttggtaac 540

aagtgggcag aaatagccag gtttctacct ggaaggactg acaatggaat taaaaatcac 600

tggaactgca cactgaagag aaaattagat tcatactcac ctaatggttg tgatgtggat 660

atgcatcctt atgtctggaa cggtgaatta agatcgggcc atgtcgagat taacccagcc 720

ggacagattt ctgatagact ggcctcactc aatcagagaa cagggttgga gattggtgat 780

agcgcttgct ctacaaagtt gactcttgga tgttcttata gacatgaact ttgttcagaa 840

tggaaacctg tcaaagtgca gaaatgcaga tcatcagata gaggagcaaa tagtttgaca 900

aatctaatca caagtggatc ttccaaacac agccctttat cagcctcttc attggttttc 960

gtgggtgcat ctacttctac caggtcctcc ccccatgaga gtccatcctg ctactctaca 1020

ccccaaagcc gtgcgcagaa tgttaatgtg aatctcagca gtggcagcag tcctgggtcg 1080

agactgaaga acttggcatt gagtttcaaa aatactcctt ccatcataag aaagagaagt 1140

tccagaagac ctgatgcttc ttcagctgcc gttaaatctc taggaaggtg cctggaacgt 1200

gaattcgacg ccgaaaacca ttcaggtgtt actaaatgtg gccaactttt ctctgcatat 1260

gctacttcat cagacgttaa cgttggtgca tag 1293

<210> 2

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Lys Val Lys Lys Glu Lys Leu Gln Glu Val Val Val Asp Pro

1 5 10 15

Tyr Glu Lys Met Gly Phe Leu Leu Gln Ala Leu Tyr Glu Thr Glu Gly

20 25 30

Cys Phe Asp Ser Pro Ala Ser Lys Pro Ser Ser Ala Thr Arg Arg Ala

35 40 45

Thr Gly Pro Met Arg Arg Ser Ala Lys Cys Trp Thr Glu Glu Glu Asp

50 55 60

Asp Leu Leu Gly Glu Leu Val Arg Lys Phe Asn Lys Ser Asn Trp Lys

65 70 75 80

Glu Ile Ala Ser Cys Leu Pro Gly Arg Thr Asp Val Gln Cys Leu Gln

85 90 95

Arg Trp Gln Lys Val Leu Asn Pro Glu Ile Val Lys Gly Pro Trp Thr

100 105 110

Lys Glu Glu Asp Asp Cys Ile Ile Lys Gln Val Glu Ser His Gly Ala

115 120 125

Lys Arg Trp Ser Val Ile Ala Lys Phe Leu Pro Gly Arg Met Gly Lys

130 135 140

Gln Cys Arg Glu Arg Trp Tyr Asn His Leu Cys Pro Ala Ile Asn Arg

145 150 155 160

Asn Ala Trp Thr Glu Glu Glu Glu Trp Val Leu Thr Tyr Tyr His Gln

165 170 175

Leu Phe Gly Asn Lys Trp Ala Glu Ile Ala Arg Phe Leu Pro Gly Arg

180 185 190

Thr Asp Asn Gly Ile Lys Asn His Trp Asn Cys Thr Leu Lys Arg Lys

195 200 205

Leu Asp Ser Tyr Ser Pro Asn Gly Cys Asp Val Asp Met His Pro Tyr

210 215 220

Val Trp Asn Gly Glu Leu Arg Ser Gly His Val Glu Ile Asn Pro Ala

225 230 235 240

Gly Gln Ile Ser Asp Arg Leu Ala Ser Leu Asn Gln Arg Thr Gly Leu

245 250 255

Glu Ile Gly Asp Ser Ala Cys Ser Thr Lys Leu Thr Leu Gly Cys Ser

260 265 270

Tyr Arg His Glu Leu Cys Ser Glu Trp Lys Pro Val Lys Val Gln Lys

275 280 285

Cys Arg Ser Ser Asp Arg Gly Ala Asn Ser Leu Thr Asn Leu Ile Thr

290 295 300

Ser Gly Ser Ser Lys His Ser Pro Leu Ser Ala Ser Ser Leu Val Phe

305 310 315 320

Val Gly Ala Ser Thr Ser Thr Arg Ser Ser Pro His Glu Ser Pro Ser

325 330 335

Cys Tyr Ser Thr Pro Gln Ser Arg Ala Gln Asn Val Asn Val Asn Leu

340 345 350

Ser Ser Gly Ser Ser Pro Gly Ser Arg Leu Lys Asn Leu Ala Leu Ser

355 360 365

Phe Lys Asn Thr Pro Ser Ile Ile Arg Lys Arg Ser Ser Arg Arg Pro

370 375 380

Asp Ala Ser Ser Ala Ala Val Lys Ser Leu Gly Arg Cys Leu Glu Arg

385 390 395 400

Glu Phe Asp Ala Glu Asn His Ser Gly Val Thr Lys Cys Gly Gln Leu

405 410 415

Phe Ser Ala Tyr Ala Thr Ser Ser Asp Val Asn Val Gly Ala

420 425 430

Claims

1.梅花的一种耐低温胁迫基因编码的蛋白、分离的梅花耐低温胁迫核酸分子、含有所述核酸分子的表达盒、含有所述核酸分子或所述表达盒的载体或含有所述核酸分子、所述表达盒或所述载体的重组菌在培育具有抗寒性的植物品种中的应用，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其包括：

将核酸分子送入目的植物细胞，所述分离的核酸分子含有所述耐低温胁迫基因；

将载体转化目的植物，所述载体含有所述耐低温胁迫基因；

将所述重组菌导入目的植物，所述重组菌含有所述耐低温胁迫基因。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其包括：在目的植物中过表达SEQ ID NO.1所示的内源PmMYB3R-5基因，使其编码蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其包括：对植物细胞、组织、个体或群体进行筛选，使其过量表达所述耐低温胁迫基因编码的蛋白。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的目的植物选自梅花、拟南芥、桃、小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱或荞麦。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的目的植物选自扁桃。