CN106916848A

CN106916848A - 一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法

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Publication number: CN106916848A
Application number: CN201710232692.6A
Authority: CN
Inventors: 张波; 柳洪入; 陈昆松
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2017-04-11
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2037-04-11
Also published as: CN106916848B

Abstract

本发明提供一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法，通过真空渗透的侵染方式使基因在果肉组织中过量表达，可以用于基因功能的研究。该方法通过：1)桃果实成熟度的选择；2)桃果肉组织预侵染的感受态培养；3)将果肉浸泡于含基因序列的农杆菌侵染溶液；4)向果肉组织施加真空；5)释放真空实现基因转入；6)果肉组织侵染后的继续培养。本发明建立的基因瞬时表达方法，适用于果皮单薄、果肉组织没有空腔的桃果实，操作简单、表达水平高而且结果可靠，可为开展基因功能验证和筛选功能基因提供技术支持。

Description

一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种将目标基因在桃果实实现瞬时表达的方法。

背景技术

随着越来越多植物基因组测序的完成，以及转录组测序技术的发展，功能基因的挖掘正在成为植物生物学研究的重要内容。转基因技术是开展目标基因功能研究的主要手段。但是对于大多数植物，尤其是多年生果树而言，除了苹果、柑橘和葡萄等，大多数果树尚未建立稳定的转基因技术。转基因技术的缺乏已经成为果树功能基因挖掘的限制因子，也是影响果树分子生物学发展的瓶颈因素。相对于转基因技术的稳定表达特征，近年来发展了基于瞬时表达的功能基因筛选方法。随着目前国际上日趋强调的基于同源物种的基因功能验证，瞬时表达技术正得到越来越多的关注。

瞬时表达(transient expression)是指将目标基因通过特定的植物表达载体导入到植物活体内，在短时间内(可长达数天)表达，能够准确反应基因的功能，在启动子分析、蛋白互作和基因功能分析等方面用途广泛。瞬时表达的转化方法主要有农杆菌转化法、基因枪轰击法以及原生质体转化法几种。原生质体转化方法对材料有很大限制，目前主要在拟南芥叶片与玉米原生质体及水稻悬浮细胞中实施。基因枪轰击法对设备的要求较高，且每次得到的植物组织质量少，难以满足后续有关的生物学表型分析。农杆菌转化法具有简单快速、表达水平高和安全有效等特点。

基于农杆菌转化技术的瞬时表达方法，虽然近几年得到了不断完善和发展，但是在果实上的成功应用依然有限。目前仅限于有腔室的番茄，以及果皮肥厚的柑橘。上述两种果实的瞬时表达方法都是采用注射器直接注射农杆菌到果实组织实现的，但是该方法并不适合于果皮单薄、果肉组织没有空腔的桃果实。

桃原产中国的全球性重要果树，也是蔷薇科植物研究的模式果实。目前，桃已经有了较为完善的基因组数据库，需要从中筛选具有价值的基因并完成功能验证。但是由于缺乏再生体系和转基因技术，迫切需要在桃果实中发展基于瞬时表达技术的基因功能验证方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法，用于基因的功能验证研究，通过以下步骤实现：

1.桃果实成熟度的选择：

选择发育阶段在绿熟期到商业采收期之间的成熟度果实最好，即选择桃果实发育过程中的第一次快速膨大期结束到第二次快速膨大期结束期间的成熟度桃果实。

2.桃果肉组织切片的制作及预侵染的感受态培养：

(1)果实的消毒处理：选择果型正常，无机械伤和病虫害的果实进行后续实验。果实洗净去除表面污物,然后用50％的乙醇溶液消毒1min，再用有效氯含量在75-100mg·L^-1的次氯酸钠水溶液浸泡20min消毒，最后用无菌水漂洗3-5次，在无菌状态下晾干待用；

(2)果实切片的制作与预培养：选取距果实缝合线90°垂直的2个表面，成熟度较为一致的赤道面选取果肉部位，去除果皮组织后，将果肉组织切成为厚度为1cm面积大约为4-8cm²的小块，由于果实大小差异，果肉的切片数目于大小有所变化，将制备好的果肉切片放置在MS固体培养基上，黑暗条件下预培养24-30h。预培养的条件是23℃，80-85％相对湿度。

3.将步骤2中得到的易感状态的果肉切片浸泡于含目标基因的农杆菌和表面活性剂的侵染溶液，这些农杆菌细胞中含有目的基因的核苷酸序列：

(1)含有目标基因的农杆菌转化培养：将目标基因构建到植物双元表达载体PGreen002962-SK上，然后把重组质粒电转入农杆菌GV3101：：pSoup，在含有卡那霉素(50mg/L)、庆大霉素(50mg/L)的固体培养基28℃培养2天后，挑选单克隆菌株，PCR检验后加入5ml含卡那与庆大抗生素的LB中，过夜培养后，扩大培养体系到500ml，培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0，然后把菌液进行离心(4℃，5000g，10min)，待用；

(2)侵染溶液的制备：渗透液(10mM MES，10mM MgCI₂，150mM乙酰丁香酮，pH 5.6)中加入0.04％的表面活性剂混匀后，加入(1)中获得的农杆菌菌液，经过重悬浮后，常温放置2h，待用，表面活性剂可以选用三硅氧烷聚乙氧基化物或聚山梨醇酯20(20)，或辛基苯酚乙氧基化物(X-100)。

4.把目标基因转入果肉组织：

将经过预诱导的果肉切片装入网袋，置于含有步骤3的侵染溶液的容器中，然后抽真空至-70Kpa，保持压强直到果肉组织表面气泡渗出速度明显下降，此过程大约需要1-5min。

5.释放真空实现目标基因转入：

缓慢释放真空，让含有目标基因的侵染液能够渗入果肉组织，这个过程大约需要15-20min。

6.果肉组织侵染后的继续培养：

将侵染后的果肉组织用无菌水漂洗3次，晾干后放入MS固体培养基培养2-3天，培养条件为23℃，相对湿度80-85％。至此可以开展果肉组织中的目标基因表达检测，实现目标基因的瞬时过量表达，并用于基因功能分析研究。

本发明通过真空渗透的侵染方式使基因在果肉组织中过量表达，可以用于基因功能的研究。本发明建立的基因瞬时表达方法，适用于果皮单薄、果肉组织没有空腔的桃果实，操作简单、表达水平高而且结果可靠，可为开展基因功能验证和筛选功能基因提供技术支持。

附图说明

图1是目的基因瞬时表达前后的桃果肉组织外观对比图(A，C)及侵染使用的真空渗透装置(C)。

图2是瞬时表达技术提高‘中华寿桃’桃果实PpTPS1(SEQ：NO.1)基因表达和芳樟醇含量。

图3是瞬时表达技术提高‘寒露蜜’桃果实PpTPS2(SEQ：NO.13)基因表达和法尼烯含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。实施例1：桃果实PpTPS1基因(SEQ：NO.1)的克隆

(一)实验方法

以拟南芥中具有芳樟醇(Linalool)合成功能的AtTPS14氨基酸序列为参考序列，应用blastp算法在桃基因组数据库Peach Genome V2.0中查找桃的同源序列。选取匹配度最高的序列，设计引物对SEQ:NO.2和SEQ：NO.3，以桃cDNA为模板，进行PCR扩增获得编号为Prupe.4G030400(SEQ：NO.1)的序列，命名为PpTPS1。PCR反应体系为50μl，包括0.5μl Taq酶(Roche)，5μl缓冲液(10×)，4μl dNTP(2.5mM)，上下游引物(10μM，Invitrogen)各2μl，4μlcDNA，32.5μl H2O。PCR的温度程序为95℃反应5min；95℃反应30s，58℃反应30s，72℃延伸1.5min，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。

(二)、实验结果

经测序验证，获得与桃果实基因组数据相匹配的PpTPS1序列SEQ：NO.1。

实施例2：‘中华寿桃’果实中瞬时表达PpTPS1促进香气物质芳樟醇合成

(一)实验方法

1.含有目标基因PpTPS1的农杆菌转化培养

将目标基因构建到植物双元表达载体PGreen0029 62-SK上，PCR用到的引物对位SEQ：NO.4和SEQ：NO.5，PCR产物经双酶切连接到载体,酶切位点为BamHI和SalI转化到大肠杆菌，过夜培养，挑取单克隆测序验证，然后把重组质粒电转入农杆菌GV3101：：pSoup。在含有卡那霉素(50mg/L)、庆大霉素(50mg/L)的固体培养基28℃培养2d后，挑选单克隆菌株，PCR检验后加入5ml含卡那与庆大抗生素的LB中。过夜培养后，扩大培养体系到500ml，培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0。然后把菌液进行离心(4℃，5000g，10min)，待用。

2.侵染溶液的制备

渗透液(10mM MES，10mM MgCI₂，150mM乙酰丁香酮，pH 5.6)中加入0.04％的表面活性剂混匀后，加入中获得的农杆菌菌液。经过重悬浮后，常温放置2h，待用。表面活性剂可以选用三硅氧烷聚乙氧基化物或聚山梨醇酯20(20)，或辛基苯酚乙氧基化物(X-100)。

3.桃果肉组织切片的制作及预侵染的感受态培养

(1)果实的消毒处理。选择果型正常，无机械伤和病虫害的果实进行后续实验。果实洗净去除表面污物,然后用50％的乙醇溶液消毒1min，再用有效氯含量在75-100mg·L^-1的次氯酸钠水溶液浸泡20min消毒，最后用无菌水漂洗3-5次，在无菌状态下晾干待用。

(2)果实切片的制作与预培养。选取距果实缝合线90°垂直的2个表面，成熟度较为一致的赤道面选取果肉部位，去除果皮组织后，将果肉组织切成为厚度1cm，面积为4-8cm²的小块。由于果实大小差异，果肉的切片数目于大小有所变化。将制备好的果肉切片放置在MS固体培养基上，黑暗条件下预培养24-30h。预培养的条件是23℃，80-85％相对湿度。

4.果肉组织的真空渗透侵染

(1)向果肉组织施加真空。将经过预诱导的果肉切片装入网袋，置于含有侵染溶液的容器中，然后抽真空至-70Kpa，保持压强直到果肉组织表面气泡渗出速度明显下降。

(2)释放真空实现目标基因转入。缓慢释放真空，让侵染液能够渗入果肉组织，大约耗时15-20min。

5.侵染后桃果肉组织的基因表达检测

侵染后的果肉组织用无菌水漂洗3次，晾干后放入MS固体培养基在23℃培养2天。利用CTAB法提取侵染后桃果肉组织的总RNA，用TURBO DNase Kit(Ambion)试剂盒去除基因组DNA污染后，取1.0μg RNA按iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)试剂说明书操作合成cDNA。

以桃PpTEF2(SEQ：NO.6)为内参基因，引物为SEQ：NO.7和SEQ：NO.8，PpTPS1引物为SEQ：NO.9和SEQ：NO.10。qPCR反应体系包括10μl Ssofast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)，上下游引物(10μM)各1μl，2μl cDNA，6μl H2O。反应程序为95℃反应3min；95℃反应10s，60℃反应30s，45个循环。所用仪器为Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪，每次检测都包括以H₂O作反应模板的阴性对照。

6.侵染后桃果肉组织的芳樟醇含量检测

采用GC-MS(Agilent，7890-5975)进行侵染后桃果肉组织的芳樟醇含量测定。HS-SPME体系为65μm PDMS/DVB萃取头在42℃萃取15min，手动进样在GC-MS仪器。GC-MS配备分离柱为DB-Wax毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，J&W Scientific)。柱箱升温程序为：40℃保持2min，3℃升温到150℃后，再以5℃·min^-1升温至220℃，进样口为不分流模式，载气为氦气，流速为1.0ml·min^-1。

(二)实验结果

在‘中华寿桃’桃果实中表达PpTPS1，显著促进了基因表达，并提高了果肉组织的芳樟醇含量，表明PpTPS1参与了桃果实芳樟醇的生物合成。

实施例3：桃果实PpTPS2基因(SEQ：NO.13)的克隆

(一)实验方法

以苹果具有法尼烯(α-Farnesene)合成功能的MdAFS-RG1序列为参考序列，应用blastp算法在桃基因组数据库Peach Genome V2.0中查找同源序列，选取匹配度最高的序列,采用引物对SEQ：NO.11和SEQ：NO.12。PCR扩增获得的PpTPS2序列SEQ：NO.13进行测序验证。PCR体系同实施例1。

(二)、实验结果

经测序验证，获得与桃果实基因组数据相匹配的PpTPS2序列SEQ：NO.13

实施例4：过量表达PpTPS2(SEQ：NO.13)提高‘寒露蜜’桃果实法尼烯含量

1.含有目标基因PpTPS2的农杆菌转化培养

利用SEQ：NO.14和SEQ：NO.15开展将目标基因构建到植物双元表达载体PGreen0029 62-SK上，然后把重组质粒电转入农杆菌GV3101：：pSoup。农杆菌转化培养见实施例2。

2.侵染溶液的制备

渗透液(10mM MES，10mM MgCI₂，150mM乙酰丁香酮，pH 5.6)中加入0.04％的表面活性剂混匀后，加入中获得的农杆菌菌液。具体见实施例2。

3.桃果肉组织切片的制作及预侵染的感受态培养

选取成熟度均匀的‘寒露蜜’桃果实，进行果肉组织的切片，以及预备侵染的感受态培养。具体见实施例2。

4.果肉组织的真空渗透侵染

具体见实施例2。

5.侵染后桃果肉组织的基因表达检测

桃果实总RNA和cDNA合成见实施例2。以桃PpTEF2(SEQ：NO.6)为内参基因，引物为SEQ：NO.16和SEQ：NO.17，开展PpTPS2的基因表达检测。具体的PCR条件见实施例2。

6.侵染后桃果肉组织的法尼烯含量检测

采用HS-SPME结合GC-MS(Agilent，7890-5975)进行侵染后桃果肉组织的法尼烯含量测定。具体的HS-SPME和GC-MS条件见实施例2。

(二)实验结果

在‘寒露蜜’桃果实中表达PpTPS2，显著促进了基因表达，并提高了果肉组织的法尼烯含量，表明PpTPS2参与了桃果实法尼烯的生物合成。

<110> 浙江大学

<120> 一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法

<160> 17

<210> 1

<211> 1740

<212> DNA

<213> 桃（prunus perscia）

<221> CDS

<222>（1）…(1740)

<400> 1

ATGGCATTGTTTTCTATGGCCATCTCTGCTGTCTATAATGCTCCAAAAAAGATCCCACATATTCAGCTTA

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TATATGAGATCGATGCTGTATGAAACTGAATCTGTGTAA

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(23)

<400> 2

TTAAGATCCTGCTGCAATTGCTC

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(23)

<400> 3

CGGTTACACAGATTCAGTTTCAT

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(29)

<400> 4

GGATCCATGGCATTGTTTTCTATGGCCAT

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(29)

<400> 5

GTCGACTTACACAGATTCAGTTTCATACA

<210> 6

<211> 2532

<212> DNA

<213> 桃 (Prunus persica)

<221> CDS

<222> (1)…(2532)

<400> 6

ATGGTGAAGTTCACAGCTGAGGAGCTCCGTAGGATTATGGACTACAAACACAACATTCGTAACATGT

CTGTTATTGCGCATGTTGATCACGGGAAGTCAACCCTTACCGACTCCCTTGTTGCTGCTGCTGGTATC

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GGGTTTGAAGGAGCAAATGACCCCACTATCCGAGTTTGAGGACAAACTCTGA

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(22)

<400> 7

GGTGTGACGATGAAGAGTGATG

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(22)

<400> 8

TGAAGGAGAGGGAAGGTGAAAG

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(20)

<400> 9

TCAACGGCTGGGTATTGACC

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(20)

<400> 10

TGAGCAGTCGAAAGCGAACT

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(24)

<400> 11

TCATGGATTTTAGAACACACTTGC

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(24)

<400> 12

TCAAAGTAGTAAAGGCTGAACTAG

<210> 13

<211> 1728

<212> DNA

<213> 桃 (Prunus persica)

<221> CDS

<222> (1)…(1728)

<400> 13

ATGGATTTTAGAACACACTTGCAAGCTGGTGAGCAGCAAATTCTTGAATGCCAGATGCAATCCCAAGC

CTCTTACGACTTGACACAATACGAAAGACGATCTGCCAATTACAAGCCAAATATTTGGAAATATAGTTT

CTTTGAATCCCTTGACAGCAAATACCATGAAGATGATTATAAAAGGCAATCTGAGAAGCTCATAGAAG

ATGTTAAGAATATGATATTTGTCGAAACTGAAAATTCAATAGCTCAGTTAGAGCTAGTTGACATCATCG

CAAAACTAGGCCTCACAAACCACTTTGAAAAGGAAATCAAGGAAACCCTAGACACAATAGCATCTGT

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GTTCAATGTTAAAGGGCACATAGACGCCTATGAGAAAGACAATCACGTCAACACCATTTTACTTGAAT

TGGCTAAACTTAACTTTAACATGGTTCAAGCAAAACTGCAAAAAGATCTAAGGGAGGCATCCAAGTG

GTGGAACAATCTGGGCCTCACACAGCACTTGAACTTTGCAAGAGATAGATTGGTCGAGTGTTTCATGT

GTGCTGTGGGGTTAAATTTCCAGCCTGACTACACATCTTTTAGAATATGGCTTACTAAAGTCGTCAACC

TGATTCTGATAATAGACGACGTTTACGACATTTATGGCTCATTGGAAGAGCTAAAGTGCTTCACCGACG

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AGCTAAGAAGAACATCAAGGACATGATAGAGAATGCATGGAAGAAAATAAATGCAAAATGCTTGAGA

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CCTTTACCAAGATGGAGATGCGTTTGGTGATCAAGAGAAAGGAACTCGCATCCTGATTCAGTCTCTAC

TAGTTCAGCCTTTACTACTTTGA

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(40)

<400> 14

AGAACTAGTGGATCCATGGATTTTAGAACACACTTGCAAG

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(40)

<400> 15

CCCCTCGAGGTCGACTCAAAGTAGTAAAGGCTGAACTAGT

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(25)

<400> 16

GCTCAGCAATGATTTGGGAACTTCT

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<222> (1)…(25)

<400> 17

TGTGGTAATGTTGATGAATGGTGA

Claims

1.一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，通过以下方法实现目标基因转入桃果肉组织并瞬时过量表达：

(1)桃果实成熟度的选择；

(2)桃果肉组织切片的制作及预侵染的感受态培养；

(3)将(2)中得到的易感状态的果肉切片浸没于包含农杆菌和表面活性剂的侵染溶液中，这些农杆菌细胞中含有目标基因的核苷酸序列SEQ：NO.1；

(4)把目标基因转入果肉组织，向(3)中的溶液中施加压强为-70Kpa的真空环境；

(5)缓慢释放真空，使包含有目标基因的农杆菌细胞进入果肉；

(6)果肉组织侵染后的再培养，实现目标基因的瞬时过量表达。

2.根据权利要求1所述的一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(1)选取成熟度的桃果实，以选择在绿熟期到商业采收期之间的成熟度果实，即选择桃果实发育过程中的第一次快速膨大期结束到第二次快速膨大期结束期间的成熟度果实。

3.根据权利要求1所述的一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(2)桃果肉组织切片的制作与预侵染的感受态培养，通过以下步骤实现：

(a)果实的消毒处理：选择果型正常，无机械伤和病虫害的果实进行后续实验，果实洗净去除表面污物,然后用50％的乙醇溶液消毒1min，再用有效氯含量在75-100mg·L^-1的次氯酸钠水溶液浸泡20min消毒，最后用无菌水漂洗3-5次，在无菌状态下晾干待用；

(b)果实切片的制作与预培养：选取距果实缝合线90°垂直的2个表面，成熟度较为一致的赤道面选取果肉部位，去除果皮后，将果肉组织切成为厚度为1cm,面积大约为4-8cm²的小块，将制备好的果肉切片放置在MS固体培养基上，黑暗条件下预培养24-30h，预培养的条件是23℃，80-85％相对湿度。

4.根据权利要求1所述的一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(3)制备含有目标基因的侵染溶液，通过以下步骤实现：

(a)含有目标基因的农杆菌转化培养：将目标基因构建到植物双元表达载体PGreen002962-SK上，然后把重组质粒电转入农杆菌GV3101：：pSoup，在含有卡那霉素、庆大霉素的固体培养基28℃培养2天后，挑选单克隆菌株，PCR检验后加入5ml含卡那与庆大抗生素的LB中，过夜培养后，扩大培养体系到500ml，培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0，然后把菌液在4℃，10分钟进行离心，待用；

(b)侵染溶液的制备：在渗透液中加入0.04％的表面活性剂混匀后，加入(a)中获得的农杆菌菌液，经过重悬浮后，常温放置2小时，得含有目标基因的侵染溶液，待用。

5.根据权利要求4所述的一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，渗透液由10mM MES，10mM MgCI₂，150mM乙酰丁香酮组成，pH 5.6；表面活性剂选用三硅氧烷聚乙氧基化物，或聚山梨醇酯20，或辛基苯酚乙氧基化物。

6.根据权利要求1所述的一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(4)利用真空渗透方式把目标基因转入果肉组织，将经过预诱导的果肉切片装入网袋，置于含有侵染溶液的容器中，抽真空至-70Kpa，保持压强直到果肉组织表面气泡渗出速度明显下降，大约需要1-5min。

7.根据权利要求1所述的一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(5)让含有目标基因的侵染液能够渗入果肉组织，这个过程大约需要15-20min。

8.根据权利要求1所述的一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(6)将侵染后的果肉组织用无菌水漂洗3次，晾干后放入MS固体培养基在23℃培养2-3天，开展果肉组织中的目标基因表达检测，实现目标基因的瞬时过量表达，其中培养条件为23℃，相对湿度80-85％。