CN108004267A

CN108004267A - 一种利用基因工程技术延长番茄果实货架期的新方法

Info

Publication number: CN108004267A
Application number: CN201711447755.6A
Authority: CN
Inventors: 汪松虎; 蒲勤华; 许春燕; 黄维藻; 李辉; 高兰阳
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN108004267B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术延长番茄果实货架期的新方法。货架期主要与乙烯合成、乙烯信号传导和细胞壁降解等相关，现有技术虽有一些对相关目标操控基因的研究，但这些基因修饰后并未有效延缓果实的成熟和软化，或者虽能延缓果实的成熟和软化，但同时也影响果实的营养成分、活性成分等，不适于生产应用。本发明发现番茄的SlEB1基因与乙烯的合成及细胞壁降解密切相关，沉默该基因后，转基因生成的番茄货架期极显著延长，可实际应用于生产和生活中。

Description

一种利用基因工程技术延长番茄果实货架期的新方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术延长番茄果实货架期的新方法。

背景技术

番茄是果实类蔬菜的代表。番茄果实色彩鲜艳、肉厚汁多、风味独特，且富含多种维生素、有机酸、氨基酸、矿物质和类黄酮等，不仅营养价值高，还具有抗氧化、助消化、降血脂和抑癌等诸多益处，故深受消费者喜爱。

全球每年番茄净产值超过500亿美元，但因番茄的货架期很短，每年超过总产量的25％都腐烂变质，经济损失巨大。番茄果实属呼吸跃变型果实，其特点是在果实成熟初期呼吸作用加强，大量合成乙烯，果实在短期内迅速过熟软化。软化后的果实在储藏和运输过程中极易损伤，进而被腐败微生物侵染，腐烂变质。因此，如何延长番茄果实货架期一直是农业和食品领域的重要研究方向。

目前，国内外延长番茄果实货架期的方法大致可分为物理方法、化学方法和生物学方法。物理方法指借助特定的设备，控制储藏环境的温度或气体，以降低果实的呼吸和代谢速率而延缓果实过熟软化，或者直接杀灭储藏环境中和果实表面的微生物以减少果实的腐烂。化学方法指对果实喷施或涂抹化学药物，以延缓果实过熟软化或杀灭果实表面的微生物而减少果实的腐烂。物理方法和化学方法都能有效延长番茄果实的货架期，但是成本高，或有化学残留，易影响番茄的风味。生物学方法主要指利用基因工程技术修饰番茄果实过熟软化的有关基因，延缓果实过熟软化过程，或增强果实对微生物的抗性。利用生物学方法一旦育成品种，无需借助特殊的设备或使用化学药物即可延长番茄果实货架期，成本低廉且安全性好，是公认的延长番茄果实货架期最理想的方法。

生物学方法的难点和关键在于研究并找到调控番茄果实成熟软化或微生物抗性的合适的基因，利用基因工程技术修饰这些基因后既要能延长果实货架期，又不影响果实的营养成分、活性成分和风味等。目前基因工程的目标操控基因主要包括乙烯合成、乙烯信号传导和细胞壁降解的相关基因，这些基因中，有些基因修饰后并没有明显地延缓果实的成熟和软化，有些基因修饰后虽能有效延缓果实的成熟和软化，但同时也影响果实的营养成分、活性成分和风味等，并不适合生产应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因工程技术延长番茄果实货架期的新方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种利用基因工程技术延长番茄果实货架期的新方法，所述基因工程技术中，选择的基因为番茄的SlEB1基因。

优选的，所述SlEB1基因包括SlEB1a基因和SlEB1b基因；所述SlEB1a的DNA序列如SEQ ID NO 1所示；所述SlEB1b的DNA序列如SEQ ID NO 2所示。

相应的，所述的利用基因工程技术延长番茄果实货架期的新方法，其具体步骤为：

(1)构建同时沉默SlEB1a基因和SlEB1b基因的RNAi载体：pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi；

(2)用所述RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi转化农杆菌；

(3)用农杆菌介导的遗传转化法转化番茄种子，常规种植后得到货架期延长的转基因番茄。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种利用基因工程技术延长番茄果实货架期的新方法，对番茄保存具有极大的应用价值；

2、本发明发现了SlEB1基因在番茄生长发育过程中的新作用，其与乙烯的应答和信号转导密切相关，沉默该基因可有效延长番茄的货架期；

3、有别于现有技术中已证实的番茄果胶裂解酶基因，本发明提供了一种新的与乙烯的应答和信号转导密切相关的基因，为延长番茄的货架期提供了新思路，为深入研究番茄的基因组应用提供了理论基础。

附图说明

图1为SlEB1a和SlEB1b基因在番茄不同组织中的表达情况；

图2为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi破色后果实皱软对比图；

图3为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi破色后果实重量变化对比图；

图4为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi绿熟期果实果皮角质层、细胞壁对比图(Bar＝20μm)；

图5为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi绿熟期果实角质层厚度对比图；

图6为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi绿熟期果实细胞壁厚度对比图。

具体实施方式

实施例涉及的试剂、材料、仪器和测序说明：

本发明所用氯仿、异丙醇、乙醇等常规化学试剂购自成都市科龙化工试剂厂；

RNase-free的吸头和离心管购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；

RNase-free ddH₂O、DNA回收试剂盒、DNA连接试剂盒、定量PCR试剂盒、基因组DNA提取试剂盒和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自康为世纪生物科技有限公司；

反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；

高保真PCR酶购自北京全式金生物技术有限公司；

限制性内切酶和TRIzol Reagent购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

农杆菌EHA105感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

DNA测序和引物合成均在成都擎科梓熙生物技术有限公司进行。

所用离心机为：ThermoFisher高速冷冻离心机，型号ST16R。

实施例一：番茄SlEB1基因的cDNA克隆和时空表达分析

1、SlEB1基因序列分析

搜索番茄基因组数据库，番茄有两个AtEB1同源基因，即SlEB1a(Solyc03g116370)和SlEB1b(Solyc02g092950)；SlEB1a的DNA序列如SEQ ID NO 1所示；SlEB1b的DNA序列如SEQ ID NO 2所示。

2、番茄总RNA的提取

(1)取等量番茄根、茎、叶、花和不同发育阶段的果实，分为各组，分别在液氮中充分研磨；再分别加入TRIzol Reagent(每100mg样品加入1mL TRIzol Reagent)，充分混匀后室温放置5min。

其中，所述不同发育阶段分别为：IG1(Immature Green1，绿色未熟I期)、IG2(Immature Green1，绿色未熟Ⅱ期)、IG3(Immature Green1，绿色未熟Ⅲ期)、MG(MatureGreen，绿熟期)、Br(Breaker，破色期)和RR(Red Ripening，自然红熟期)。

(2)每1mL TRIzol Reagent加200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min；4℃12000rpm离心15min，将上清转移到新的EP管。

(3)分别在各组的上清液中加入等体积的氯仿并充分混匀，4℃12000rpm离心15min，将上清转移到新的EP管；

(4)分别在步骤(3)得到的上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min；而后4℃12000rpm离心10min，去上清；

(5)分别对沉淀加1mL 75％的乙醇，4℃7500g离心5min，去上清，而后重复一次本步骤；

(6)再加1mL 75％的乙醇，4℃7500g离心5min，去上清；

(7)室温下，倒扣EP管晾干5min；加入30μL RNase-free ddH2O，55-60℃10min溶解沉淀；电泳检测总RNA的浓度和纯度。

3、番茄cDNA的合成

番茄的cDNA合成分以下两步进行：

(1)去除基因组DNA。

反应体系为5x gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，总RNA 2μg，RNase-free ddH₂O补齐至10μL；反应条件为42℃，2min。

(2)反转录cDNA。

反应体系为PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL，RT Primer Mix 1μL，5xPrimeScript Buffer 4μL，RNase-free ddH₂O 4μL；反应条件为37℃15min，85℃5sec。

(3)合成的cDNA于-80℃条件下保存。

4、SlEB1a和SlEB1b基因编码区的PCR扩增

以步骤3合成的cDNA为模板，PCR扩增SlEB1a和SlEB1b基因的编码区。

反应体系为cDNA 1μL，10μM Forward Primer 1μL，10μM Reverse Primer 1μL，2.5mM dNTP 5μL，5x Fast Pfu Bffer 10μL，TransStart Fast Pfu DNA Polymerase 1μL，ddH2O 31μL；反应条件为95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃5min。

SlEB1a和SlEB1b基因的PCR扩增引物如下：

SlEB1a-F:5’ATGGCGAATATAGGGATAATGG3’；

SlEB1a-R:5’TCAGCTTTTACTTCCATCCACG3’；

SlEB1b-F:5’ATGGCGGCACACATAGGAATGATGG3’；

SlEB1b-R:5’TCAATATGTCACAAGTGATCCAC3’。

5、SlEB1a和SlEB1b基因时空表达的定量PCR分析

本步所使用的定量PCR仪为ABI 7500型荧光定量PCR仪。

反应体系为2x Ultra SYBR Mixture 10μL，10μM Forward Primer0.4μL，10μMReverse Primer 0.4μL，cDNA 1μL，ddH₂O 8.2μL。

反应条件为95℃10min；95℃15s，60℃1min(40个循环)；95℃15s，60℃1min；95℃15s，60℃15s。

SlEB1a和SlEB1b基因以及β-actin内参基因的定量PCR扩增引物如下：

SlEB1a-QP-F:5’TGACATGGATCAATGCCAGG3’；

SlEB1a-QP-R:5’ACCTTGTGCATTGGAACAGCT3’；

SlEB1b-QP-F:5’TGCTACCAAAAATGCCTCGAC3’；

SlEB1b-QP-R:5’TCCACTTGAAGAAGGCCTCG3’；

Actin-F：5’TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC3’；

Actin-R：5’CAGTTAAATCACGACCAGCAAGAT3’。

结果如图1所示。

结果表明，SlEB1a基因在番茄不同组织中的表达差异很大，而SlEB1b基因在番茄不同组织中的表达相对稳定，这暗示SlEB1a基因可能在影响番茄果实货架期相关性状的表达中有更重要的作用。

实施例二：构建SlEB1a基因的过量表达载体和SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi载体

为验证SlEB1a基因的作用，构建了SlEB1a基因的过量表达载体；同时，考虑到SlEB1a和SlEB1b基因可能会有功能冗余，构建了SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi载体，以同时沉默SlEB1a和SlEB1b基因。

下文序列中，下划线上的序列表示序列后括号内对应限制性内切酶的酶切位点，如括号内存在多个内切酶，则序列所代表的酶切位点与括号内的内切酶按顺序一一对应；中的序列为接头序列。

1、SlEB1a过量表达载体的构建

为方便后续检测，利用融合PCR技术将GFP基因连接在SlEB1a基因的N端(5’端)，而后利用限制性酶切置换掉植物表达载体pBI121上的GUS基因，最终构建pBI121:GFP-SlEB1a过量表达载体。具体步骤如下：

(1)GFP和SlEB1a基因融合PCR

GFP基因PCR扩增模板为本实验室现有的植物表达载体pTEX:GFP-HA；

扩增引物为：

F1:5’CGC GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGA 3’(BamHI)；

R1:

SlEB1a基因扩增模板为5.2中的番茄组织cDNA，扩增引物为

F2:

R2:5’GAC GAGCTCTC AGCTTTTACTTCCATCCACG 3’(SacI)。

融合PCR方案：

1)将待融合的GFP F1/R1片段10ng和SlEB1a F1/R1片段10ng混合，不加引物和pfu酶，进行预PCR，反应条件为95℃5min；95℃30s，51℃30s，72℃1min(5个循环)；72℃5min。

2)加入上述引物F1和R2以及pfu酶，进行常规PCR反应，反应条件为95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃5min。

(2)pBI121:GFP-SlEB1a过量表达载体的构建

将上述融合PCR产物和pBI121载体分别用BamHI和SacI限制性内切酶双酶切，并电泳回收酶切片段；将回收的融合PCR产物和pBI121载体进行DNA连接反应，最终构建pBI121:GFP-SlEB1a过量表达载体。

2、SlEB1a/SlEB1b基因RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi的构建

构建思路：先分别从SlEB1a和SlEB1b基因中PCR扩增出一个200bp左右的DNA片段，然后用融合PCR技术将两片段融合成一个400bp左右的片段，再将该片段反向插入RNAi中间载体pSK-int的内含子两端，最后通过酶切和连接置换掉pBI121表达载体上的GUS基因，以构建同时沉默SlEB1a基因和SlEB1b基因的RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi。具体步骤如下：

(1)SlEB1a基因和SlEB1b基因RNAi片段的融合

以上述番茄组织cDNA为模板，PCR扩增SlEB1a基因和SlEB1b基因的RNAi片段，引物如下：

正向插入片段引物：

SlEB1aF1:CCG CTCGAGGGATCC ATGGCTGAAGCGTTACTGTGAG(Xhol I,BamHI)；

SlEB1aR1:

SlEB1bF1:

SlEB1bR1:CCC AAGCTT CCAGATTGATTTGTGCTGCT(HindIII)。

反向插入片段引物：

SlEB1aF2:GAC GAGCTC ATGGCTGAAGCGTTACTGTGAG(SacI)；

SlEB1aR2:

SlEB1bF2:

SlEB1bR2:CCG GAATTC CCAGATTGATTTGTGCTGCT(EcoR I)。

1)SlEB1a/SlEB1b基因正向插入片段融合PCR方案：将待融合的SlEB1a F1/R1片段10ng和SlEB1b F1/R1片段10ng混合，不加引物和pfu酶进行预PCR，反应条件为95℃5min；95℃30s，51℃30s，72℃1min(5个循环)；72℃5min。而后加入上述引物SlEB1aF1和SlEB1bR1以及pfu酶进行常规PCR，反应条件为95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃5min。该融合片段命名为：SlEB1aF1/SlEB1bR1。

2)SlEB1a/SlEB1b基因反向插入片段融合PCR方案：将待融合的SlEB1a F2/R2片段10ng和SlEB1b F2/R2片段10ng一定量混合，不加引物和pfu酶进行预PCR，反应条件为95℃5min；95℃30s，51℃30s，72℃1min(5个循环)；72℃5min。加入上述引物SlEB1aF2和SlEB1bR2以及pfu酶进行常规PCR，反应条件为95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃5min。该融合片段命名为：SlEB1aF2/SlEB1bR2。

(2)pSK-int RNAi中间载体的构建

1)酶切。将SlEB1aF1/SlEB1bR1和pSK-int载体分别用Xhol I和HindIII限制性内切酶双酶切。

片段酶切反应体系：10x FastDigest Green Buffer 5μL、XholI 2μL、HindIII 2μL、SlEB1aF1/SlEB1bR1PCR片段10μL(0.5μg)、ddH₂O 31μL。

pSK-int载体酶切反应体系：10x FastDigest Green Buffer 2μL、XholI 1μL、HindIII 1μL、pSK-int载体7μL(1μg)、ddH₂O 9μL。

反应条件均为37℃水浴锅，1h。

2)电泳及条带回收。酶切反应完后，琼脂糖凝胶(1％)电泳，紫外透射分析仪下照胶，迅速切下条带。

3)DNA回收。DNA回收使用康为世纪生物科技有限公司的回收试剂盒，按试剂盒说明书进行操作。

4)DNA连接。将回收的SlEB1aF1/SlEB1bR1片段和pSK-int载体连接，连接反应体系为：DNA片段3μL、载体3μL、T4 DNA Ligase 1μL、5x Buffer 2μL、ddH₂0 1μL，连接反应条件为22℃，1h。

5)大肠杆菌转化。在冰上，将10μL连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态，冰上放置30min；42℃热激60s；冰上放置2min；在超净台中加入LB培养液(5g/L Yeast extract，10g/L NaCl，10g/L tryptone)600μL，170rpm 37℃震荡培养50min；600rpm离心5min，留100-200μL培养液，弃去多余液体，混匀，将菌液均匀涂在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上；平板倒置37℃培养1d。

6)长出的菌落经DNA测序，测序检测成功后，即成功构建载体：pSK-int:SlEB1aF1/SlEB1bR1。

7)将上述构建的融合片段SlEB1aF2/SlEB1bR2和载体pSK-int:SlEB1aF1/SlEB1bR1分别用SacI和EcoRI限制性内切酶进行双酶切、电泳、DNA回收、DNA连接、大肠杆菌转化和DNA测序(具体步骤与上述步骤1)-6)相同)，从而构建pSK-int:SlEB1a/SlEB1b RNAi中间载体。

(3)RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi的构建

将上述的pSK-int:SlEB1a/SlEB1bRNAi中间载体用BamHI和SacI限制性内切酶双酶切，电泳回收SlEB1a/SlEB1bRNAi片段；再将pBI121载体用BamHI和SacI限制性内切酶双酶切，并电泳回收载体片段；然后将回收的SlEB1a/SlEB1b RNAi片段与pBI121载体片段连接，最终构建RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi(具体步骤与上述步骤1)-6)相同)。

实施例三：农杆菌介导的遗传转化法转化番茄品种AC⁺

整体思路为：将SlEB1a基因的过量表达载体pBI121:GFP-SlEB1a和SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi分别转化农杆菌EHA105，然后分别利用农杆菌介导的遗传转化法转化番茄品种AC⁺，番茄AC⁺种子来自本实验室保存。具体步骤如下：

1、农杆菌转化

在冰上，往农杆菌EHA105感受态细胞中加入10μL质粒，轻轻混匀，放置40min；液氮冷击1min；迅速放入37℃水浴锅孵育5min；冰上放置2min；在超净台中加入LB培养液(5g/LYeast extract，10g/L NaCl，10g/L tryptone)600μL，170rpm 28℃震荡培养4h；600rpm离心5min，留100-200μL培养液，弃去多余液体，混匀，将菌液均匀涂在含50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的LB固体培养基上；平板倒置28℃培养2d，长出的菌落经PCR验证后备用。

2、番茄遗传转化

(1)种子处理与播种

在超净台中将适量番茄品种AC⁺的种子置于50mL离心管中，用75％的乙醇处理2min，无菌水冲洗2～3次；再用20％的NaClO处理15min，无菌水冲洗10～20次；转移到无菌滤纸上晾干。

将无菌处理后的种子置于MS固体培养基(4.33g/L MS盐+1％蔗糖+0.7％琼脂粉，pH＝5.7)上，于25℃下，避光培养3天，待种子露白后，于25℃下光照培养16h。

(2)组织预培养

待上述番茄种子长出子叶后，取植株，在无菌培养皿中将子叶切块，转移到预培养基(4.33g/L MS盐+1％蔗糖+0.7％琼脂粉+1mg/L6-BA+0.04mg/L IAA，pH＝5.7)上，于22℃下避光培养3天。

(3)侵染

取无菌培养皿，加上步骤(1)所述农杆菌制备的菌液(OD₆₀₀约0.6)，而后将预培养的叶片浸入菌液中10min左右，取出叶片，在灭菌的滤纸上吸干菌液。

(4)共培养

将上述处理后的叶片转移至共培养基(4.33g/L MS盐+1％蔗糖+0.7％琼脂粉+0.2mg/L KH₂PO₄+0.1mg/L Kinetin+0.2mg/L 2,4-D+15mg/L乙酰丁香酮，pH＝5.7)，22℃避光培养3天。

(5)筛选

将共培养后的叶片转移至筛选培养基(4.33g/L MS盐+1％蔗糖+0.7％琼脂粉+500mg/L羧卞青霉素钠+100mg/L卡那霉素+2mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA，pH＝5.7)上，于25℃下光照培养16h，约20d继代一次，至其长出不定芽。

(6)生根

待所述不定芽长至2～3片叶后即可生根，切除底部多余的愈伤组织，移入生根培养基(4.33g/L MS盐+1％蔗糖+0.7％琼脂粉+500mg/L羧卞青霉素钠+2mg/L IAA，pH＝5.7)中，25℃光照培养16h。生根后的植株即为候选转基因植株。

实施例四：转基因植株的鉴定

1、取上述转基因植株的叶片，分别提取基因组DNA；以pBI121空载体为阳性对照，野生型植株基因组DNA为阴性对照。

以基因组DNA为模板，以NPTII-F:5’TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC3’和NPTII-R:5’GTCACCGACTTGAGCCATTTG3’为引物，PCR扩增NPTII基因(pBI121表达载体上的选择标记基因)片段；PCR产物进行电泳分析。长度为794bp的DNA片段电泳条带初步确定为转基因植株。

2、对过量表达GFP-SlEB1a基因的转基因植株，进一步提取叶片总蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用GFP抗体进行免疫检测，有预期大小的蛋白条带的最终确定为GFP-SlEB1a过量表达转基因植株。筛选出过量表达GFP-SlEB1a的转基因植株5株。

3、对SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi转基因植株，进一步提取植株叶片的总RNA并反转录成cDNA；利用定量PCR技术检测SlEB1a和SlEB1b基因的表达情况(内参基因及其引物与实施例一的步骤5相同)，SlEB1a和SlEB1b基因表达量(相对于野生型)均明显下降的确定为SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi转基因植株。筛选出SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi转基因植株7株。

实施例五：转基因植株的表型分析

为方便表达，将SlEB1a过量表达转基因植株简称为SIEB1-OE，SlEB1a/SlEB1b基因RNAi转基因植株简称为SIEB1-RNAi，野生型植株简称为WT。

1、果实软化、失水率和硬度变化比较

(1)果实软化测试

取转基因和野生型的Br+7(破色后7天)果实，在26～28℃，湿度为45％～60％下放置35天，观察果实的变化；结果如图2所示。

结果显示，在室温条件下放置，SIEB1-RNAi的转基因果实明显比野生型果实软化和皱缩得慢，而SIEB1-OE的转基因果实明显比野生型果实软化和皱缩得快。

(2)果实失水率测试

对步骤(1)的果实，每隔7天进行一次称重，并根据公式：PLW＝(Xo-Xn)/Xo，计算失水率。其中，Xo为果实起始重量，Xn为果实储存第n天的重量。结果如图3所示，具体数据如下：

放置7、14、21、28和35天后，WT的失水率分别为4.50％、11.32％、20.70％、42.26％、59.17％；SIEB1-OE的失水率分别为13.82％、26.75％、47.66％、57.98％、71.32％，显著高于WT的失水率；SIEB1-RNAi的失水率分别为3.72％、7.89％、16.62％、30.79％、41.70％，显著低于WT的失水率。

(3)硬度测试

分别摘取MG(绿熟期)、Br(破色期)、Br+3(破色后3天)和Br+7(破色后7天)四个不同成熟期的转基因果实和野生型果实，用GY-4数显果实硬度计测量其硬度。结果如表1所示。

表1不同发育阶段不同处理的果实硬度

表中，*、**代表T-TEST分析转基因果实和野生型果实硬度的差异显著性水平；*表示0.01＜P≤0.05，差异显著；**表示P≤0.01，差异极显著。

结果显示，转基因果实不同发育期的硬度，与同时期的WT果实硬度相比，SIEB1-OE果实的硬度更小，SIEB1-RNAi果实的硬度更大。

上述结果表明：SlEB1基因与番茄的软化程度、失水率和硬度变化极显著相关：SIEB1-RNAi转基因果实软化和皱缩明显减缓，失水率极显著下降，硬度保持度极显著提高。

2、转基因和野生型果实的表皮厚度和细胞壁厚度比较

分别取野生型和转基因植株MG果实，剥下果实赤道部位的果皮，用刀片切割横切面。用福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA)(50％或70％酒精90ml+冰醋酸5ml+37％～40％甲醛5ml)固定，依次加入70％、85％、95％、100％、100％乙醇进行系列脱水，每个浓度梯度处理2h，而后用石蜡包埋。而后用石蜡切片机切片，番红-固绿染色，在光学显微镜下观察果皮结构。果实表皮的角质层可以被番红染色呈现淡淡的粉红色，果实细胞壁可以被固绿染色呈现蓝绿色。结果如图4、5、6所示。

结果显示，与WT果实的角质层厚度(24.06μm)相比，SIEB1-OE果实的角质层厚度(17.78μm)变薄了26.17％，而SIEB1-RNAi果实的角质层厚度(31.40μm)变厚了30.51％。细胞壁厚度的变化与角质层厚度的变化类似，与WT果实细胞壁厚度(1.615μm)相比，SIEB1-OE果实的细胞壁厚度(0.8746μm)薄了45.85％，SIEB1-RNAi果实的细胞壁厚度(2.397μm)厚了48.42％。

上述结果表明，SIEB1基因与果实的细胞壁厚度和表皮厚度有极强的相关性，沉默SIEB1基因后，果实的细胞壁厚度和表皮厚度显著增加，SIEB1-RNAi转基因果实的货架期明显延长，可实际应用于生产和生活中。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种利用基因工程技术延长番茄果实货架期的新方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1042

<212> DNA

<213> 番茄SlEB1a基因(Solyc03g116370)

<400> 1

attgtgagtt tttgtttctt cctttttttc tcattccatc tgctttcgta gaattgaaac 60

aagaagaaaa atggcgaata tagggataat ggatagtgcc tattttgttg gaaggaatga 120

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<210> 2