CN114891805B

CN114891805B - MsHMG-Y基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN114891805B
Application number: CN202210767250.2A
Authority: CN
Inventors: 康俊梅; 张云秀; 蒋旭; 王秀莲; 陈林; 李明娜; 龙瑞才; 杨青川
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2022-07-01
Filing date: 2022-07-01
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2042-07-01
Also published as: CN114891805A

Abstract

本发明公开一种MsHMG‑Y基因及其编码蛋白与应用，涉及生物技术领域，MsHMG‑Y基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，MsHMG‑Y蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明通过应用MsHMG‑Y基因或MsHMG‑Y蛋白来延迟紫花苜蓿开花期，使紫花苜蓿能够维持较长时间的高品质，延长收获窗口期，从而提高紫花苜蓿的产量和品质。

Description

MsHMG-Y基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种MsHMG-Y基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

开花是植物营养生长转向生殖生长的重要标志，对植物地上营养体生物量有重要的影响。植物营养生长所需物质的积累主要在开花前，开花后光合产物发生重新分配，营养物质从叶片转向了繁殖器官，并伴随着木质化程度的增加。紫花苜蓿是全球范围种植最广泛的豆科牧草之一，由于其产草量高、蛋白质含量丰富，已成为奶业和草食畜牧业健康稳定发展不可替代的优质饲草。

紫花苜蓿的最佳刈割时期是初花期，此时产量和品质最佳，如果提前刈割，苜蓿的产量受到影响，若延迟刈割，随着营养生长到生殖生长的转变，苜蓿草的品质会显著下降。据文献报道开花后苜蓿草的相对饲用价值损失可达45％左右，研究表明苜蓿的消化率降低1％肉牛的日增重就损失3％左右。此外，也有研究表明在相同的生长条件下，苜蓿晚花材料比早花材料具有更好的表型，株高、生物量和叶茎比高于早花材料，表现出较强的增产潜力。因此，利用花期调控基因调整紫花苜蓿的开花期在苜蓿领域具有意义。

发明内容

为实现利用花期调控基因调整紫花苜蓿的开花期，从而获得较高品质和产量的紫花苜蓿，本发明提供了一种通过应用MsHMG-Y基因或MsHMG-Y蛋白来延迟紫花苜蓿开花期的方法，从而使紫花苜蓿能够维持较长时间的高品质，延长收获窗口期，提高紫花苜蓿的产量和品质。

为实现本发明的技术目的，本发明第一方面提供一种MsHMG-Y基因，其具有如SEQID NO.1所示的核苷酸序列。

为实现本发明的技术目的，本发明第二方面提供一种MsHMG-Y蛋白，是具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列。

为实现本发明的技术目的，本发明第三方面提供一种扩增MsHMG-Y基因的引物，其具有SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列。

为实现本发明的技术目的，本发明第四方面提供一种检测MsHMG-Y基因表达水平的引物组，其具有SEQ ID NO.5-8所示的核苷酸序列。

为实现本发明的技术目的，本发明第五方面提供与所述MsHMG-Y蛋白相关的生物材料，为下述B1)至B3)中的任一种：

B1)编码所述的MsHMG-Y蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体.

为实现本发明的技术目的，本发明第六方面提供一种将上述基因、或蛋白、或引物，或生物材料的应用，为S1)或S2)或S3)：

S1)调控紫花苜蓿的开花期，使紫花苜蓿开花延迟的应用；

S2)制备紫花苜蓿延迟开花时间的产品中的应用；

S3)培育开花期延迟的转基因紫花苜蓿的应用。

为实现本发明的技术目的，本发明第七方面提供一种紫花苜蓿开花时间调节剂，其具有上述基因、或蛋白、或引物，或生物材料。

为实现本发明的技术目的，本发明第八方面提供一种培育转基因植物的方法，通过提高受体植物中上述MsHMG-Y蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；与受体植物相比，转基因植物的开花期延迟；

其中，所述通过提高受体植物中MsHMG-Y蛋白的表达量和/或活性是向紫花苜蓿中导入编码所述MsHMG-Y蛋白的核酸分子实现。

附图说明

图1是组织差异性及父母本花不同发育时期的表达分析结果，其中图1A是MsHMG-Y在紫花苜蓿不同组织中的表达模式；图1B是父母本花发育的三个时期差异表达分析；

图2是不同诱导条件下的表达模式分析，其中，图2A是光照/黑暗处理对MsHMG-Y表达的影响；图2B是GA3处理对MsHMG-Y表达的影响；图2C是SA处理对MsHMG-Y表达的影响；图2D是MeJA处理对MsHMG-Y表达的影响；

图3为MsHMG-Y基因的表达分析，其中，图3A为过表达MsHMG-Y紫花苜蓿中促进开花相关基因的表达分析；图3B为过表达MsHMG-Y紫花苜蓿中抑制开花相关基因的表达分析；

图4过表达MsHMG-Y转基因植株的表型，OE8#为过表达植株，WT为野生型植株。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1紫花苜蓿MsHMG-Y基因的克隆

1、紫花苜蓿材料的获得

晚花高产表型的母本，以及用于MsHMG-Y基因克隆，表达模式分析和遗传转化的苜蓿材料均为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所本研究室育成的中苜1号紫花苜蓿(Medicago sativa L.Zhongmu No.1)；早花低产表型的父本材料为沧州苜蓿。将中苜1号紫花苜蓿种子置于铺有滤纸的培养皿中发芽，待子叶张开后移栽到1/2 Hoagland营养液中置于植物培养箱进行培养(16h光照/8h黑暗，温度22℃)，每周更换一次营养液，培养三周后进行光照和激素处理。本研究所有试验均在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所饲草遗传育种实验室完成。

2、MsHMG-Y基因的克隆

提取中苜1号紫花苜蓿的总RNA，总RNA的提取是利用植物总RNA提取试剂盒(Promega,上海普洛麦格生物技术有限公司)，提取步骤见试剂盒说明书。RNA的完整性用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，RNA的纯度用紫外分光光度计(NanoDrop 2000)检测。利用反转录试剂盒(北京金沙生物科技有限公司)合成第一链cDNA。利用紫花苜蓿MsHMG-Y全长CDS序列设计PCR引物。利用ExTagDNA聚合酶进行扩增。PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离后回收，转化pTOPO-MsHMG-Y至大肠杆菌，挑取阳性克隆测序(上述步骤由北京天一辉远生物技术有限公司采用本领域常规方法操作完成)。

克隆所用引物如下：

3、生物信息学分析

利用NCBI的ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测最大开放阅读框；通过DNAMAN进行序列多重比对；MEGA7.0软件使用邻接法构建进化树，Bootstrap设置为1000次；用Plantcare(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)分析启动子区域(起始密码ATG上游2kb)顺式作用元件。以上软件使用默认参数进行分析。

按照上述方法，本发明从中苜1号中克隆了HMG-Y的cDNA全序列为903bp，含有一个612bp的开放阅读框，编码204个氨基酸。Blast结果表明该基因与蒺藜苜蓿的HMG-Y同源，故基因命名为MsHMG-Y，注释号MsG0580028927.01。同源氨基酸多重序列比对分析表明，MsHMG-Y与蒺藜苜蓿MtHMG-Y的相似性最高为97.55％，与大豆、玉米、拟南芥的相似性分别为63.77％、45.71％、45.13％。功能域分析表明MsHMG-Y在豆科植物中均含有H15功能域，但序列存在不保守的情况，表明了该基因在不同物种中存在进化差异。进化树分析表明，MsHMG-Y与豆科模式植物蒺藜苜蓿MtHMG-Y进化关系最近。启动子作用元件预测分析表明，其含有与光周期、赤霉素、水杨酸和茉莉酸甲酯相关的顺式作用元件，如表1所示。

表1启动子作用元件预测分析

4.不同组织和诱导条件下表达模式分析

组织差异性表达和花不同发育时期的表达分析所用材料为父母本；光照处理和外源激素处理所用材料为中苜1号三周龄水培苗。光照处理为连续光照48h,对照组为16h光照8h黑暗，在0、2、4、8、12、16、24、26、28、32、36、40、48h共13个时间点取幼苗地上部分；激素处理分别以50μmol GA3、100μmol SA、100μmol MEJA处理24h，不处理作对照，在0、1、3、6、12、24h时间点收集幼苗地上部分。所取实验材料置于液氮中冷冻后，保存在-80℃冰箱，每个处理3个生物学重复。提取父母本花、茎、叶以及花芽分化期、初花期、盛花期各组织的RNA，以紫花苜蓿Acting为内参，利用qRT-PCR检测MsHMG-Y的表达水平，所用引物序列见表2。

表2

为了分析MsHMG-Y在紫花苜蓿不同组织和花不同发育时期的表达水平，本发明利用qRT-PCR分析了父母本花、茎、叶以及花芽分化期、初花期、盛花期的MsHMG-Y表达水平，结果表明MsHMG-Y在花、茎、叶中均有表达，其中在父母本中均为花中的表达量最高，叶片中的表达量最低。父本花中的表达量是茎的7.7倍，是叶片的100倍；母本花中的表达量是茎的14.4倍，是叶片的130倍，如图1A所示。在早花表型的父本中初花期表达量最高，为花芽分化期的1.9倍，为盛花期的2.3倍。在晚花表型的母本中花芽分化期相对表达量最高，为初花期的1.4倍，为盛花期的16.7倍。父本的花芽分化期相对表达量为母本的0.8倍，父本初花期相对表达量为母本的1.7倍，父本盛花期相对表达量为母本的4倍，如图1B所示，可见，MsHMG-Y基因的表达与开花有非常显著的影响。

5.载体构建与遗传转化

经测序正确的pTOPO-MsHMG-Y质粒与3301载体进行同源重组，转入农杆菌EHA105中，以紫花苜蓿叶片为外植体，采用根癌农杆菌侵染法进行转化，将转化后的外植体移入SH3a培养基中，置于人工培养箱持续避光培养。6-8周后将蓬松的愈伤组织转入MSBK培养基中，恢复光照培养2周左右，诱导绿芽生长。将含有绿芽的愈伤组织转入SH9a培养基诱导根芽分化，直至长出幼苗和强壮的根系，移入土壤生长，在本发明的一个实施例中，土壤为1：1的营养土和蛭石组成，所有培养基均含2mg.L^-1草铵膦，400mg.L^-1头孢霉素，用于筛选阳性植株。

6.过表达MsHMG-Y紫花苜蓿的鉴定与开花相关基因的表达分析

通过抗性筛选获得14株阳性转基因株系，利用qRT-PCR分析转基因株系中MsHMG-Y的相对表达水平。为了了解过表达MsHMG-Y对紫花苜蓿开花相关基因表达的影响，选取两株MsHMG-Y表达量较高的转基因株系检测开花相关基因的表达量变化，其中选取已报道的与促进开花相关基因为MsPHYA、MsELF3、MsGI、MsFKF1、MsSOC1a、MsLFY、MsVRN2、MsFT、MsELF4，抑制开花相关基因为MsLHY、MsTOC1a、MsTEM1、MsSVP、MsTEM2(所用引物序列见表3)。

表3检测开花相关基因的引物序列

引物	核酸序列(5′-3′)	引物	核酸序列(5′-3′)
				MsPHYa-F	GCATATCGCGATGGAAACCTTG	MsLFY-F	AGTCACTCCTTCAACTGCTCC
MsPHYa-R	AAAGGTTCAACTTGCCACCC	MsLFY-R	GATGTTCTCTTTGTCTCTCTCACCC
				MsELF3-F	ACCTGACCTCCATTTGGTGTG	MsVRN2-F	TGTTCCGTGGGCTTGTGAGGCAT
MsELF3-R	TCAGGAGTTAAATGACCAGGGA	MsVRN2-R	TGCCACTGTCTGATCCCCCGTTT
				MsGI-F	AAACCTTTTGAAGTGTCGTCTAGCA	MsLHY-F	GAGGAGCATAAAGATGAGGAAAG
MsGI-R	GAGACGCTCAGAGCACGGACATG	MsLHY-R	CCGAAGATACAGATGAACAAGG
				MsFKF1-F	TCAACTGGGTATCGTGCTCA	MsELF4-F	CGGAGGCGTGGGTCAC
MsFKF1-R	AACGACTGGATCCACCAAAG	MsELF4-R	ACTGCTGGTTCTCGTTCACC
				MsFT-F	GTAGCAGTAGGAATCCACTG	MsTOC1a-F	AGCAAGAGTGGTGATGGATTCA
MsFT-R	ACTCTGGGTTGATTGCCAAT	MsTOC1a-R	TGCCGTGCGGATTTTACAGA
				TEM2-F	TGGTCCGAGAGAAAACCCG	TEM1-F	ATCCACTGGAAAGTCCGGTCTA
TEM2-R	TCAACTCCGAAAAGCCGAA	TEM1-R	GAATAGCCTAACCACAGTCTGAACC
				MsSOC1a-F	GCGTTGTTCGAGCAAGAAAGAATCAGGC	SVP-F	AAGAGTGACAAGATTATGAGTGAG
MsSOC1a-R	GGGGCTGCTTAGAGAGCCTGGCATTT	SVP-R	CTAACCACCATACGGTAAGCCGAG

结果显示，促进开花关键基因MsPHYA、MsELF3、MsGI、MsFKF1、MsHMG-Y、MsSOC1a、MsLFY、MsVRN2、MsFT、MsELF4的表达水平均下调(如图3A所示)，抑制开花相关基因MsLHY、MsTOC1a、MsTEM1、MsSVP、MsTEM2的表达水平均上调。其中变化较为显著的是MsPHYA表达量与对照相比下降了4.9倍，MsGI表达量下降了3.9倍，MsSOCa1表达量下降了2.5倍；抑制开花基因MsTEM1表达量比对照提高了2.5倍(如图3B所示)。

7、开花性状的表型分析

将转基因植株和野生型植株种植在温室中培养，连续刈割两次，植株的生长状况基本保持一致，经过三个多月的培养，野生型(WT)植株开花，而过表达MsHMG-Y的转基因植株(OE8#)没有开花(如图4)，进一步观测发现转基因植株开花时间延迟了8天，可见，MsHMG-Y对苜蓿有延迟开花的功能。对苜蓿花期的调控有重要影响，能够对培育晚花苜蓿品种，或筛选晚花苜蓿品种，或遗传改良苜蓿花期可调控的品种。

本发明的内容不限于具体实施例所举例，本领域技术人员通过阅读本说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> MsHMG-Y基因及其编码蛋白与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 615

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctactc aagaggttaa taagcctctt tcacttcctc cataccctga gatgattatg 60

aaggcactgg aagcactgaa tgaaccaaat ggttcaaaca aatcatcaat ttcaaactac 120

atagaatcaa tctatggtga attaccagaa ggccattcaa ttgttcttgc aaatcacctt 180

aaccagatga aggaaaatgg tgaccttgtt tttgcaaaga acaactacat gaagcctgat 240

ccaaatgcac caccaaagag aggacgtgga agaccaccaa agccaaaaga tccattggct 300

ccaccaccag ctgctgttct gtccccacca aggccaagag gtcgtcctcc taaggaccct 360

aatgcacctc ccaagacccc taaggctgct tcaagtggaa gaggaagggg taggccaaag 420

aaggttcaaa ggactgagaa tgtttcaaat ccaagtggtg gagatggtgc tggtgctggt 480

gctgctgctg aggttgatga tgatgatgct ggtccaagtg ttgctgctgt tgctgttcca 540

actactagtg gaaggggaag gggtaggcct cctaaggtta agcctcagat gactgaagtg 600

agtgttgaat catag 615

<210> 2

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Thr Gln Glu Val Asn Lys Pro Leu Ser Leu Pro Pro Tyr Pro

1 5 10 15

Glu Met Ile Met Lys Ala Leu Glu Ala Leu Asn Glu Pro Asn Gly Ser

20 25 30

Asn Lys Ser Ser Ile Ser Asn Tyr Ile Glu Ser Ile Tyr Gly Glu Leu

35 40 45

Pro Glu Gly His Ser Ile Val Leu Ala Asn His Leu Asn Gln Glu Met

50 55 60

Lys Asn Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Asn Asn Tyr Met Lys Pro Asp

65 70 75 80

Pro Asn Ala Pro Pro Lys Arg Gly Arg Gly Arg Pro Pro Lys Pro Lys

85 90 95

Asp Pro Leu Ala Pro Pro Pro Ala Ala Val Leu Ser Pro Pro Arg Pro

100 105 110

Arg Gly Arg Pro Pro Lys Asp Pro Asn Ala Pro Pro Lys Thr Pro Lys

115 120 125

Ala Ala Ser Ser Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys Lys Val Gln Arg

130 135 140

Thr Glu Asn Val Ser Asn Pro Ser Gly Gly Asp Gly Ala Gly Ala Gly

145 150 155 160

Ala Ala Ala Glu Val Asp Asp Asp Asp Ala Gly Pro Ser Val Ala Ala

165 170 175

Val Ala Val Pro Thr Thr Ser Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Pro Lys

180 185 190

Val Lys Pro Gln Met Thr Glu Val Ser Val Glu Ser

195 200

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attttcaagc ttcaatggct actca 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctaatcata ataagaccac acccac 26

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccataccct gagatgaagg a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttggtggg gacagaacag 20

Claims

1.一种MsHMG-Y基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述MsHMG-Y基因的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种扩增MsHMG-Y基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。

4.一种检测MsHMG-Y基因表达水平的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

5.与权利要求2所述蛋白相关的生物材料，为下述B1)至B3)中的任一种：

B1)编码权利要求2所述的MsHMG-Y蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体。

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

7.一种权利要求1所述的基因、或权利要求2所述的蛋白、或权利要求5所述的生物材料的应用，为S1）或S2）或S3）：

S1）调控紫花苜蓿的开花期，使紫花苜蓿开花延迟的应用；

S2）制备紫花苜蓿延迟开花时间的产品中的应用；

S3）培育开花期延迟的转基因紫花苜蓿的应用。

8.一种紫花苜蓿开花时间调节剂，其特征在于，其具有权利要求1所述的基因、或权利要求2所述的蛋白、或权利要求5所述的B1）-B3）所述的生物材料。

9.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，通过提高受体植物中权利要求2中所述蛋白的表达量，得到转基因植物；与受体植物相比，转基因植物的开花期延迟；

其中，所述通过提高受体植物中MsHMG-Y蛋白的表达量是向紫花苜蓿中导入编码所述MsHMG-Y蛋白的核酸分子实现。