CN115960916A - 一种茶树wrky转录因子基因及其抗寒应用 - Google Patents
一种茶树wrky转录因子基因及其抗寒应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种茶树WRKY转录因子基因及其抗寒应用，所述基因为茶树TEA031948基因，所述茶树TEA031948基因的核苷酸序列如序列表Seq_1所示。所述茶树TEA031948基因编码的蛋白序列如序列表Seq_2所示。通过反义寡核苷酸技术抑制TEA031948的表达加重了茶树叶片在低温下损伤程度，而将该基因超量表达并转化拟南芥能够显著提高拟南芥的耐寒性，说明该基因可提高茶树抗寒性。该基因的克隆分析将有利于探究WRKY转录因子在茶树抗寒过程中的作用，推动茶树抗寒遗传改良进程，促进茶产业的可持续发展，本发明具有很大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种茶树WRKY转录因子基因及其抗寒应用。
背景技术
茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是我国重要的经济作物，其叶片制成的茶叶在我们乃至世界人民的日常生活、经济和文化交流方面扮演着重要的作用。近年来，受越冬期及初春“霜冻”和“倒春寒”等恶劣天气影响，茶树极易受到低温伤害，严重时甚至导致死亡，制约了茶叶产量和品质的提高。低温已逐渐成为限制茶树南种北移、茶叶产能增效的主要因素之一，极大地影响着茶树的产量和经济价值，影响了茶产业的健康可持续发展。近年来的研究表明，WRKY转录因子在植物生长发育，次级代谢以及产物合成和植物抗逆调控中扮演重要角色。特别地，前期研究发现WRKY在植物抗逆以及防御反应中发挥了积极的作用，广泛参与植物生物与非生物胁迫响应。然而，WRKY转录因子在茶树抗寒过程中的作用，鲜有报道。茶树作为一种喜温畏寒植物，低温严重制约了茶叶的品质以及茶产业的发展。随着茶树基因组数据的公布，为我们从分子水平解析茶树WRKY转录因子夯实了数据基础。利用生物信息学以及分子生物学对茶树WRKY转录因子进行分析验证，揭示茶树WRKY转录因子在茶树低温胁迫响应中的作用，为茶树的抗逆工程育种提供更好的基础与证据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种茶树WRKY转录因子基因及其抗寒应用，其丰富了茶树中转录因子的研究，为茶树抗寒机制提供了新思路，为实现茶树抗性性状育种提供了理论和实际参考基础。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种茶树WRKY转录因子基因。根据本发明的实施例，所述基因为茶树TEA031948基因，所述茶树TEA031948基因的核苷酸序列如序列表Seq_1所示。
另外，根据本发明上述实施例的一种茶树WRKY转录因子基因，还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述茶树TEA031948基因编码的蛋白序列如序列表Seq_2所示。
在本发明的另一方面，本发明提出了茶树表达载体TEA031948-pB2GW7，根据本发明的实施例，所述表达载体通过将Seq_1所示的片段酶切至载体pB2GW7获得。
在本发明的另一方面，本发明提出了茶树WRKY转录因子基因用于提升植物低温耐受性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明中，首次克隆并验证了一个调控茶树响应低温胁迫的WRKY类转录因子基因TEA031948，该转录因子在茶树响应低温胁迫过程中实现调控作用，影响茶树的抗寒性。本发明还提供了含有TEA031948基因的重组质粒、转基因工程菌。本发明丰富了茶树中转录因子的研究，为茶树抗寒机制提供了新思路，为实现茶树抗性性状育种提供了理论和实际参考基础。
附图说明
图1中，A为本发明实施例中茶树TEA031948基因在4℃低温处理下的表达模式图，B为本发明实施例中过表达拟南芥植株中TEA031948的表达水平图，C为本发明实施例中表达拟南芥植株和野生型在正常和低温处理下的表型图，D为本发明实施例中过表达植株和野生型拟南芥响应低温处理下的生存率和丙二醛含量图；
图2中，A为本发明实施例中利用反义寡核苷酸抑制茶树TEA031948基因表达并进行低温处理后植株受损情况图，B为本发明实施例中反义寡核苷酸体内抑制TEA031948后的表达水平图，C为本发明实施例中利用反义寡核苷酸抑制茶树TEA031948基因表达并进行低温处理后植株中丙二醛含量分析图，D为本发明实施例中利用反义寡核苷酸抑制茶树TEA031948基因表达并进行低温处理后植株的Fv/Fm值图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、TEA031948基因的克隆与序列结构分析
茶树TEA031948基因，为茶树WRKY类转录因子基因，其克隆与序列结构分析，具体如下：
进行序列克隆的茶树材料来源于国家级良种舒茶早，种植于安徽省合肥安徽农业大学国家高新技术农业园。取幼嫩叶片用于RNA的提取，总RNA的抽提采用RNAprep PurePlant Kit(Tiangen,Beijing,China)试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。
反转录生成第一链：取1μg RNA作模板，根据PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit(Takara Biotech,China)试剂盒说明配置，加入Oligo dT Primer(50μM)0.6μl，Random 6mers(50μM)0.4μl，dNTP Mixture(10mM each)1μl，RNase Free dH2O补足至10μl，65℃变性5min，立即在冰上放置。然后在上述反应液中加入5×PrimerScriptbuffer 4μl，RNase Inhibitor(40U)0.5μl，PrimerScript RTase(200U)1μl dH2O水补足20μl，42℃温育45min，95℃5min灭活反转录酶。经过优化后，取适量的反转录产物用于随后的PCR。以cDNA第一链作为模板进行反转录PCR，扩增TEA031948基因cDNA全长。根据茶树参考基因组(http://tpia.teaplant.org/)中TEA031948基因的序列设计扩增引物，上游引物为：(5’-ATGGACAAAGGGTGGGGCT-3’)，下游引物为：(5’-TCAGTTCACTGGAAAGCTGCC-3’)。25μlPCR反应体系为：10×Ex taq buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl，Mg2+1.5μl，上、下游引物各1μl，Extaq 0.2μl，模板1μl，ddH2015.8μl。反应程序如下为：98℃10sec，98℃10sec，57℃30sec，72℃2min，72℃10min，35个循环。PCR产物经纯化回收后，连接到pGEM-T Easy Vector载体(Promega，Shanghai，China)上得到pGEM-T Easy::TEA031948质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，然后进行Sanger测序，得到的TEA031948基因的核苷酸序列如序列表Seq_1所示，具体如下：
ATGGACAAAGGGTGGGGGCTCACCCTTGGTTCTGATTCAATTGGTTTTTTTCCAAATAAACCGGCCGGGTTGAGTTTAACTCCGAGATTGAACCGGAGCCGAGGCGGTATGTTTTCGGGAATTGAGTTTCCGGTTAGATTAAACCGGAAGGAAGAGCAGCACACTGCTCTGCAACCGTCTGATGAGAATCGGACGGTTGTCAACGAAGTCGACTTTTTCTGTGATAAGAAAAAATCGACAAAAGAGGATGATTATATGGATTCCAAAGCAAGTATTAGCCGTGTCAAGAAAGAGAATTCTCACGAAACTGGTCCCGGAATGGACTTGGATGTAAATACAGGTTTGCACCTTCGTACGACTAACACGGAAAGTGATCTGTCAACGGTGGACGATGGGATTTCATCCCACGTGGAAGATAAACGAGCTAAGATCGAGATGGCAGTATTGCAAGCTGAGGTTGAAAGAATGAATGCTGAAAACCAGAGGTTAAGAGGGATGCTCTCTCAAGTTAGCAACAATTACAGTGCTCTACAGTTACACTTAATTACATTAATGCAACAACAGCAACAACAACAGCAACAGCAGAGTTCAAGAGCCGAAGCCACTCACCAACATGAGATATTAGAAGCAAGGTCAGAAGATAAGAAACATGAGGGTGGTGGAGGACCAGTGGTGCCAAGACAATTCATGGACTTAGGACCAAGTGCCACAGCTGAGACAGATGATCAACCATCTCATTCTTCATCAGAAGAAAGAACACAATCAGCCTCACCTCATCCCAACAACAACAAAAAAGACATGGTTCCATTAGTTGGAAGAGAAGAGAGTCCAGAATCAGAAGGTTGGGTTCCCAATAAGGTTCCCAAATCGAATCCTTCTAAGACTAATGTTGATCAGGCCACTGAAGCTACCATGAGAAAAGCCCGGGTCTCCGTTCGAGCTCGCTCCGAAGCTCCCATGATCACTGACGGATGTCAATGGCGCAAGTATGGACAGAAGATGGCGAAAGGGAACCCATGTCCTCGAGCTTACTACCGGTGCACCATGGCGGTTGGTTGTCCAGTGCGCAAACAAGTTCAAAGGTGTGCCGAGGACAGAACAATCCTAATAACAACCTATGAAGGTACTCACAACCATCCCCTCCCTCCGGCAGCCATGGCAATGGCATCAACCACATCAGCTGCAGCAAGCATGCTACTTTCTGGCTCGATGTCAAGTGCAGACGGGCTCATGAACCCTGATTTCCTCGCTCGAGCAATCCTTCCATCCTCATCGAGCATGGCGACAATTTCAGCCTCAGCACCATTTCCAACAGTCACATTAGACCTAACCCACACTAGTCCCAACCCACTGCAATTCCAAAGACCCCCTACCCAATTTCCAGTCCCCTTCGCCTCTGTTCCAACCCCACCACAACCGGCGGCTCATGTCTTCGGGCAAGCCCTATATAACCAATCAAAATTCTCCGGCCTCCAACTTTCTCAAGATATAGATGCAGCCCAATTAGGTCACCAAGCTCCACCTCCACAATTGCACCACCAACAACCACCACCGAACCACTCATCATTTGCTGACACTCTTAGCGCCGCCACAGCCGCCATCACCGCAGATCCCAATTTCACCGCTGCTCTTGCTGCCGCCATCACCTCCATTATGGGCGGTGGTCAGCAGCCAAACAGCAACAATCCCACGACCACGGCTTCCACCACCACTACCACCAACACCACAACAAGCAATAGCAATAAGATTGGCAGCTTTCCAGTGAACTGA
TEA031948基因编码的蛋白序列，如序列表Seq_2所示具体如下：
MDKGWGLTLGSDSIGFFPNKPAGLSLTPRLNRSRGGMFSGIEFPVRLNRKEEQHTALQPSDENRTVVNEVDFFCDKKKSTKEDDYMDSKASISRVKKENSHETGPGMDLDVNTGLHLRTTNTESDLSTVDDGISSHVEDKRAKIEMAVLQAEVERMNAENQRLRGMLSQVSNNYSALQLHLITLMQQQQQQQQQQSSRAEATHQHEILEARSEDKKHEGGGGPVVPRQFMDLGPSATAETDDQPSHSSSEERTQSASPHPNNNKKDMVPLVGREESPESEGWVPNKVPKSNPSKTNVDQATEATMRKARVSVRARSEAPMITDGCQWRKYGQKMAKGNPCPRAYYRCTMAVGCPVRKQVQRCAEDRTILITTYEGTHNHPLPPAAMAMASTTSAAASMLLSGSMSSADGLMNPDFLARAILPSSSSMATISASAPFPTVTLDLTHTSPNPLQFQRPPTQFPVPFASVPTPPQPAAHVFGQALYNQSKFSGLQLSQDIDAAQLGHQAPPPQLHHQQPPPNHSSFADTLSAATAAITADPNFTAALAAAITSIMGGGQQPNSNNPTTTASTTTTTNTTTSNSNKIGSFPVN。
2、茶树TEA031948基因在低温胁迫处理下的表达分析
选择选取长势一致的舒茶早茶树枝条用于实验，放在4℃培养箱中，设置对照放在室温环境下，在不同的时间(0h、12h、48h和72h)采集对照和处理植株的一芽二叶，设置三个生物学重复，并用液氮进行冷冻保存于-80℃冰箱用于分析TEA031948基因的表达量。参照上述方法进行样品总RNA的提取以及cDNA第一链合成。反转录产物(cDNA第一条链)稀释30倍作为模板，使用HieffTM qPCR
Green Master Mix(No Rox)(Yeasen，Shanghai，China)，配制20μl反应体系：2.0μl稀释30倍的逆转录产物，上下游引物各0.4μl(10pmol/μl)，10μlHieffTM qPCR
Green Master Mix，7.2μl ddH20，每个反应配3个重复。然后在Bio-rad CFX-96仪器上以程序：①95℃5min②95℃10sec，60℃30sec，72℃30sec运行39个循环③从65℃到95℃，以0.1℃/sec绘制熔解曲线。上游引物为：(5’-GCTACCATGAGAAAAGCCCG-3’)，下游引物为：(5’-TCGGCACACCTTTGAACTTG-3’)，以茶树ACTIN基因为内参，(上游引物：5’-GCCATATTTGATTGGAATGG-3’，下游引物：5’-GGTGCCACAACCTTGATCTT-3’)。通过仪器自带分析软件，计算出TEA031948在对照和低温处理下的相对表达水平。
图1A为茶树TEA031948基因在4℃低温处理下的表达模式图，如图所示，茶树中TEA031948在低温处理下受低温诱导，呈现显著上调表达，说明其响应茶树低温胁迫，暗示TEA031948可能与茶树响应低温胁迫有密切关系。
3、TEA031948基因在拟南芥体内功能验证
(1)TEA031948-pB2GW7载体构建
选择测序正确的阳性克隆质粒1μl，并加入等量pB2GW7植物表达载体，最后加入1μlLR Clonase Mix，室温过夜后转化DH5α，测序验证。
(2)拟南芥遗传转化
取适量的野生型拟南芥种子加去离子水，置于4℃冰箱春化，春化处理72h之后播种。播种完覆盖保鲜膜，置于合适条件(湿度60％；温度23℃；光周期16h光/8h暗)下等待发芽。种子出芽之后，选取大小一致的苗进行移栽，正常培养。把TEA031948-pB2GW7载体冻融法转化到GV3101农杆菌当中，通过PCR鉴定阳性克隆。挑取含有目的基因的阳性菌落，在5mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃200r/min培养约24h；吸取培养过的菌液2ml，加入到100mL新鲜的含有相应抗生素的LB液体培养基，继续振荡培养至OD600约为1.0，离心收集菌体，用5％蔗糖溶液重悬菌体，终浓度OD600约为0.8，加入0.1％silwet L-77摇匀。拟南芥种植约一个月，植株开始陆续开花，挑选生长健壮的植株为待转化植株，转化前不断去除顶端花序，以使植株产生更多的花蕾,转化前一天需将待转化植株充分浇水。
将准备好的转化液装在容器内，轻轻把拟南芥花序浸泡在转化液当中约30sec，然后黑暗放置24h，然后正常培养直至收获种子。将收获的拟南芥种子至于离心管中，先用1ml75％的乙醇灭菌1min,再用10％的NaClO灭菌5min，然后用无菌水冲洗5-6遍，用枪头吸取种子，播于含有Basta的MS固体培养基上。4℃黑暗条件下春化72h，转移至培养室，温度23℃；光周期16h光/8h暗条件下培养。约两周后，选取叶片绿色、根系发育正常的抗性植株移植到栽培基质中继续培养。移植前栽培基质充分吸水，移植后覆盖保鲜膜，约3d去除，以后管理同上，收获T2代种子用于实验。提取拟南芥苗期DNA和RNA，利用基因特异引物进行PCR检测目的基因表达。将转基因植株在-6℃培养2h后取出培养皿，4℃黑暗培养12h后转入正常培养室培养，4天后观察幼苗存活情况。
图1B-D是TEA031948在拟南芥过表达株系和野生型中的表达分析以及过表达株系在低温处理下的表型分析。如图所示，可以看到在拟南芥中过表达TEA031948后，转基因型(OE)植物中TEA031948基因的表达量均显著高于野生型(WT)植株。对TEA031948的两株过表达株系分别进行-6℃低温处理2h，结果发现转基因型株系的存活率要显著高于野生型、丙二醛含量比野生型低，说明过表达TEA031948能提高拟南芥对低温的耐受性。
4、TEA031948基因在茶树体内功能验证
(1)反义寡核苷酸抑制实验
根据TEA031948序列设计合成寡核苷酸反义的引物，设计在网站http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/soligo.pl上完成，引物序列如所示：
P1：(5’-CGGCCGGTTTATTTGGAAAA-3’)；
P2：(5’-TCGATCTTAGCTCGTTTATC-3’)；
P3：(5’-ACTAGTGTGGGTTAGGTCTA-3’)；
用灭菌水溶解，配制并获得反义寡核苷酸抑制引物溶液，空白为灭菌水；取生长大小基本一致，颜色鲜艳，色泽健康，无虫无病的一芽二叶，插入装有1ml 20μM引物溶液1.5ml离心管中，要确保一芽二叶尾部没入溶液中。将离心管放入光照培养箱中按光照16h/黑暗8h进行光照培养，培养箱温度为25℃。处理12h后分别对引物处理样和空白样取样进行基因表达分析。
(2)反义寡核苷酸抑制影响茶树基因表达分析
对处理样品和对照样品分别提取总RNA，然后进行反转录，合成第一链cDNA，用定量PCR检测相关基因表达。对对照和处理样品中TEA031948的基因表达水平进行检测，结果显示TEA031948的反义寡核苷酸抑制能显著干扰目的基因表达水平。
(3)反义寡核苷酸抑制样品低温处理及生化指标测定
为了研究TEA031948在茶树低温胁迫中的作用，将反义寡核苷酸抑制引物处理12h的样品置于0℃处理1h，恢复室温30min，观察叶绿素荧光变化以及Fv/Fm数值变化。低温处理后的丙二醛含量测定按照试剂盒(货号：BC0020)(Solarbio，Beijing，China)方法检测。取新鲜研磨的样品粉末约0.1g，加入1ml提取液进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测。实验组中和对照组中依次加入MDA检测工作液600μl、待测样品200μl、试剂三200μl，混合液在100℃水浴中保温60min后，置于冰浴中冷却，10000g常温离心10min。取上清至1ml玻璃比色皿中，测定各样本在450nm、532nm和600nm处的吸光度，分别计算ΔA450＝A450测定-A450空白，ΔA532＝A532测定-A532空白，ΔA600＝A600测定-A600空白。MDA含量(nmol/g)＝5*[6.45*(ΔA532-ΔA600)-1.29*ΔA450]/W。
图2为利用反义寡核苷酸抑制茶树TEA031948基因表达植株低温处理下的叶绿素荧光图、Fv/Fm值以及丙二醛含量分析图。如图所示，可以看到反义寡核苷酸抑制实验中TEA031948的表达量和对照相比被显著抑制。经过低温处理后，抑制TEA031948基因表达的植株受损更加严重，Fv/Fm比值显著降低，丙二醛含量显著上升，说明TEA031948基因的体内表达抑制显著降低了茶树的低温耐受性。
综上所述，茶树TEA031948基因的表达响应茶树低温胁迫，将该基因超量表达转化拟南芥能够提高其耐寒性。在茶树体内通过反义寡核苷酸技术抑制TEA031948的表达，发现茶树叶片在低温下损伤更加严重，表明TEA031948可参与茶树响应低温胁迫，提高茶树的耐寒性。该基因的克隆不仅将有利于探究WRKY转录因子在茶树抗寒过程中的作用，而且有助于推动以增强茶树抗寒为目标的遗传改良进程，促进茶产业的可持续发展，本发明具有很大的应用价值。
本发明中，首次克隆并验证了一个调控茶树响应低温胁迫的WRKY类转录因子TEA031948，该转录因子在茶树响应低温胁迫过程具有增强茶树低温耐受性的功能。本发明还提供了含有TEA031948基因的重组质粒、转基因工程菌。本发明丰富了茶树中转录因子的研究，为茶树抗寒机制提供了新思路，为实现茶树抗性性状育种提供了理论和实际参考基础。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种茶树WRKY转录因子基因，其特征在于：所述基因为茶树TEA031948基因，所述茶树TEA031948基因的核苷酸序列如序列表Seq_1所示。
2.根据权利要求1所述的一种茶树WRKY转录因子基因，其特征在于：所述茶树TEA031948基因编码的蛋白序列如序列表Seq_2所示。
3.茶树表达载体TEA031948-pB2GW7，其特征在于：所述表达载体通过将Seq_1所示的片段酶切至载体pB2GW7获得。
4.茶树WRKY转录因子基因用于提升植物的低温耐受性。
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