CN103789328A - 玫瑰功能基因RrFLS1在调控植物类黄酮代谢中应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种玫瑰功能基因RrFLS1在调控植物类黄酮代谢中的应用。分离得到玫瑰花色功能基因RrFLS1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其对应的蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。转化试验表明：该基因能够改变植物特别是烟草的花色，提高植物类黄酮的含量。将该基因转化烟草，使转基因植物的花色发生改变，类黄酮含量增加，转基因烟草花瓣颜色由粉红色变成白色。

Description

玫瑰功能基因RrFLS1在调控植物类黄酮代谢中应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种玫瑰功能基因RrFLS1片段的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物类黄酮代谢有关。将该基因的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结合后直接转入一般植物体，转基因植株的花色发生变化,类黄酮含量也增加了。

背景技术

类黄酮（Flavonoids)是一类在植物中广泛存在被研究最深入的多酣类次生代谢产物，目前发现的大约有6000多种（乔小燕等，2009)。类黄酮在植物界分布最多的是被子植物，种类最全，含量较高；大量研究证实类黄酮化合物是一种强活性氧自由基清除剂，它可以通过抗自由基活性、抗氧活性、抗脂质氧化活性和金属螯合活性而发挥抗氧化活性（Benavente,1993;Bombardelli and Morazzoni,1993)。国内报道沙棘总黄酮、槲皮素、卢丁、甘草黄酮、灯盖花素等都具有不同程度抗氧化作用（孟申等，1992)。目前已经发现多种具有抗癌功能的类黄酮物质，如山奈素、槲皮素和杨梅酮等类黄酮，可以通过诱导细胞调亡发挥抗癌功能（Kampaera,2007)；国内外科研工作者发现类黄酮化合物具有降血脂、胆固醇的作用，还具有抑制血栓和扩张冠状动脉的功能，因此可以用于治疗心脑血管系统的一些疾病。

玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)是蔷薇科蔷薇属落叶丛生灌木，花型秀美，芳香四溢，色彩绚丽，在中国传统名花中评价极高，素有“花中皇后”之称。玫瑰具有重要的经济价值,其花瓣叶片含有多种类黄酮物质，应用于医疗、保健等。

目前尚未见玫瑰功能基因RrFLS1在调控植物类黄酮代谢中的应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种分离的玫瑰功能基因RrFLS1，本发明的目的还涉及该基因在调控植物类黄酮合成中的应用，所述的基因与花色的形成相关。

本发明提供了玫瑰中表达RrFLS1的基因编码序列及其功能，具体包括：RrFLS1基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体的构建，以及将该基因转化宿主烟草，对转基因烟草植株进行分子鉴定和表型观察，以评估该基因在在调控植物类黄酮代谢中的应用的前景。

本发明通过以下技术方案实现：

首先从玫瑰中克隆出RrFLS1功能基因。该基因片段为具有特定序列的DNA分子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其开放阅读框（编码区）为1008bp。

本发明还提供了这种玫瑰RrFLS1蛋白编码序列，它有335个氨基酸残基，其对应的蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了用于调取获得玫瑰样品中基因RrFLS1的一对核苷酸引物。该引物对根据基因RrFLS1设计，使用该对引物对玫瑰花瓣样品cDNA进行PCR扩增可获得1008bp的基因片段。所述引物对的DNA序列如下所示：

P1正向引物:5’ATGGGGGTAGAGAGAGTTCAAG 3’(序列见序列表SEQ ID NO：3)；

P2反向引物:5’TTACTGGGGGATCTTGTTGA 3’(序列见序列表SEQ ID NO：4)。

本发明还提供了一对用于检测玫瑰RrFLS1基因在转基因烟草中表达的核苷酸的引物对。该引物对根据基因RrFLS1设计，使用此对引物对转化该基因的烟草样品cDNA进行RT-PCR扩增,检测该基因是否在转基因烟草中表达，可获得176bp的基因片段。该引物对的DNA序列如下所示：

P3正向引物:5’TGGAGGGATACGGAACATTTTTA 3’(序列见序列表SEQ ID NO：5)；

P4反向引物:5’CACCACCTTGTGTAGATTCTTTGC 3’(序列见序列表SEQ ID NO：6)。

可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，例如可以通过直接DNA转化、电导、农杆菌介导等常规生物技术方法将本发明提供的RrFLS1的编码基因导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。使用本发明的基因片段构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前面可加上任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物（例如卡那霉素或潮霉素等）。被转化的宿主是包括烟草在内的多种植物，培育不同花色的植物种类。

与本发明的配套的，本发明还提供了一种转基因烟草代谢物提取方法，这对于全面理解本发明的技术方案是有益的。方法是准确称取0.5g转基因烟草植株的叶片和花瓣，加入2.5mL提取液（甲醇︰盐酸︰水体积比=70︰0.1︰29.9）于黑暗条件下4℃浸提24h，期间每隔6h用旋转振荡器振荡1min。12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中，再用孔径0.22μm的尼龙微孔滤器过滤后，保存于–40℃冰箱中，用于花青苷与其他类黄酮的HPLC-DAD分析。

本发明的配套方法还提供了一种转基因烟草植株中类黄酮代谢物检测方法。具体是：使用日本岛津公司生产的“岛津液相系统”进行定性分析，步骤包括：LC-20AT型二元梯度泵，SIL-20AC自动进样器，CTO-20AC色谱柱控温箱，SPD-20AC检测器,LC-Solution工作站；色谱柱为日本Tosoh株式会社生产的TSK gel ODS-80Ts QA反相硅胶柱（4.6mm×250mm，粒径5μm，日本Tosoh株式会社）。分析条件：流速0.8mL·min-1，柱温35℃，进样体积10μL，200～800nm范围内全波长扫描吸收光谱，在520nm和360nm波长下一次性同时检测花青苷和花黄素。流动相组成为：A相，10%甲酸超纯水（体积比）；B相，乙腈。分析时间35min。梯度洗脱程序为：0min，90%A，10%B；20min，70%A，30%B；25min，90%A，10%B。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的包含有RrFLS1基因编码区的DNA片段（其中1-1008bp为CDS）。序列全长为1008bp，编码335个氨基酸。

序列表SEQ ID NO:2是上述RrFLS1基因片段对应的蛋白质的序列。

序列表SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4是扩增上述玫瑰花瓣样品cDNA的引物对的DNA序列。

序列表SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6是检测转基因烟草中表达基因片段引物对的DNA序列。

图1：是原始超量植物表达载体pCAMBIA2300s结构示意图（载体大小为11630bp）。

图2：对照早花烟草与转化RrFLS1基因的早花烟草的花色比较图。图中：图2A是对照早花烟草花色；图2B是本发明转RrFLS1早花烟草的花色。

图3：RrFLS1基因在转基因植株中的表达量情况图。图3A是RrFLS1基因在转基因烟草植株中的表达量图；图3B是烟草看家基因在转基因烟草以及早花烟草中的表达量图；上述图3A和图3B中：M为分子量大小，泳道1-3为3个转基因株系，P为质粒，CK为早花烟草（作为转基因早花烟草的对照）。

图4：对照早花烟草与转化RrFLS1基因的早花烟草花瓣代谢物HPLC图。图中：图4A为早花烟草花瓣520nm下的HPLC图；图4B为早花烟草花瓣360nm下的HPLC图；图4C为转RrFLS1早花烟草花瓣520nm下的HPLC图；图4D为转RrFLS1早花烟草花瓣360nm下的HPLC图。

图5：对照早花烟草与转化RrFLS1基因的早花烟草花瓣代谢物含量图。图中：图5A为花青素含量比较图；图5B为类黄酮含量比较图；图5A和图5B中标记说明：CK为早花烟草；FLS1-5、FLS1-10、FLS1-12为3个转基因烟草株系。

图6：表达载体pCAMBIA2300s-RrFLS1构建图（插入片段大小为1008bp）。

具体实施方式

实施例1：分离、克隆RrFLS1基因

本发明的前期工作对丰花玫瑰（又称“平阴一号”，http://tc.cctv.com/20100412/103621.shtml，丰花玫瑰的选育文献已经公开发表，见：吕传润（平阴玫瑰研究所），玫瑰新品种-丰花玫瑰及栽培技术，山东林业科技，2007，5：77；华中农业大学园艺林学学院园艺植物生物学花卉实践教学基地从山东省平阴县平阴玫瑰研究所引种）不同时期的花朵进行了转录组测序（转录组测序由深圳华大基因科技有限公司完成），在转录组测序结果中得到了RrFLS1基因的全长序列。根据转录测序RrFLS1基因的已知序列全长，设计特异引物P1（见序列表SEQ ID NO：3）正向引物5’ATGGGGGTAGAGAGAGTTCAAG 3’和P2(见序列表SEQ ID NO：4)反向引物5’TTACTGGGGGATCTTGTTGA 3’，将测序序列的1-1008bp的片段从玫瑰品种‘丰花’（即丰花玫瑰）花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来，扩增得到的片段如下所示（见序列表SEQ ID NO：1）：

ATGGGGGTAGAGAGAGTTCAAGACATTGCTTCTGCAACTTCCAAGGACACAATCCCAGTGGAGTTCATCAGGTCAGAGAATGAGCAGCCTGGAATCACCACCGTCCCCGGCACAGTCCTCGAGTGCCCTATCATTGATTTCAGCGACCCTGATGAGGAGAAACTCCTCAAACAAATCTTCGAGGCCAGCACCGACTGGGGCATGTACCAAATCGTGAACCACGACATTTCTAACGAGGCCATTGCCAAGTTGCAGGCCGTCGGAAAAGAGTTCTTTGAGCTTCCGCACGAGGAGAAAGAGGTTTACGCAAAAGATCCGAACTCTAAGTCCGTGGAGGGATACGGAACATTTTTACAGAAGGAACTAGAAGGGAAGAAAGGGTGGGTGGATCATCTGTTCCATAAGATTTGGCCACCTTCTGCCATTAACTACTGCTTTTGGCCTAAGAATCCAGCTTCTTACAGGGAAGCTAATGAAGAGTATGCAAAGAATCTACACAAGGTGGTGGAGAAGCTATTTAAACTGTTATCTTTGGGGTTAGGGCTTGAAGCACAAGAACTGAAGAAGGCAGTTGGTGGTGATGACTTGGTGTACCTTCTCAAAATTAATTACTACCCGCCTTGTCCCCGCCCTGATCTTGCTCTTGGTGTGGTTGCCCATACGGACATGTCCGCCCTCACCATTCTCGTCCCAAACGACGTTCAGGGCCTCCAAGCTTGCCGAGATGGCCAGTGGTACGATGTCAAATATATCCCTAATGCCCTAGTCATCCACATTGGTGATCAAATGGAGGTAATGAGCAATGGAAAGTTCAAGGCTGTGCTGCACAGAACCACAGTGAGCAAAGACAAGACGAGAATCTCTTGGCCAGTGTTTCTGGAACCTCCACCAGACCATATAATAGGGCCTCACCCCAAGCTCGTCAATGATAAGGAGAATCCACCAAAGTACAAGACCAAGAAGTACAGCGAGTATGTCTACAACAAGCTCAACAAGATCCCCCAGTAA

扩增产物中的1-1008bp就是本发明的序列。

具体步骤为：

1、采用常用的CTAB法（参照：《植物基因工程》，王关林，方宏筠主编）从玫瑰品种‘丰花’中提取花瓣总RNA，具体步骤如下：

1）向离心管中加入CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取缓冲液（2%（W/V）CTAB，NaCl1.4mol/L,EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L，Tris·Cl 100mmol/L，2%（W/V）pvp）和10%的β-巯基乙醇，在水浴锅中预热。

2）将玫瑰花瓣用液氮冷却研磨，加入提取液中，混匀，65℃水浴10分钟

3）加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24：1）混合液，颠倒混匀，静置10min，4℃下12000g离心10min

4）取上清，重复步骤3）

5）取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴10-12小时，12000g，4℃离心15分钟，弃上清，用75%乙醇清洗沉淀两次，溶于适量的DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水中待用。

6）以从玫瑰品种‘丰花’中提取花瓣总RNA为模板，利用反转录酶（购自宝生物工程大连有限公司）将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为：65℃5min,42℃50min，70℃10min。

7）根据转录测序中的序列设计的特异引物P1(见序列表SEQ ID NO：3)5’ATGGGGGTAGAGAGAGTTCAAG 3’和P2(见序列表SEQ ID NO：4)5’TTACTGGGGGATCTTGTTGA 3’，将RrFLS1基因片段从玫瑰品种‘丰花’花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来。

反应条件：94℃预变性4min;94℃30sec，60℃30sec,72℃1min,37个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入

18-T载体（购自宝生物工程大连有限公司），筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。我们将该克隆被命名为

18-RrFLS1质粒。

实施例2：RrMYB11基因超量表达载体的构建，转化

为了能更好地阐明该基因的功能，我们将该克隆的基因在烟草中超量表达，从转基因植株的表型来验证其功能。具体步骤是：首先将实施例1中得到的阳性克隆

18-RrFLS1质粒用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切回收目的片段；同时，用同样的方法酶切携带双烟草花叶病毒启动子35S的遗传转化载体pCAMBIA2300s(该遗传转化载体由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建和赠送)。酶切完毕，用包含RrFLS1基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2300s（图1）载体做连接反应，转化大肠杆菌DH5α（大肠杆菌菌株购自宝生物工程大连有限公司）。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体，将其命名为pCAMBIA2300s-RrFLS1。

通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法将其导入到早花烟草中，经过侵染、共培养、筛选同时具有卡那霉素抗性和潮霉素抗性的转化苗，再通过生根、练苗移栽等常规步骤，得到转基因植株。

本发明的遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述：

（1）试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA（6-BenzylaminoPurine，6-苄氨基嘌呤）；NAA（Naphthalene acetic acid，萘乙酸）；Kan（Kanamycin，卡那霉素）；Cef（Cefotaxime，头孢霉素）；Hyg（Hygromycin，潮霉素）

（2）用于早花烟草遗传转化的培养基配方

表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。

表1 转基因早花烟草的相关培养基设计

注：1/2MS，MS培养基的配制参见：Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant,1962,15:473-497报道的方法。

表1中的Kan（Kanamycin，卡那霉素）、Cef（Cefotaxime，头孢霉素），Hyg（Hygromycin，潮霉素），采用0.45μm滤膜过滤方法灭菌，在上述除Kan、Hyg、Cef成分以外的培养基经按常规方法即：121℃高压蒸汽灭菌20min后,待培养基冷却至50-60℃时，在超净工作台上加入上述Kan、Hyg、Cef成分。

（1）农杆菌介导的遗传转化步骤

1）农杆菌的培养

首先，在带有对应抗性选择的固体LB培养基（10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、Kan100mg/L；琼脂1.5g/L）上预培养农杆菌EHA105 48小时，培养温度28℃；挑取预培养农杆菌单菌落，接种于对应抗性选择的液体LB培养基（10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、Kan100mg/L）中，于28℃200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD₆₀₀值大约为0.6。

2）叶盘转化法

a.剪取转基因的早花烟草无菌苗上部完全展开的幼嫩叶片，将叶片剪成0.8cm×0.8cm大小小块，放入无菌烧杯中；

b.将准备好的菌液倒入烧杯，轻轻摇晃烧杯。叶片在菌液中浸泡10min；

c.将步骤b中的叶片取出，转移至灭好菌的滤纸上吸干；然后放置在如上所述的共培养培养基上暗培养三天，培养温度为28℃；

d.三天后，将叶片转入如表1所述的出芽选择培养基上，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，进行Kan和Hyg抗性芽的筛选分化，培养温度为28℃；

e.抗性芽形成后，将其切下，转入如表1所述的壮苗选择培养基上，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，进行Kan和Hyg抗性苗的筛选，培养温度为28℃；

f.将筛选得到的抗性苗转入表1所述的生根选择培养基上使其生根，采用光照和暗培养交替培养(光照强度1000-1500lx,光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)，培养温度为28℃。

2）移栽

洗掉转基因早花烟草植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的一个周内保持水分湿润。

本实施例共获得20个转基因株系，将经PCR检测为阳性的转入质粒pCAMBIA2300s-RrFLS1的T₀代转基因烟草。

实施例3：RrFLS1基因转基因T₀代在田间的表型观测与RT-PCR检测

转基因早花烟草植株下地移栽后，直至开花期，将转基因早花烟草的花型与未转化早花烟草（对照“CK”）的花色进行比较，发现转RrFLS1基因的烟草的花色发生改变：没有转化的早花烟草花色为粉红色（见图2A）;转RrFLS1基因的早花烟草花色变为白色（图2B）。

为了验证转基因早花烟草花色的改变是否与转入的RrFLS1基因有关，本发明采用了常用的RT-PCR方法对部分转基因早花烟草植株中RrFLS1基因表达进行了检测（结果见图3）。具体步骤如下：采用TRIZOL试剂（购自宝生物工程大连有限公司）从转基因烟草1-6号株系中提取花的总RNA（提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书操作），利用反转录酶（购自宝生物工程大连有限公司）将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为65℃5min,42℃50min，70℃10min。先用报道的看家基因eIF（登录号X79009）对反转录得到的cDNA进行检测和浓度调整，根据看家基因eIF（大小写不一致）的序列设计一对引物P5正向引物(5-GCAGCCGTGATCACACAGTATCT)和P6反向引物(5-ACACCCTTCCTTCCAAAACGT)，进行PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min;94℃30sec，60℃30sec,72℃30sec,28个循环；72℃延伸10min。试验结果如图3所示，看家基因eIF在早花烟草和转基因早花烟草中均能扩出，并且亮度一致。然后，根据RrFLS1基因的序列，在靠近3’端设计一对引物P3(见序列表SEQ ID NO：3)正向引物（5-TGGAGGGATACGGAACATTTTTA）和P4(见序列表SEQ IDNO：4)反向引物（5-CACCACCTTGTGTAGATTCTTTGC，进行RT-PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min;94℃30sec，60℃30sec,72℃1min,35个循环；72℃延伸10min。试验结果表明，3株转基因烟草内均检测到有RrFLS1基因的表达，结果如图3所示。图3中显示：1-3：为本发明构建的转化载体pCAMBIA2300s-RrFLS1的PCR扩增结果，CK：为没有转化的早花烟草的PCR扩增结果，P：为转入质粒pCAMBIA2300s-RrFLS1的转基因早花烟草的PCR扩增结果。

实施例4:转RrFLS1早花烟草次生代谢物的提取与测定

准确称取0.5g转基因早花烟草叶片和花瓣，加入2.5mL提取液（甲醇︰盐酸︰水体积比=70︰0.1︰29.9，）于黑暗条件下4℃浸提24h，期间每隔6h用旋转振荡器振荡1min。12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中，再用孔径0.22μm的尼龙微孔滤器过滤后，保存于–40℃冰箱中，用于花青苷与其他类黄酮的HPLC-DAD分析。使用日本岛津公司生产的岛津液相系统进行定性，包括：LC-20AT型二元梯度泵，SIL-20AC自动进样器，CTO-20AC色谱柱控温箱，SPD-20AC检测器,LC-Solution工作站；色谱柱为日本Tosoh株式会社生产的TSK gel ODS-80Ts QA反相硅胶柱（4.6mm×250mm，粒径5μm，日本Tosoh株式会社）。

分析条件：流速0.8mL·min-1，柱温35℃，进样体积10μL，200～800nm范围内全波长扫描吸收光谱。流动相组成为：A相，10%甲酸-超纯水（体积比）；B相，乙腈。分析时间35min。梯度洗脱程序为：0min，90%A，10%B；20min，70%A，30%B；25min，90%A，10%B。

运用HPLC-DAD方法，分别用520nm与360nm同时检测花瓣中花青苷和花黄素。采用标准品半定量法分别计算干花中含有的相对于标准品的花青苷和花黄素的含量（μg·g-1FW）（Wang et al.，2001）。其中花青苷标准品使用上海同田生物技术有限公司生产的矢车菊素–3–葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，Cy3G），花黄素的标准品为中国药品生物制品检定所生产的槲皮素–3–芸香糖苷（quercetin-3-O-rutinoside，Rutin）。

本发明首次克隆得到玫瑰黄酮醇基因，申请人将这个基因命名为RrFLS1基因。通过构建超量表达载体pCAMBIA2300s-RrFLS1，导入到早花烟草中，使烟草花色由粉红色变为白色，类黄酮含量显著增加。玫瑰黄酮醇合成酶基因的分离，为我们通过植物基因工程的手段调控园艺花卉中黄酮类化合物的含量，改善植物品质，培育新品种奠定了分子生物学基础。

主要参考文献

1乔小燕，马春雷，陈亮.植物类黄酮生物合成途径及重要基因的调控[J].天然产物研究与开发，2009.21:354-360.

2 Benavente GO.Changes in neodiosmin levels during the develogpment of a Citrus auraniumleaves and fruits.Postulation of neodiosmin biosynthetic pathway[J].Agriculture Food Chemistry,1993.41:1916-1919.

3 Bombardelli E and Morazzoni R The flavonoids:new perspectives in biological activities andtherapeutics[J].Chimica Oggi,1993.11:25-28.

4孟申，张之南.中药有效成分抗氧化作用的实验研究[J].中国药理学通报，1992.22(5):8-12

5 Kampa M,Nifli AP,Notas G,et al Polyphenols and cancer cell growth[J].Reviews ofPhysiology,Biochemistry&Pharmacology,2007.159(1):92-113.

Claims (2)

1.核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示的玫瑰功能基因RrFLS1在调控植物类黄酮代谢中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的植物是烟草。

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