CN109402164A - 一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法与应用，包括以下步骤：(1)紫花苜蓿SE1基因的克隆及序列分析；(2)生物信息学分析；(3)亚细胞定位；(4)原核表达；(5)苜蓿鲨烯环氧酶MsSE1的表达；(6)构建MsSE1基因的超表达载体及对紫花苜蓿遗传转化。本发明通过建立高效的遗传转化体系将鲨烯环氧酶基因转入紫花苜蓿中过表达，提高了转基因苜蓿体内的总皂甙的含量，为培育高皂甙含量的苜蓿提供育种材料。
Description
技术领域
本发明涉及植物皂甙合成相关的限速酶基因领域，特别是涉及一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法与应用。
背景技术
鲨烯环氧酶，又称鲨烯单加氧酶，在甲羟戊酸(MVA)途径中催化鲨烯C＝C双键的环氧化反应，生成2,3-氧化鲨烯。这一反应生成了甾醇及三萜类物质的前体物质，并且是三萜皂甙合成的途径中的第一个氧化反应，故鲨烯环氧酶的活性和含量决定了下游产物的产量。在三萜代谢途径中，鲨烯环氧酶(Squalene epoxide，SE)的作用至关重要。鲨烯环氧酶具有氧化还原反应所需的重要辅助因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adeninedinucleotide，FAD)的结合位点，该位点是皂苷生物合成途径中关键酶所包含的重要结合位点。植物一般含两个或两个以上类型的SE基因。在模式植物拟南芥中已发现6个SE基因并具有不同的表达模式，其中SE1、SE2、SE3编码的蛋白已被鉴定为鲨烯环氧酶，具有相应的功能，豆科模式植物蒺藜苜蓿中也发现两种SE基因。有研究表明，当体外诱导剂诱导SE基因的表达量升高，三萜皂苷的生物合成量也随着升高，而降低SE的表达量，三萜皂苷的合成则受到抑制。因此，SE被认为是皂苷生物合成途径中的一个非常重要的调控限速酶基因。
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上种植面积最大，分布范围最广泛的优质、高产豆科牧草，被誉为“牧草之王”。苜蓿不仅营养丰富，其次生代谢产物苜蓿皂甙(alfalfa saponins)被认为是苜蓿的药用功能的主要来源。苜蓿皂甙具有良好的降胆固醇、降血脂的功效，还有抗炎、抗癌、抗菌、杀虫等药用及生物活性。目前苜蓿皂甙的提取物被广泛应用于食品、保健品和医药等多个领域，具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法与应用。通过建立高效的遗传转化体系将鲨烯环氧酶基因转入紫花苜蓿中过表达，提高了转基因苜蓿体内的总皂甙的含量，为培育高皂甙含量的苜蓿提供育种材料。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法，包括以下步骤：
(1)紫花苜蓿SE1基因的克隆及序列分析；
(2)生物信息学分析；
(3)亚细胞定位；
(4)原核表达；
(5)苜蓿鲨烯环氧酶MsSE1的表达；
(6)构建MsSE1基因的超表达载体及对紫花苜蓿遗传转化。
其中，所述步骤(1)具体为，根据NCBI中已知的的截型苜蓿的鲨烯环氧酶基因的CDS序列，利用Primer 5.0设计1对引物P1和P2，如SEQ ID NO:1-2所示；以紫花苜蓿第一链cDNA为模板进行PCR扩增；PCR程序为94℃ 5min；94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min；72℃5min；反应结束后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，然后切胶回收；将回收产物连接到pEASY-T3克隆载体上并将重组质粒转化至Trans-T1大肠杆菌感受态细胞内；用卡那抗生素筛选菌落，挑取阳性菌落进行测序鉴定。
其中，所述步骤(2)具体为，应用DNAMAN程序和NCBI/BLAST数据库对同源克隆的目的基因进行序列的同源性比对和进化树分析；利用SOPMA程序对编码的蛋白序列理化性质分析；借助生物学软件SignalP4.1Server软件进行信号肽预测；采用TMHMM Server在线软件预测蛋白质的跨膜区和疏水性；利用Interpro数据库进行蛋白结构域功能分析。
其中，所述步骤(3)具体为，通过在线软件TargetP 1.1和PSORT prediction预测目标基因编码蛋白质的亚细胞定位；利用Primer5.0设计上下游引物SE1-GFP-f和SE1-GFP-r，各含有XhoⅠ和SalⅠ酶切位点，并扩增出目的基因编码区序列，使目的基因以正确的方向整合到瞬时表达载体pA7-GFP中；通过基因枪轰击的方法，将含有目的基因编码区序列的亚细胞瞬时表达载体pA7-GFP转入洋葱表皮，在35S强启动子驱动下，融合蛋白在洋葱表皮细胞中过量表达；绿色荧光蛋白GFP在蓝色波长光下显示绿色荧光，根据融合蛋白的荧光信号确定SE1基因编码的蛋白在细胞内的定位。
其中，所述步骤(4)具体为，设计两个引物方案：方案1：将SE1cDNA整个编码区序列插入原核表达载体；方案2：将SE1编码区序列N末端截掉25个氨基酸的序列插入原核表达载体；
根据上述方案分别设计2对引物：SE1--PE-f和SE1--PE-r，SE1--PE-r扩增全长SE1编码区；SE1--PE-f和SE1-PE-SPt-f，SE1-PE-SPt-f扩增N端截掉25个氨基酸的SE1序列；具体如SEQ ID NO:3-5所示，分别扩增出目的编码区序列，再将目的片段连接到pEASY-E2载体中；将两种原核表达重组子pEASY-E2-SE1和pEASY-E2-SPtSE1，以及空载体pEASY-E2-Control分别转入大肠杆菌Transetta，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃诱导重组蛋白表达，并收集菌体进行SDS-PAGE检测。
其中，所述步骤(5)具体为，中苜3号幼苗经紫外伤害、黑暗处理、MeJA、ABA、GA3处理后，分别在不同时间点收集根、茎、叶组织提取总RNA，采用qRT-PCR分析目的基因的相对表达量。分别以SE1-RT-f1和SE1-RT-r1和Actin-f和Actin-r为引物，如SEQ ID NO:8-11所示，检测目的基因MsSE1和看家基因β-actin的转录水平，采用ABI公司的Real Time PCRSystem 7300进行扩增，3个生物学重复；在目的基因与内参基因扩增效率相同情况下，计算实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，即相对值为2-ΔΔCt，其中公式为：
ΔΔCt＝(CttreatM-Cttreata)-(CtckM–Ctcka)
CttreatM:实验组目的基因，Cttreata：实验组内参基因，CtCkM：对照组目的基因，CtCKa：对照组内参基因，Ct：当扩增产物的荧光信号达到设定的阀值时所经过的扩增循环数；
取MeJA处理组中不同处理时间的根、茎、叶样品粉碎后经石油醚脱脂，-80℃冻干70小时，取出后过60目筛，置于干燥器中长期保存；精密称取30mg冻干样品各3份，用1mL70％乙醇在超声清洗机中提取30min，4℃过夜，再次超声30min；1000g离心30min，取上清液100μL注入已预处理的SPE柱，分别用5mL水和5mL30％甲醇冲洗后，再以甲醇洗脱4次，每次1mL；合并洗脱液置于10mL具塞试管中进行比色测定；以空白平行样作对照，用分光光度计在545nm处测定各管中溶液的吸光度，计算皂苷含量。
其中，所述步骤(6)具体为，用SE1-P1、SE1-P2为扩增引物，如SEQ ID NO:12-13所示，，扩增出含有XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点的MsSE1基因片段，回收纯化PCR产物，再将目的片段连接到pEASY-T3载体；测序并提取含有正确序列的重组质粒，用XbaⅠ和BamHⅠ快速限制性内切酶对pBI121和重组子pEASY-T3-pMsSS进行双酶切，在T4连接酶的作用下将目的基因编码区序列插入到植物超表达载体pBI121中，构建目的基因超表达载体，并转化农杆菌EHA105；然后采用农杆菌介导法转化紫花苜蓿中苜3号。
其中，还包括转基因苜蓿的鉴定，具体为以紫花苜蓿卡那霉素抗性植株基因组DNA为模板，以空载体PBI121转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿DNA作为阴性对照和121-SE1质粒作为阳性对照，以pBI121上的35S启动子的上游引物35S-f和SE1基因的下游引物SE1-r作为引物，如SEQ ID NO:14-15所示，进行PCR扩增，以检测转基因苜蓿。
本发明上述的紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法在培育高皂甙含量苜蓿品种中的应用。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
本发明是以紫花苜蓿“中苜3号”为材料，通过分子生物技术对苜蓿皂甙合成途径中关键酶基因进行筛选，克隆了皂甙合成的限速酶鲨烯环氧酶基因MsSE1，并进行表达模式的分析，构建了亚细胞定位和原核表达载体，通过分析鲨烯环氧酶可能定位于内质网膜上，原核表达分析鲨烯环氧酶被IPTG诱导表达。构建了植物超表达载体并转化了紫花苜蓿，获得了超表达MsSE1的转基因紫花苜蓿株系。通过表达分析和总皂甙含量的测定分析显示，转基因株系中MsSE1的表达量显著高于对照，总皂甙含量也随着MsSE1的表达量的提高而升高。本发明的内容和方法为培育高皂甙含量苜蓿品种提供理论基础和技术指导。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的紫花苜蓿皂甙合成限速酶鲨烯环氧酶基因及其编码蛋白与应用作进一步说明。
附图说明
图1为紫花苜蓿SE1cDNA。
图2为紫花苜蓿SE1蛋白信号肽预测；其中：C-score(raw cleavage site score)：原始剪切位点的分值；S-score(signal peptide score)：信号肽的分值；Y-score(combined cleavage site score)：综合剪切位点的分值；mean S：信号肽分值的平均值；D-score(discrimination score)：mean S和max.Y的加权平均值。
图3为紫花苜蓿SE1跨膜结构预测；
图4为pA7-GFP-SE1转化洋葱表皮细胞亚细胞定位分析；其中，a-c：pA7-GFP转化洋葱表皮绿色荧光蛋白分布情况；d-f：pA7-GFP-SE1转化洋葱表皮细胞绿色荧光蛋白分布情况；g-i：转化了pA7-GFP-SE1的洋葱表皮细胞绿色荧光蛋白在细胞失水(0.3g/ml蔗糖)条件下的分布情况；a,d,g：蓝色波长与白光照射下拍摄；b,e,h：蓝色波长下拍摄；c,f,i：白光下拍摄，.Bar:＝100μm.。
图5为大肠杆菌表达紫花苜蓿鲨烯环氧酶SDS-PAGE分析；其中，M：蛋白分子质量标准；1：转化了pEASY-E2-Control的大肠杆菌总蛋白(经过IPTG诱导表达5h)；2：转化了pEASY-E2-NTtMsSE1的大肠杆菌总蛋白(未经IPTG诱导表达)；3：转化了pEASY-E2-NTtMsSE1大肠杆菌上清蛋白(经过IPTG诱导表达5h)；4：转化了pEASY-E2-NTtMsSE1大肠杆菌沉淀蛋白(经过IPTG诱导表达5h)；5：转化了pEASY-E2-MsSE1的大肠杆菌总蛋白(未经IPTG诱导表达)；6：转化了pEASY-E2-MsSE1大肠杆菌上清蛋白(经过IPTG诱导表达5h)；7：转化了pEASY-E2-MsSE1大肠杆菌沉淀蛋白(经过IPTG诱导表达5h)。
图6为MsSE1基因组织差异表达分析。
图7为MsSE1基因在不同胁迫下的相对表达量；其中，A:紫外伤害；B:避光处理；C:ABA胁迫；D:GA3胁迫。
图8为中苜3号在MeJA诱导下MsSE1的相对表达量分析(A)和皂苷含量的变化分析(B)。
图9为表达载体pBI121-MsSE1酶切鉴定；其中，M：DNA分子量标准；1、2：双酶切pBI121-MsSE1质粒。
图10为紫花苜蓿遗传转化过程；A：外植体侵染及共培养；B/C：愈伤组织发育；D/E：成熟小胚及抗性芽；F：诱导生根；G/H/I：驯化移栽。
图11为PCR检测部分转MsSE1基因紫花苜蓿；其中，M：DNA分子量标准；CK+：用质粒PBI-MsSE1为模板的阳性对照；CK1：空载体PBI121转基因紫花苜蓿；CK2：野生型紫花苜蓿；
图12为转基因紫花苜蓿株系中MsSE1表达量(A)和皂苷含量的分析(B)；其中，CK1：野生型紫花苜蓿；CK2：空载体PBI121转基因紫花苜蓿；SE1-1,SE1-2,SE1-5,SE1-6,SE1-8,SE1-9,SE1-10为MsSE1转基因紫花苜蓿。
图13为植物超表达载体pBI121-MsSE1的图谱。
具体实施方式
1材料与方法
1.1植物材料
紫花苜蓿中苜3号(Medicago sativa L.‘Zhongmu No.3’)由中国农业科学院畜牧所饲草遗传与栽培团队保存和提供。紫花苜蓿中苜3号种子置于浸湿的滤纸上萌发后，移植入霍格兰氏营养液培养基中，置于光照培养箱(16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％)，每隔7天换一次营养液。培养25天后的幼苗分别进行15W紫外光照射30min、黑暗处理、MeJA(200μM)、ABA(100μM)、GA3(50μM)等胁迫处理，分别在不同时间点收集根、茎、叶组织，用于目的基因表达量分析和皂苷含量测定。中苜3号种子经75％酒精溶液和0.1％HgCl溶液消毒后，用无菌水洗涤7～8次后平铺在无菌的湿润滤纸上，室温黑暗放置2d后，将发芽的种子移植1/2SH培养瓶中，培养约3～4周(16h昼/8h夜，白天24℃，夜晚20℃，相对湿度40％)作为遗传转化无菌苗。
1.2主要试剂
MinBEST Plant RNA Extraction Kit、SuperRT cDNA第一链合成试剂盒均购于TaKaRa公司；2×TransTaq High Fidelity(HiFi)、PCR SuperMix、DNA纯化回收试剂盒、克隆载体pEASY-T3、原核表达载体pEASY-E2、大肠杆菌Trans-T1、Transetta(DE3)感受态细胞均来自TransGenBiotech公司；pBI-121植物超表达载体、瞬时表达载体pA7-GFP和农杆菌EHA105均由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所饲草遗传与栽培创新团队保存和提供；Sep-Pak C18固相萃取微柱(500mg/3ml,Cilicycle)、5％香草醛-冰醋酸溶液(新配置)、齐墩果酸对照品(中国食品药品检定研究院，纯度>95％)、石油醚、甲醇﹑无水乙醇﹑冰醋酸﹑高氯酸均为市售分析纯。
表1所用的引物序列(如序列表中SEQ ID NO:1-15所示)
*小写字母区域为酶切位点序列。
1.3紫花苜蓿SE1基因的克隆及序列分析
根据NCBI中已知的截型苜蓿的鲨烯环氧酶基因的CDS序列，利用Primer 5.0设计1对引物P1和P2(见表1)，如SEQ ID NO:1-2所示；以紫花苜蓿第一链cDNA为模板进行PCR扩增。PCR程序为94℃ 5min；94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min；72℃ 5min。反应结束后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，然后切胶回收。将回收产物连接到pEASY-T3克隆载体上并将重组质粒转化至Trans-T1大肠杆菌感受态细胞内。用卡那抗生素筛选菌落，挑取阳性菌落送公司测序鉴定(北京天一辉远生物科技有限公司)。
1.4生物信息学分析
应用DNAMAN程序和NCBI/BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)数据库对同源克隆的目的基因进行序列的同源性比对和进化树分析。利用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopm.html)程序对编码的蛋白序列理化性质分析。借助生物学软件SignalP4.1Server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测。采用TMHMM Server在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测蛋白质的跨膜区和疏水性。利用Interpro(http://www,ebLac.uk/interpro/)数据库进行蛋白结构域功能分析。
1.5亚细胞定位
通过在线软件TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和PSORT prediction(http://psort.hgc.jp/form.html)预测目标基因编码蛋白质的亚细胞定位。利用Primer5.0设计上下游引物SE1-GFP-f和SE1-GFP-r，各含有XhoⅠ和SalⅠ酶切位点，并扩增出目的基因编码区序列，使目的基因以正确的方向整合到瞬时表达载体pA7-GFP中。通过基因枪轰击的方法，将含有目的基因编码区序列的亚细胞瞬时表达载体pA7-GFP转入洋葱表皮，在35S强启动子驱动下，融合蛋白在洋葱表皮细胞中过量表达。绿色荧光蛋白GFP在蓝色波长光下显示绿色荧光，根据融合蛋白的荧光信号确定SE1基因编码的蛋白在细胞内的定位。
1.6原核表达
通过生物信息学分析可知SE1基因编码的蛋白N端可能存在信号肽，信号肽剪切位点位于第25～26位氨基酸残基，可能会影响其在大肠杆菌中的表达。故设计引物有两个方案：方案1：将SE1cDNA整个编码区序列插入原核表达载体；方案2：将SE1编码区序列N末端截掉25个氨基酸的序列插入原核表达载体。根据上述方案分别设计2对引物SE1--PE-f和SE1--PE-r(扩增全长SE1编码区)、SE1--PE-f和SE1-PE-SPt-f(扩增N端截掉25个氨基酸的SE1序列)(表1)，如SEQ ID NO:3-5所示；分别扩增出目的编码区序列，再将目的片段连接到pEASY-E2载体中。将两种原核表达重组子pEASY-E2-SE1和pEASY-E2-SPtSE1，以及空载体pEASY-E2-Control(对照)分别转入大肠杆菌Transetta(DE3)，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃诱导重组蛋白表达，并收集菌体进行SDS-PAGE检测。
1.7苜蓿鲨烯环氧酶(MsSE1)的表达模式
中苜3号幼苗经紫外伤害、黑暗处理、MeJA、ABA、GA3处理后，分别在不同时间点收集根、茎、叶组织提取总RNA，采用qRT-PCR分析目的基因的相对表达量。分别以SE1-RT-f1和SE1-RT-r1和Actin-f和Actin-r为引物(表1)，如SEQ ID NO:8-11所示；检测目的基因MsSE1和看家基因β-actin的转录水平，采用ABI公司的Real Time PCR System 7300进行扩增，3个生物学重复。在目的基因与内参基因扩增效率相同情况下，计算实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，即相对值为2-ΔΔCt，其中公式：
ΔΔCt＝(CttreatM-Cttreata)-(CtckM–Ctcka)
CttreatM:实验组目的基因，Cttreata：实验组内参基因，CtCkM：对照组目的基因，CtCKa：对照组内参基因，Ct：当扩增产物的荧光信号达到设定的阀值时所经过的扩增循环数。
取MeJA处理组中不同处理时间的根、茎、叶样品粉碎后经石油醚脱脂，-80℃冻干70小时，取出后过60目筛，置于干燥器中长期保存。精密称取30mg冻干样品各3份，用1mL70％乙醇在超声清洗机中提取30min，4℃过夜，再次超声30min。1000g离心30min，取上清液100μL注入已预处理的SPE柱，分别用5mL水和5mL30％甲醇冲洗后，再以甲醇洗脱4次，每次1mL。合并洗脱液置于10mL具塞试管中进行比色测定。以空白平行样作对照，用分光光度计在545nm处测定各管中溶液的吸光度，计算皂苷含量。
1.8MsSE1基因的超表达载体的构建及对紫花苜蓿的遗传转化
用SE1-P1、SE1-P2为扩增引物(表1)，如SEQ ID NO:12-13所示；扩增出含有XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点的MsSE1基因片段，回收纯化PCR产物，再将目的片段连接到pEASY-T3载体。测序并提取含有正确序列的重组质粒，用XbaⅠ和BamHⅠ快速限制性内切酶对pBI121和重组子pEASY-T3-pMsSS进行双酶切，在T4连接酶的作用下将目的基因编码区序列插入到植物超表达载体pBI121中，构建目的基因超表达载体，如图13所示，并转化农杆菌EHA105。然后采用农杆菌介导法转化紫花苜蓿中苜3号。
1.9转基因苜蓿的鉴定
以紫花苜蓿卡那霉素抗性植株基因组DNA为模板，以空载体PBI121转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿DNA作为阴性对照和121-SE1质粒作为阳性对照，以pBI121上的35S启动子的上游引物35S-f和SE1基因的下游引物SE1-r作为引物(表1，如SEQ ID NO:14-15所示；)进行PCR扩增，以检测转基因苜蓿。
1.10转基因苜蓿中MsSE1表达分析与皂甙含量的测定
提取转基因紫花苜蓿地上部分总RNA并进行反转录，分别以SE1-RT-f1和SE1-RT-r1和Actin-f和Actin-r为引物(表1)，检测目的基因MsSE1和看家基因β-actin的转录水平，以转空载体和野生型紫花苜蓿作为对照，检测MsSE1的转录水平变化。取转MsSE1的阳性转基因紫花苜蓿和转空载体PBI121的转基因紫花苜蓿以及野生型紫花苜蓿地上部分粉碎脱脂，-80℃冻干70小时，过60目筛，经过固相萃取纯化后，利用比色法测定皂苷含量。
2.结果
2.1 MsSE1的克隆及序列分析
以紫花苜蓿cDNA为模板，进行PCR扩增出一条约1500bp的特异性条带(图1)，经切胶回收测序后，用DNAMAN软件预测得出一个1578bp的最大开放阅读框，编码525个氨基酸。同源性分析发现，其核酸序列与蒺藜苜蓿SE1基因的同源性为97.53％，推衍的氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SE1氨基酸序列同源性为99％，与大豆、鹰嘴豆、人参中鲨烯环氧酶氨基酸序列的同源性分别为94％、93％、87％。分析结果表明克隆的基因为紫花苜蓿鲨烯环氧酶，命名为MsSE1。
通过在线软件SOPMA预测MsSE1的二级结构，表明其二级结构以无规则卷曲与α-螺旋为主，其中无规则卷曲占35.62％，α-螺旋占28.19％，β-转角占11.05％，延伸链占25.14％。MsSE1的理化性质分析表明，其理论等电点PI为8.59，蛋白分子量为56.972kD，平均亲水性为0.054(负值越大表示亲水性越好，正值越大表示疏水性越强)。
表2蛋白的物理化学参数
应用生物学软件SignalP4.1Server分析了SE1编码的蛋白质序列，检测它是否具有N端信号肽。结果(如图2)所示：SE1蛋白序列第26位苯谷氨酸残基具有最高的原始剪切位点分值0.357和第4位谷氨酰胺残基具有最高的信号肽分值0.751，第26位谷氨酸残基具有最高综合剪切位点的分值0.446。由于最后算的氨基酸残基的加权平均值0.516(>0.5)，由此，推测SE1基因编码的蛋白序列前25个氨基酸可能组成一个信号肽，在跨膜运输中起信号识别作用，信号肽剪切位点位于第25-26位氨基酸。
应用InterProScan在线软件分析显示(图3)：SE1有三个可能跨膜螺旋区(TMhelix)：一个是从第5个氨基酸残基到第24个氨基酸残基，方向是由外向内。第二个是从第455个氨基酸残基到第477个氨基酸残基，方向是由内向外。第三个是从第484个氨基酸残基到第501个氨基酸残基，方向是由外向内；
2.2亚细胞定位
利用TargetP 1.1和PSORT prediction分析MsSE1蛋白的细胞定位情况。通过基因枪轰击的方法，将含有MsSE1cDNA的亚细胞瞬时表达载体pA7-GFP-MsSE1转入洋葱表皮，在35S强启动子驱动下，MsSE1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中过量表达，并且GFP在蓝色波长光下显示绿色荧光，根据融合蛋白的荧光信号间接确定MsSE1基因在细胞内的表达部位。用激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照，照片结果显示(图4)：空载体pA7-GFP转化后，荧光信号分布在整个洋葱表皮细胞细胞中；而转化了pA7-GFP-MsSE1的洋葱表皮细胞，只有非核部分有荧光信号，同时进一步在细胞质壁分离时观测荧光信号，同样融合蛋白只能在细胞质内表达。综合表3分析预测MsSE1蛋白主要集中在分泌途径上，分布在内质网膜、质膜及高尔基体内，少数分布在内质网腔内，MsSE1很有可能是分泌性蛋白。
表3紫花苜蓿SE1蛋白亚细胞定位分析
2.3原核表达分析
实验成功构建了MsSE1基因全长编码区cDNA和N末端截掉(N-terminaltruncated)25个碱基的MsSE1原核表达重组子，并将其重组子分别命名为pEASY-E2-MsSE1和pEASY-E2-NTtMsSE1(图5)。同时构建了在pEASY-E2表达载体内插入了一段对照基因序列，作为空白对照，命名为pEASY-E2-Control。并将上述重组子转入大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中，在T7启动子的作用下，用终浓度1mM的IPTG诱导重组蛋白在大肠肝菌中大量表达5h后，分别提取转化了pEASY-E2-MsSE1和pEASY-E2-NTtMsSE1的大肠杆菌细胞破碎液，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示(图5)：经过IPTG诱导后，转化了pEASY-E2-MsSE1大肠杆菌的上清液总蛋白和沉淀物总蛋白中均可在55～60kDa左右检测到目标重组蛋白条带，而转化了pEASY-E2-NTtMsSS大肠杆菌的只能在其沉淀总蛋白中检测到大小约55kDa目标重组蛋白条带。因此，MsSE1蛋白可在大肠杆菌中大量表达，且可检测到可溶性蛋白。而N末端截掉25个氨基酸后，MsSE1蛋白依然可在大肠杆菌中表达，但均为包涵体蛋白。
2.4表达分析
以叶、茎、根各组织样品的反转录cDNA为模板，进行qRT-PCR分析，检测MsSE1在紫花苜蓿不同组织中的转录水平。结果显示(图6)，MsSE1在叶中表达量最高，其次是茎，根中表达量最低，其中叶比根的表达量高8倍以上。
利用实时荧光定量PCR检测多种胁迫下MsSE1转录水平的变化。结果显示：紫花苜蓿在15w紫外灯照射20min后，在随后的48h内MsSE1在叶和根中的表达量呈现明显上升，而在茎的表达量略有下降(图7A)；在黑暗处理的条件下，MsSE1在茎的表达量与对照相比无明显差异，而叶中表达量明显下降同时根部的表达量明显上升(图7B)；在紫花苜蓿培养液中添加50μM GA3，在随后的24h内，各组织中MsSE1转录水平都受到诱导表达，表达量比对照组明显升高(图7C)；在紫花苜蓿培养液中添加ABA(100μM)，在随后的24h内，根部MsSE1表达量在2h后表达量升高，其后的24h内在根中表达量较对照组又降低，8h时叶中的表达量达到最大值，而茎中MsSE1表达量在处理的24h内始终低于对照组，在12h时达到最低值(图7D)。
MeJA胁迫处理144h内，MsSE1在叶、茎、根中的表达量有明显的变化(图8A)，说明MeJA可诱导紫花苜蓿中MsSE1的表达。根部MsSE1的表达量在24h逐步升高并达到了最高，随后逐步下降，但总体趋势都比未诱导前的表达量要高；叶中MsSE1转录水平随时间的诱导变化波动最大，总体呈现上调趋势：0～8h内表达量迅速增加，12～24h含量突然下降，其后表达量又逐步提高并在诱导144h后表达量达到最大值，是未诱导前的18倍。茎中的MsSE1转录水平在MeJA诱导后也表达量升高，但相对增加幅度较少。在MeJA诱导下，紫花苜蓿各组织中总皂苷含量明显上调并总体呈现上升趋势(图8B)。同时各组织中皂苷含量与MsSE1表达量两者的变化趋势完全一致，并且相对增加幅度也相一致，茎中的增幅相对根、叶中较小，而叶中皂苷含量变化最大。
3.5 MsSE1在紫花苜蓿中的超表达分析
为了进一步研究MsSE1在紫花苜蓿皂苷合成途径中的调控作用，将MsSE1在紫花苜蓿苜蓿中进行转基因超表达分析。对含有目标基因的植物超表达载体pBI121进行酶切鉴定结果显示(图9)：酶切后得到一条与目的基因片段大小一致的条带，表明成功构建了MsSE1植物超表达载体。通过冻融法将MsSE1转入到EHA105农杆菌中，并采用农杆菌侵染法将目的基因MsSE1在紫花苜蓿中苜3号中过表达(图10)。
通过卡那霉素筛选得到100余株抗性植株，以抗性紫花苜蓿地上组织为材料，分别提取基因组DNA，并以转空载体和野生型紫花苜蓿作为阴性对照，以pBI121-SE1质粒作为阳性对照，以pBI121上的35S启动子的上游引物35S-f和MsSE1基因的下游引物SE1-r作为引物进行PCR扩增检测，抗性植株可扩增出长度约为1500bp的条带(图11)，目标片段与MsSE1的理论长度相近。经测序证实有40株抗性紫花苜蓿植株的基因组DNA中转入了MsSE1。随机选取部分转基因株系地上部分提取总RNA进行RT-PCR检测，并测定总皂苷含量，转空载体和野生型紫花苜蓿作对照(图12)。分析表明，转基因植株中MsSE1的表达量与转空载体和野生型紫花苜蓿植株的表达量均有所上升，而且转基因紫花苜蓿中总皂苷含量与对照相比也有所上升，结果表明MsSE1在苜蓿中的过表达对苜蓿总皂甙含量有一定影响。
本发明通过同源克隆法获得紫花苜蓿鲨烯环氧酶基因(MsSE1)，序列分析表明其编码的蛋白序列前25个氨基酸组成一个信号肽——是一段指导蛋白跨膜转移(定位)的N-末端疏水性氨基酸序列；同时跨膜结构域分析进一步验证了MsSE1蛋白在5～25个氨基酸残基有一段由外向内的跨膜螺旋区域；结合亚细胞定位分析MsSE1蛋白主要集中在内质网膜、质膜、高尔基体内及少数分布在内质网腔内等分泌途径上。因此，综上推测得出MsSE1很有可能是分泌性蛋白。原核表达分析表明，MsSE1能在原核细胞中表达。通过荧光实时定量PCR的分析表明，MsSE1在叶中的表达量最高，茎次之，根中的表达量最低。不同诱导条件下，MsSE1的表达量存在较大差异，在紫外辐射的条件下，叶中的表达量明显高于对照；在黑暗诱导条件下，根中的表达量明显高于对照，叶中和茎中的表达量与对照没有差异；但是在赤霉素和脱落酸的诱导条件下，诱导8小时时表达量最高，其他的时间点没有明显变化。上述研究表明，MsSE1受紫外、黑暗和激素诱导表达，但不同诱导条件下，表达模式存在差异。茉莉酸甲酯对MsSE1的表达也有影响，在茉莉酸甲酯的诱导下，MsSE1的表达量先升高后降低然后又升高，在胁迫144个小时的时候达到最大值，而且总皂甙的含量也有上升的趋势，表明茉莉酸甲酯对MsSE1诱导表达。
通过遗传转化获得了转MsSE1的转基因紫花苜蓿，转基因植株中MsSE1的表达量高于转空载体和非转基因野生型植株，而且转基因植株中总皂甙含量也高于对照，表明MsSE1的表达对皂甙的合成有一定的调节作用。本发明不仅建立了苜蓿转MsSE1基因的高效转化体系，而且对MsSE1的表达模式及功能有了初步的了解；获得的转基因紫花苜蓿株系可作为培育高皂甙含量紫花苜蓿新品种的种质材料，为苜蓿的遗传改良具有一定的意义和应用价值。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法与应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttctttgag atggattatc agtat 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaatgacatg aatactacag tgaca 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaaagaaga aaacaggttc aagtt 25
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggattatc agtatattct tggaggg 27
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggacagga ggcattctgt aatat 25
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccctcgagat ggattatcag tatattcttg gaggg 35
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggtcgacat ggacaggagg cattctgtaa tat 33
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaaaggctc ctctcaccat ag 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcacatcaac caaacagcga at 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caaaagatgg cagatgctga ggat 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catgacacca gtatgacgag gtcg 24
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tctagaatgg attatcagta tattcttgga ggg 33
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggatccttaa tggacaggag gcattctgta atatgc 36
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
actatccttc gcaagaccct tcctc 25
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttaatggaca ggaggcattc tgtaat 26
Claims (9)
1.一种紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)紫花苜蓿SE1基因的克隆及序列分析；
(2)生物信息学分析；
(3)亚细胞定位；
(4)原核表达；
(5)苜蓿鲨烯环氧酶MsSE1的表达；
(6)构建MsSE1基因的超表达载体及对紫花苜蓿遗传转化。
2.根据权利要求1所述的紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，根据NCBI中已知的的截型苜蓿的鲨烯环氧酶基因的CDS序列，利用Primer5.0设计1对引物P1和P2，如SEQ ID NO:1-2所示；以紫花苜蓿第一链cDNA为模板进行PCR扩增；PCR程序为94℃5min；94℃30sec；55℃30sec；72℃2min；72℃5min；反应结束后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，然后切胶回收；将回收产物连接到pEASY-T3克隆载体上并将重组质粒转化至Trans-T1大肠杆菌感受态细胞内；用卡那抗生素筛选菌落，挑取阳性菌落进行测序鉴定。
3.根据权利要求2所述的紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为，应用DNAMAN程序和NCBI/BLAST数据库对同源克隆的目的基因进行序列的同源性比对和进化树分析；利用SOPMA程序对编码的蛋白序列理化性质分析；借助生物学软件SignalP4.1Server软件进行信号肽预测；采用TMHMM Server在线软件预测蛋白质的跨膜区和疏水性；利用Interpro数据库进行蛋白结构域功能分析。
4.根据权利要求3所述的紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为，通过在线软件TargetP 1.1和PSORT prediction预测目标基因编码蛋白质的亚细胞定位；利用Primer5.0设计上下游引物SE1-GFP-f和SE1-GFP-r9，各含有Xho Ⅰ和SalⅠ酶切位点，并扩增出目的基因编码区序列，使目的基因以正确的方向整合到瞬时表达载体pA7-GFP中；通过基因枪轰击的方法，将含有目的基因编码区序列的亚细胞瞬时表达载体pA7-GFP转入洋葱表皮，在35S强启动子驱动下，融合蛋白在洋葱表皮细胞中过量表达；绿色荧光蛋白GFP在蓝色波长光下显示绿色荧光，根据融合蛋白的荧光信号确定SE1基因编码的蛋白在细胞内的定位。
5.根据权利要求4所述的紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法，其特征在于：所述步骤(4)具体为，设计两个引物方案：方案1：将SE1 cDNA整个编码区序列插入原核表达载体；方案2：将SE1编码区序列N末端截掉25个氨基酸的序列插入原核表达载体；
根据上述方案分别设计2对引物：SE1--PE-f和SE1--PE-r，SE1--PE-r扩增全长SE1编码区；SE1--PE-f和SE1-PE-SPt-f，SE1-PE-SPt-f扩增N端截掉25个氨基酸的SE1序列；具体如SEQ ID NO:3-5所示，分别扩增出目的编码区序列，再将目的片段连接到pEASY-E2载体中；将两种原核表达重组子pEASY-E2-SE1和pEASY-E2-SPtSE1，以及空载体pEASY-E2-Control分别转入大肠杆菌Transetta，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃诱导重组蛋白表达，并收集菌体进行SDS-PAGE检测。
6.根据权利要求5所述的紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法，其特征在于：所述步骤(5)具体为，中苜3号幼苗经紫外伤害、黑暗处理、MeJA、ABA、GA3处理后，分别在不同时间点收集根、茎、叶组织提取总RNA，采用qRT-PCR分析目的基因的相对表达量。分别以SE1-RT-f1和SE1-RT-r1和Actin-f和Actin-r为引物，如SEQ ID NO:8-11所示，检测目的基因MsSE1和看家基因β-actin的转录水平，采用ABI公司的Real Time PCR System 7300进行扩增，3个生物学重复；在目的基因与内参基因扩增效率相同情况下，计算实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，即相对值为2-ΔΔCt，其中公式为：
ΔΔCt＝(CttreatM-Cttreata)-(CtckM–Ctcka)
CttreatM:实验组目的基因，Cttreata：实验组内参基因，CtCkM：对照组目的基因，CtCKa：对照组内参基因，Ct：当扩增产物的荧光信号达到设定的阀值时所经过的扩增循环数；
取MeJA处理组中不同处理时间的根、茎、叶样品粉碎后经石油醚脱脂，-80℃冻干70小时，取出后过60目筛，置于干燥器中长期保存；精密称取30mg冻干样品各3份，用1mL70％乙醇在超声清洗机中提取30min，4℃过夜，再次超声30min；1000g离心30min，取上清液100μL注入已预处理的SPE柱，分别用5mL水和5mL30％甲醇冲洗后，再以甲醇洗脱4次，每次1mL；合并洗脱液置于10mL具塞试管中进行比色测定；以空白平行样作对照，用分光光度计在545nm处测定各管中溶液的吸光度，计算皂苷含量。
7.根据权利要求6所述的紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法，其特征在于：所述步骤(6)具体为，用SE1-P1、SE1-P2为扩增引物，如SEQ ID NO:12-13所示，，扩增出含有Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的MsSE1基因片段，回收纯化PCR产物，再将目的片段连接到pEASY-T3载体；测序并提取含有正确序列的重组质粒，用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ快速限制性内切酶对pBI121和重组子pEASY-T3-pMsSS进行双酶切，在T4连接酶的作用下将目的基因编码区序列插入到植物超表达载体pBI121中，构建目的基因超表达载体，并转化农杆菌EHA105；然后采用农杆菌介导法转化紫花苜蓿中苜3号。
8.根据权利要求7所述的紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法，其特征在于：还包括转基因苜蓿的鉴定，具体为以紫花苜蓿卡那霉素抗性植株基因组DNA为模板，以空载体PBI121转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿DNA作为阴性对照和121-SE1质粒作为阳性对照，以pBI121上的35S启动子的上游引物35S-f和SE1基因的下游引物SE1-r作为引物，如SEQ IDNO:14-15所示，进行PCR扩增，以检测转基因苜蓿。
9.权利要求1-8任一所述的紫花苜蓿过表达鲨烯环氧酶基因的方法在培育高皂甙含量苜蓿品种中的应用。
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