CN107119057B - 一种橡胶树开花调控基因HbFT2及其克隆与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树开花调控基因HbFT2，并进一步公开其克隆与应用。本发明所述橡胶树开花调控基因HbFT2的cDNA包括如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明首次在巴西橡胶树中获得橡胶树开花调控基因HbFT2的全长cDNA，并通过橡胶树HbFT2基因组织特异性表达分析。

Description

一种橡胶树开花调控基因HbFT2及其克隆与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树开花调控基因HbFT2，并进一步公开其克隆与应用。

背景技术

高等植物生命周期主要包括种子萌发、营养器官生长、开花、受精、胚胎发育和种子形成等过程。其中，开花过程涉及由营养生长向生殖生长的转换、花器官的发生，以及在环境因子作用下内部各种信号的产生、传递和相互作用等，在植物生命周期中占有中心地位，并与农作物产量以及品质密切相关。

开花诱导即植物由营养生长向生殖生长转换的过程，它受内源发育信号和环境因子的严格控制，开花诱导由一种复杂的信号途径“网络”形成，是一个非常复杂的过程。根据近年来对拟南芥、金鱼草、玉米等几种模式植物的开花调控信号途径的研究，尤其是对拟南芥的研究，提出影响植物的生长发育及开花的4个主要的生物学途径调控，包括自主调控途径(Autonomous pathway)、春化途径(Vernalization)、GA调控途径(Gibberellic acid)和光周期调控途径(Photoperiod)。其中自主调控途径和GA调控途径为植物主要内在调控因素，而春化途径和光周期调控途径则是外界主要的调控因素。

FT(FLOWERING LOCUS T)基因是花期调控途径中的关键基因。它位于花发育途径中的汇集点，整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号，在植物花发育中发挥着重要作用。FT蛋白是成花素的主要组成部分，在不同的开花遗传途径中，上游关键基因调控FT基因，使FT蛋白从韧皮部移动到茎顶端分生组织(SAM)，与带碱性亮氨酸拉链蛋白(basic region-leucine zipper，b-ZIP)转录因子FD(FLOWERING LOCUS D)在茎尖通过蛋白质的相互作用来促进成花转变，并通过转录激活花分生组织特性基因AP1(APETALA1)来启动花发育过程。

拟南芥的FT基因属于FT/TFL1基因家族，又称为磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyletha nolamine-binding protein，PEBP)基因家族，因其蛋白易与磷脂酰乙醇胺结合而得名。拟南芥FT基因受到光周期调控，ft突变体长日照环境下延迟植物开花(Kobayashi Y,Kaya H,Goto K,et al.1999.A pair of related genes withantagonistic roles in mediating flowering signals.Science 286,1960-1962.)。FT同源基因PtFT1转基因杨树在很短时间即可表现出开花表型，同时还能够可以抵制短日照条件下诱导的生长停止和芽休眠的现象的发生(Bohlenius H,Huang T,Charbonnel-Campaa L,et al.2006.CO/FT regulatory module controls timing of flowering andseasonal growth cessation in trees.Science 312,1040-43.)。杨树FT2也被证明具有促进开花的作用，同时受到光周期的调控而调控杨树季节性开花的功能(Hsu CY,Liu Y,Luthe DS et al.2006.Poplar FT2shortens the juvenile phase and promotesseasonal flowering.The Plant Cell 18,1846-1861.)。西红柿FT同源基因SFT调控多个不同的发育过程，比如开花转变、叶片的成熟、茎的伸长等(Shalit A,Rozman A,Goldshmidt A,et al.2009.The flowering hormone florigen functions as a generalsystemic regulator of growth and termination.Proc.Nati.Acad.Sci.USA.106,8392-8397.)。美洲黑杨(Populus deltoides)中PdFT1和PdFT2因具有不同表达模式推测具有不同生物学功能(Igasaki T,Watanabe Y,Nishiguchi M,et al.2008.The FLOWERING LOCUST/TERMINAL FLOWER 1 family in Lombardy poplar.Plant and Cell Physiology 49,291-300.)。在梨树中，根据表达分析推测PcFT1具有促进开花的功能，而PcFT2则可能调控梨树的叶片的衰老和芽的休眠。过表达PcFT2基因在烟草中能够引起烟草早花表型的产生，嫁接研究表明PcFT2蛋白具有可移动性。然而转PcFT2基因的梨树却不能表现早花表型，而是在延迟因短日照和低温引起的叶片脱落和芽的休眠(Freiman A,Golobovitch S,Yablovitz Z,et al.2015.Expression of flowering locus T2 transgene from Pyruscommunis L.delays dormancy and leaf senescence in Malus×domestica Borkh,andcauses early flowering in tobacco.Plant Science 241,164-176.)。甜菜中BvFT1行使开花抑制功能，其表达受到春化处理的抑制，而BvFT2则为开花促进者(Pin PA,BenllochR,Bonnet D,et al.2010.An antagonistic pair of FT homologs mediates thecontrol of flowering time in sugar beet.Science 330,1397-1400.)。可见，FT不仅在成花转变过程中起重要作用，而且还参与调节生长发育的一些过程。

天然橡胶一直是我国重要的战略物资和储备资源，目前在我国，橡胶树新品种的选育仍然是以传统的人工授粉育种为主。由于橡胶树生长缓慢，从胚后发育的童期到开花需要5-8年时间，而且有些性状只有在成年期才能表现出来，这将严重阻碍橡胶树育种的进程。目前，对橡胶树尤其是巴西橡胶树的成花机理与相关基因克隆和功能研究还未见报道。对橡胶树开化调控基因的克隆及其生物学功能的研究和探索，明确其在橡胶树开花转变过程中的作用，为利用分子育种技术加快橡胶树新品的培育奠定基础。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种橡胶树开花调控基因HbFT2，并进一步公开其克隆与应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种橡胶树开花调控基因HbFT2，所述基因HbFT2的cDNA包括如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

所述的橡胶树开花调控基因HbFT2，所述基因HbFT2的cDNA核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。

本发明还公开了一种所述的橡胶树开花调控基因HbFT2编码的蛋白，包括如SEQID No：2所示的氨基酸序列。

具体的，所述的橡胶树开花调控基因HbFT2编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示。

本发明还公开了一种橡胶树开花调控基因HbFT2，所述基因HbFT2的基因组DNA包括如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列。

所述的橡胶树开花调控基因HbFT2，所述基因HbFT2的基因组DNA核苷酸序列如SEQID No：3所示。

本发明还公开了一种含有所述的橡胶树开花调控基因HbFT2的重组植物表达载体，所述表达载体为重组质粒pXCS-HbFT2。

所述重组植物表达载体中的载体为pMD19-T载体。

本发明还公开了一种克隆所述的橡胶树开花调控基因HbFT2的方法，包括如下步骤：

(1)以巴西橡胶树的叶片和花序cDNA混合为模板，设计如下引物进行PCR扩增，获得HbTF1基因开放阅读框；

HbFT2OF：GGAATTCATGCCTAGAGATCCTCTGGTT；

HbFT2OR：CCCCCCGGGTTGTCCTCGCCTTCTT；

(2)以HbTF1基因开放阅读框为基础，设计如下引起合成5’UTR及3’UTR；

HbFT2-5UF：TGGAAAGCATATTGGCATAGAAAGT；

HbFT2-5UR：CCTTAAATCATCTCCACCTACATCA；

HbFT2-GSP3^1st：CGAAGACAGACAATCAACCCACC；

HbFT2-GSP3^2nd：GAAACTGCTGCAAGAAGACGCTAAC；

(3)根据5’UTR和3’UTR的获得，设计如下特异引物，进行目标基因HbFT2全长的扩增；

HbFT2-F：TGGAAAGCATATTGGCATAGAAAGT；

HbFT2-R：GCATAATTATACTTGTATATCTTTTAAATTTATTTGTATAT。

本发明还公开了所述的橡胶树开花调控基因HbFT2用于制备促进橡胶树提前开花的促进剂的应用。

本发明首次在巴西橡胶树中获得橡胶树开花调控基因HbFT2的全长cDNA，并通过橡胶树HbFT2基因组织特异性表达分析，HbFT2基因主要在繁殖器官中表达，尤其是在花序发育过程中，HbFT2基因在开花的雄花中的表达量显著高于花序原基，与拟南芥中FT基因表达一样。

通过对拟南芥野生型遗传转化表明，HbFT2基因在野生型拟南芥中过表达可有效的促进开花，同时又能弥补ft-10突变体的缺陷表型。总之，HbFT2可能参与调控橡胶树开花和繁殖器官的发育。因此该基因可作为巴西橡胶树非常有用的开花调控候选基因，可通过功能获得突变或者功能缺失突变研究实现对橡胶树开花的有效调控。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为HbFT2基因的组织特异性表达分析(10龄树根，茎，古铜叶，变色叶，淡绿叶，稳定叶，芽，第一发育阶段的花序，开花的雄花，开花的雌花，果皮及种子)；

图2为HbFT2基因在两个不同树龄橡胶树不同季节的表达模式；

图3为不同光周期对HbFT2基因表达的影响；

图4为不同温度对HbFT2基因表达的影响；

图5为橡胶树HbFT2基因转化野生型拟南芥的功能验证；

图6为HbFT2基因对ft-10突变体表型恢复验证实验。

具体实施方式

下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1巴西橡胶树开花调控基因HbFT2的获得

分析已在NCBI登陆的拟南芥、蓖麻的FT基因的cDNA序列，通过搜索建立的橡胶树叶片转录组数据库，通过同源比对的方式获得的片段信息，然后进行拼接，再预测开放阅读并设计特异引物获得包含有完整开放阅读框的DNA序列和cDNA序列。具体方法如下：

(1)HbTF2基因开放阅读框的获得

基因特异性引物设计如下：

HbFT2OF：GGAATTCATGCCTAGAGATCCTCTGGTT；

HbFT2OR：CCCCCCGGGTTGTCCTCGCCTTCTT。

以巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育)叶片和花序cDNA混合为模板(以随机引物反转录获得)，以HbFT2OF和HbFT2OR为引物，其终浓度为0.4μmol/L，在20μl反应体系中进行PCR扩增。

PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。将扩增产物与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌EHA105中并测序。最后，获得HbFT2的完整开放阅读框。

(2)5’及3’端UTR

按照SMART^TM cDNA Library Construction Kit说明书进行构建RACE cDNA文库(试剂盒购自Clontech公司)，5’UTR通过5’RACE获得，所用的接头引物共有3条，分别为：

QT：

CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTT；

Q1：GAGGACTCGAGCTCAAGC；和

Q0：CCAGTGAGCAGAGTGACG。

5’RACE操作流程参照文献(迪芬巴赫C W，德维克斯勒G R.PCR技术实验指南.黄培堂译.北京:科学出版社,1998:268-277)。根据HbFT2的cDNA序列设计2条引物分别为：

HbFT2-5UF：TGGAAAGCATATTGGCATAGAAAGT；

HbFT2-5UR：CCTTAAATCATCTCCACCTACATCA。

具体扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。

HbFT2的3’UTR通过3’RACE获得：所用的接头引物与5’RACE用到的3个接头引物一样，同时3’RACE操作流程也是参照文献(迪芬巴赫C W，德维克斯勒G R.PCR技术实验指南.黄培堂译.北京:科学出版社,1998:268-277)。先用QT引物作为反转录引物，反转录程序按反转录照说明书进行。之后分别以如下HbFT2基因的GSP3^1st和Q0为引物分别进行3组第一轮PCR，之后分别以50倍稀释PCR产物作为第二轮PCR的模版。进行第二轮PCR时，再分别以这2个基因的如下GSP3^2nd和Q1组合为引物对进行第二轮PCR，产物通过电泳挖胶获得；

HbFT2-GSP3^1st：CGAAGACAGACAATCAACCCACC；

HbFT2-GSP3^2nd：GAAACTGCTGCAAGAAGACGCTAAC；

扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。5’及3’端RACE产物分别为122bp和113bp，产物经切胶纯化后，并进行克隆测序。

(3)HbFT2基因全长的克隆

根据5’和3’UTR的获得，再次设计能够扩增全长的特异引物：

HbFT2-F：TGGAAAGCATATTGGCATAGAAAGT；

HbFT2-R：GCATAATTATACTTGTATATCTTTTAAATTTATTTGTATAT。

以橡胶树叶片和花序cDNA混合为模版，进行目标基因HbFT2全长的扩增。

扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。获得的PCR产物与pMD19-T连接并进行测序，测序表明上述获得的片段即为本发明所需的橡胶树开花调控基因，记为HbFT2，该片段具有序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，

其全长为971个核苷酸，包含一个长度为528个核苷酸的开放阅读框(ORF，自序列1的5＇端第147-674位核苷酸序列)、146个核苷酸的5’-UTR(自序列1的5’端第1-146位核苷酸序列)和297个核苷酸的3’-UTR(自序列1的5’端第675-971位核苷酸序列)，编码一个长度为120个氨基酸(序列表中SEQ ID No：2)。

同时以巴西橡胶树热研7-33-97叶片基因组DNA为模板，进行PCR扩增(程序同上所述)，测序结果表明获得橡胶树开花基因的基因组DNA序列，该序列具有序列表中SEQ IDNo：3的核苷酸序列，共3089个核苷酸，包含了三个长度分别为317、1280和521个核苷酸的内含子(自序列3的5’端第341-657、720-1999和2041-2561位核苷酸序列)。

实施例2橡胶树HbFT2基因组织特异性表达分析

本研究选取3月份采集的橡胶树7-33-97的10龄树的各个营养组织和繁殖器官(包括根、茎、古铜叶、变色叶、淡绿叶、变色叶、稳定叶、芽、第一发育阶段的花序、开花的雄花、开花的雌花)和8月份采集的果皮和种子，分别提取它们的RNA备用。

对上述所获得的RNA进过DnaseI消化后按照反转录试剂盒进行反转录。通过荧光定量技术进行目标基因组织特异性表达分析。

定量引物为：

HbFT2-QF：ATCTTTCTACCATTTGACCCCATA；

HbFT2-QR：ATAACTCGCCCGCTTGTAATCT。

如图1所示的结果显示，HbFT2基因主要在繁殖器官中表达，其中在种子种表达最高，然而在营养器官中表达量很低。

实施例3 HbFT2基因在两个不同树龄橡胶树不同季节的表达模式

以2龄树和10龄树的稳定叶为研究对象，从3月份开始采集材料，每个月采集一次，直至11月份为止。之后对HbFT2基因进行荧光定量分析，定量引物同前述组织特异性表达分析引物。

如图2所示结果显示，HbFT2基因在两个不同树龄橡胶树中表现出相似的表达模式，而且主要在3月份、7月份和11月份表达。3月份是橡胶树主开花期，其间HbFT2基因在叶片中的表达量逐渐降低，在4到7月份期间又逐渐升高，8月份时回到低谷，9月份以后10龄树中的HbFT2基因表达量开始逐渐升高，而2龄树中HbFT2基因到10月份才开始升高。

实施例4不同光周期对HbFT2基因表达的影响

将长势一样的40株3个月大的小苗平均分成两组，每组20株。其中一组培养在28℃长日照环境(16h光照/8h黑暗)；另外一组则培养在28℃短日照环境(8h光照/16h黑暗)。在两种环境下培养30天后，两组植株的叶片分别在一天之内(24h)每两个小时采集一次，一共采集12次。荧光定量分析同上。

如图3所示结果显示，HbFT2基因在长日照和短日照环境下皆表现出相似的表达模式。在两种光周期条件下，从早上8点到下午16点，HbFT2基因的表达量都十分微弱，16点后，长日照环境下的表达量达到最高，而短日照环境下的表达量却仍然持续升高，直到晚上22点为止，此时HbFT2基因的表达量最高。从凌晨2点开始，HbFT2基因的表达量回到并一直保持着比较稳定的低表达水平。

实施例5不同温度对HbFT2基因表达的影响

将40株3个月大的小苗平均分成两组，每组20株。第一组植株种植在一个培养箱，里面设定28℃、32℃和36℃三个温度时段；另外一组则培养在另外一个培养箱里，里面分别设定28℃、24℃、20℃、16℃和8℃五个温度时段。每个温度持续3天，然后依次调到下一个温度。为了避免光周期和生物钟可能对HbFT2表达的影响，统一在每天早上10点准时采样。

如图4所示的结果显示，在28℃时，HbFT2基因表达量达到最高，当温度高于或者低于28℃时，其表达量会受到抑制，由此说明，28℃是橡胶树HbFT2基因表达的最适合的诱导温度。

实施例6橡胶树HbFT2基因转化野生型拟南芥的功能验证

利用pXCS植物表达载体(由中国热带农业科学院橡胶研究所保存)与HbFT2基因连接构建转化拟南芥野生型转化载体。具体实施方案如下：

分别设计构建植物表达载体的目标基因的引物：所用到的用于构建植物表达载体的引物即为实施例1中所述基因的特异引物，其中基因的正引物5’端分别加有EcoRI酶切位点，反引物5’端分别加有XmaI酶切位点。获得的PCR产物与pMD19-T载体连接并进行测序。最后，提取测序正确的质粒，用EcoRI和XmaI分别双酶切pXCS和测序正确的质粒，通过T4DNA连接酶构建HbFT2目标基因的植物表达载体，并命名为pXCS-HbFT2。

对于野生型拟南芥的侵染，参照文献(Clough S J and Bent A F.1998.Floraldip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J 16,735-743.)获得的T0代种子，先将其用自来水浸泡，并放置于4℃环境暗室里春化3天。之后播撒在经1/2M培养基浸泡过的蛭石上面于22℃长日照环境生长(16h/8h)，待小苗发芽时，用浓度为10mg/L的除草剂进行喷洒，以便筛选抗性植株。10天后，将生长正常的小苗移栽到营养土(营养土：蛭石＝2：1)中生长并等待收种。阳性植株的检测通过southern方法，此方法参照文献(Blanc G,Baptiste C,Oliver G,MartinF,Montoro P.2006.Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformationof embryogenic calli and regeneration of Hevea brasiliensis MüllArg.plants.Plant Cell Rep 2006,24,724-733)。

将基因T3代转基因植株分别和野生型在相同环境中培养，并比较对它们进行开花表型比较，结果见图5及表1。

表1 35S::HbFT2的转基因拟南芥和野生型开花比较

*表示0.01<P<0.05；**表示P<0.01.

结果显示，所有35S::HbFT2/wt的野生型转基因株系都能表现出不同程度的早花表型，野生型植株25天左右开花，而转基因株系在17-19天开花，开花时间和轮座叶数目确实比野生型的要少。

实施例7 HbFT2基因对ft-10突变体表型恢复验证实验

将构建好的HbFT2目标基因植物表达载体转化拟南芥ft-10突变体中，参照文献(Clough，S.J.and Bent，A.F.(1998)Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16:735-743.)。获得的T0代种子，先将其用自来水浸泡，并放置于4℃环境暗室里春化3天。之后播撒在经1/2M培养基浸泡过的蛭石上面于22℃长日照环境生长(16h/8h)，待小苗发芽时，用浓度为10mg/L的除草剂进行喷洒，以便筛选抗性植株。10天后，将生长正常的小苗移栽到营养土(营养土：蛭石＝2：1)中生长并等待收种。

ft-10突变体转基因植株分别和野生型、ft-10突变体植株在相同环境中培养，并分别比较它们和野生型，ft-10突变体植株的开花表型，结果见图6和下表2。

表2 35S::HbFT2的ft-10突变体转基因拟南芥和ft-10突变体以及野生型开花比较

*表示0.01<P<0.05；**表示P<0.01.

结果显示，ft-10突变体植株开花时间为42天左右，而ft-10突变体转基因植株都不同程度的出现了比ft-10突变体更早的早花表型，且选取的6株35S::HbFT2/ft-10转基因株系甚至表现出比野生型拟南芥还要早的开花表型并长出更少的轮座叶。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所

<120> 一种橡胶树开花调控基因HbFT2及其克隆与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 971

<212> cDNA

<213> 橡胶树属橡胶

<400> 1

TGGAAAGCAT ATTGGCATAG AAAGTAAAAG CTGGATACCT CAGAACAATA TATAAATACC 60

TAATGTATGT GATTGAATTT CATAGCTAGC AACAACCCAT CAACAGAATA ATATTACTGC 120

TCCACTTGTG CTTCTCCTAT TTGAAAATGC CTAGAGATCC TCTGGTTGTT GGACGTGTGG 180

TAGGGGATGT TTTGGATCCC TTCACAAGGT CTATTTCTCT TCATGTCACT TACAATAACA 240

GAGATCATGT CAACAATGGC TGTGAGCTCA AACCCTCTCA AGTTGTCAAC CAACCTAGGG 300

TTGATGTAGG TGGAGATGAT TTAAGGATCT TCTACACTTT GGTCATGGTG GACCCTGACG 360

CTCCTAGCCC CAGTGACCCT ACTCTCAGAG AATACTTGCA TTGGTTGGTG ACCGATATTC 420

CAGCAACTAC AGGAGCAGGC TTTGGGCAGG AGGTTGTGTG CTATGAGAGT CCACGGCCGT 480

CGGTGGGGAT TCATCGGTTT GTTTTCGTAT TATTCCGGCA ACTAGGGAGG CAGACTGTGT 540

ATGCACCTGG GTGGCGTCAG AATTTTAACA CTAGGGACTT TGCTGAGCTT TACAATCTTG 600

GATTGCCGGT GGCCGCTGTT TACTTTAACT GCCAGAGGGA GAGTGGCTCC GGGGGAAGAA 660

GGCGAGGACA ATAATTATAA TTAATTTAAT TATAATGGCC TGCATGTCTC CAATCAATGT 720

ATTTTCCACT AAAAGATCTT TCTACCATTT GACCCCATAT GTGCCATGAA AAAGGAAGGG 780

AAAGGGAAAA TAAATAAAGA AACAAAGTAA TAATAAAGAA GGGAAGATTA CAAGCGGGCG 840

AGTTATATAT GCTCTGTATC TCCAACTAGC TACATATAGC TGGATTCCTA ATGGCTCGAA 900

TAGGTGTAAT ATATCTAGCT ATATTAACAT ATATACAAAT AAATTTAAAA GATATACAAG 960

TATAATTATG C 971

<210> 2

<211> 175

<212> PRT

<213> 橡胶树属橡胶

<400> 2

Met Pro Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Arg Val Val Gly Asp Val Leu

1 5 10 15

Asp Pro Phe Thr Arg Ser Ile Ser Leu His Val Thr Tyr Asn Asn Arg

20 25 30

Asp His Val Asn Asn Gly Cys Glu Leu Lys Pro Ser Gln Val Val Asn

35 40 45

Gln Pro Arg Val Asp Val Gly Gly Asp Asp Leu Arg Ile Phe Tyr Thr

50 55 60

Leu Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asp Pro Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro Ala Thr Thr Gly

85 90 95

Ala Gly Phe Gly Gln Glu Val Val Cys Tyr Glu Ser Pro Arg Pro Ser

100 105 110

Val Gly Ile His Arg Phe Val Phe Val Leu Phe Arg Gln Leu Gly Arg

115 120 125

Gln Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe Asn Thr Arg Asp

130 135 140

Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val Tyr Phe

145 150 155 160

Asn Cys Gln Arg Glu Ser Gly Ser Gly Gly Arg Arg Arg Gly Gln

165 170 175

<210> 3

<211> 3089

<212> DNA

<213> 橡胶树属橡胶

<400> 3

TGGAAAGCAT ATTGGCATAG AAAGTAAAAG CTGGATACCT CAGAACAATA TATAAATACC 60

TAATGTATGT GATTGAATTT CATAGCTAGC AACAACCCAT CAACAGAATA ATATTACTGC 120

TCCACTTGTG CTTCTCCTAT TTGAAAATGC CTAGAGATCC TCTGGTTGTT GGACGTGTGG 180

TAGGGGATGT TTTGGATCCC TTCACAAGGT CTATTTCTCT TCATGTCACT TACAATAACA 240

GAGATCATGT CAACAATGGC TGTGAGCTCA AACCCTCTCA AGTTGTCAAC CAACCTAGGG 300

TTGATGTAGG TGGAGATGAT TTAAGGATCT TCTACACTTT GGTAACTTCT TCTCCTTCTT 360

TCATACAGTA TGTTATGTGC ATTTGGTTCC TATCCTTCGA TTTTTTACTT GTAAGATATC 420

CAATGGGGGA GATTAAGGGG CAAGAGGCCC AAAATTTCTC AAGATTTCCT TCTCACCATA 480

AACTTCTGTT AATCTCTATA TAACTAGTTT GCTATATTAT TAAAACAACT AAAATTACAG 540

TCATCATATA TATTTAAAAC TAAACATGTT ATAGTTATTT GGCTGATTGG CCTCCAAAAC 600

TAAATATTCT AGCAGCTCAG CCATAGATTG ATTATGATAT TTTATTCCCT CGCTTCAGGT 660

CATGGTGGAC CCTGACGCTC CTAGCCCCAG TGACCCTACT CTCAGAGAAT ACTTGCATTG 720

GTACGTGGAT TCCCTCTCTT CCTCTCTCAC ATGCACATAT ACACAGTTTT TTCTTCATGT 780

GCTGCTTGTC AGAGGGATGA ATTTTCTGTT CTTTCAATTC ACACACAAAT CAAATTCATA 840

CAGATATATA TATATATATA TATATAGATG CAAAGAACTT CAAAAAAAAA AAAAGAAAGA 900

AATCCATGAA TAGAACCTCT TGAAATGGGT GAATAGATTT AGAGAAATAA TGGTAGTTGC 960

CAACTTACAG TAATGGAAAT GATCGAGCCC CATACGAAAA CTGAAGAGGC CATCTATAGA 1020

AATAGAGATG TGGTAGTGCC ACCTTACAAA TTAACATATA TATTACAATT GTTTTGCTGT 1080

TTTGCTTCTT GAAATAGACA TATACCAGCC TTCTTCTAAT CCTCTCCGTA ACTTCTTTTT 1140

TAAGCTTACA GCTATTGATT GATTGCACGT ATCTTTATTT CTTTGTTTCT TTCTTCTTCT 1200

TCGTCTTCTT CTTCTATTAT TTCTTTCATA TCATCTGATG GGCAGACGCA TCTTTCAAGA 1260

GCTAAAAGAA TCATGAATAT ATGAAGTGGG TAAGGACCGC AAAGAATTTA ACAAAAGTAG 1320

ATTTTGGTTT ACTAGGTTTC CAGGATAATC GTCGGGTCCC TACATGTGCT CTGTGATTCT 1380

GTGTACAATT CACAAACTAC TTTTCTTTCT TTCTTTTCCT TCAGTTGTCA GTTTGTTTCT 1440

TTCTTTATTT CAATTTTTTT TGTGGGTCTT ACATATGAAT TATCATGATC ATTCCTTGGA 1500

TTTTCTCTCC TCTATTTTTC CCTAGTTTTA TTTTATTATT TTTAATATGG AACTTATTTG 1560

AGCACGTCAA CAATATTTTT CTACAACATA TATAGGTCGT ATTCTTTATT GTTCAATGTC 1620

CAGCGTGTAG AATTATTGTA GACTTGCATG TCTTTACTTT AAGCAACAAT CAATATCACT 1680

TGATATGAAG TGTTGAAAGA CTATACAATT GAGCACTTAA ATATTTATCT TGTGACATAA 1740

ATATTTTTTT TTTCTCTCTT TTAAAAACTC GAAAAAAAAA AAAAAAAACG ACTCATGGAT 1800

GACGTAAAAT TCCCCTCACC ATCTATGTGG GTTCTATGAG ATTTATGTTT TATCTGCATA 1860

AGACGTTGCA TATCAAATAT ATATGTAGAA TACAAATCGA AATGATTTAG TGAATTGTAG 1920

GGCAATAGAT GGGATACTTT CTTTCTTTTC TTTTCTTTTC TTTACATGAA TTTGTTAGCT 1980

TTTCCTTTAA CTTTTTATAG GTTGGTGACC GATATTCCAG CAACTACAGG AGCAGGCTTT 2040

GGTGAGTGCA TATATATTTT TTTAGGATAA TAAAAATTTT AAAAATAGAT ATTAATAAAG 2100

CACTTTTACT TAATAGCCAA TCGATGTAGG ACTTAATGCA CTCTTTCATG TTCACATCTT 2160

ATGCATCAAG TTTGCAACAT TTAACATATA TACACTCACA CACACTTCGT TGAAACAATT 2220

AGAATACAGG AAAGAAAGAA AGAAAGAAAG AGAGAAATTC TTTATTTCCT TTTCCTTTTT 2280

CCCGAATCTT CATCTTGTAG ATATCAAATG TGAGGCTGAA ATTTTTGTTG CCATGCATCA 2340

ATATCAATCT CAATCAACCT CCCACCACTA TATTTTTTTA TCACATGGTT GTCTGAGAAT 2400

AACAAATCTT ATCAACCTAC GAAAGGAGAA GATTCTCTCT TTCTGGAACA TAAGAGATTC 2460

TTAAAAATAA ACAAGGAAAA TATCATTTAT TTATTTATTT TTTCTTTCGT GAGACTTTAT 2520

ACATCTAGAT TAAACAATTA AATATTCATG TATATATTGT AGGGCAGGAG GTTGTGTGCT 2580

ATGAGAGTCC ACGGCCGTCG GTGGGGATTC ATCGGTTTGT TTTCGTATTA TTCCGGCAAC 2640

TAGGGAGGCA GACTGTGTAT GCACCTGGGT GGCGTCAGAA TTTTAACACT AGGGACTTTG 2700

CTGAGCTTTA CAATCTTGGA TTGCCGGTGG CCGCTGTTTA CTTTAACTGC CAGAGGGAGA 2760

GTGGCTCCGG GGGAAGAAGG CGAGGACAAT AATTATAATT AATTTAATTA TAATGGCCTG 2820

CATGTCTCCA ATCAATGTAT TTTCCACTAA AAGATCTTTC TACCATTTGA CCCCATATGT 2880

GCCATGAAAA AGGAAGGGAA AGGGAAAATA AATAAAGAAA CAAAGTAATA ATAAAGAAGG 2940

GAAGATTACA AGCGGGCGAG TTATATATGC TCTGTATCTC CAATTAGCTA CATATAGCTG 3000

GATTCCTAAT GGCTCGAATA GGTGTAATAT ATCTAGCTAT ATTAACATAT ATACAAATAA 3060

ATTTAAAAGA TATACAAGTA TAATTATGC 3089

Claims (7)

1.一种橡胶树开花调控基因HbFT2，其特征在于，所述基因HbFT2的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.一种权利要求1所述的橡胶树开花调控基因HbFT2编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

3.一种橡胶树开花调控基因HbFT2，其特征在于，所述基因HbFT2的基因组DNA核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

4.一种含有权利要求1或3所述的橡胶树开花调控基因HbFT2的重组植物表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组质粒pXCS-HbFT2。

5.根据权利要求4所述的重组植物表达载体，其特征在于，所述重组植物表达载体中的载体为pMD19-T载体。

6.一种克隆权利要求1或3所述的橡胶树开花调控基因HbFT2的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分别以巴西橡胶树的叶片基因组DNA，或者叶片和花序的cDNA混合为模板，设计如下引物进行PCR扩增，获得HbTF1基因开放阅读框；HbFT2OF：

GGAATTCATGCCTAGAGATCCTCTGGTT；HbFT2OR：

CCCCCCGGGTTGTCCTCGCCTTCTT；

(2)以HbTF1基因开放阅读框为基础，设计如下引物合成5’UTR及3’UTR；HbFT2-5UF：

TGGAAAGCATATTGGCATAGAAAGT；HbFT2-5UR：

CCTTAAATCATCTCCACCTACATCA；HbFT2-GSP3_1st：

CGAAGACAGACAATCAACCCACC；HbFT2-GSP3_2nd：

GAAACTGCTGCAAGAAGACGCTAAC；

(3)根据5’UTR和3’UTR的获得，设计如下特异引物，进行目标基因HbFT2全长的扩增；HbFT2-F：TGGAAAGCATATTGGCATAGAAAGT；HbFT2-R：

GCATAATTATACTTGTATATCTTTTAAATTTATTTGTATAT。

7.权利要求1或3所述的橡胶树开花调控基因HbFT2用于制备促进橡胶树提前开花的促进剂的应用。