CN113481234A

CN113481234A - 一种番茄植株中基因瞬时表达的方法及装置

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Publication number: CN113481234A
Application number: CN202110832349.1A
Authority: CN
Inventors: 师恺; 李建鑫; 王娇; 马巧梅; 丁淑婷
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2021-10-08

Abstract

本发明公开了一种番茄植株中基因瞬时表达的方法及装置，属于植物分子生物技术领域。所述方法包括：(1)配制农杆菌侵染液，所述农杆菌携带目标基因；(2)选择在三叶一心到六叶一心期的番茄幼苗，将番茄植株倒置使得叶片完全浸没于农杆菌侵染液中，真空条件处理；(3)将番茄植株从农杆菌侵染液中取出，再培养获得目标基因导入的番茄转化株，目标基因在植株体内瞬时表达。采用本发明建立的基因瞬时表达方法及配套装置，对植株无损伤，方法简单易操作且表达效果好，在一定程度上解决了番茄遗传转化体系周期长表达不稳定的问题，最大程度节省了转化周期和成本，可用于番茄分子生物学研究中批量进行基因功能鉴定和快速筛选功能。

Description

一种番茄植株中基因瞬时表达的方法及装置

技术领域

本发明涉及植物分子生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种在番茄植株中实现基因瞬时表达的方法及装置。

背景技术

随着越来越多的植物基因组测序完成，以及后基因组时代下测序技术及组学的迅速发展，功能基因的挖掘成为植物生物学研究的重要内容。基因功能的筛选和鉴定分析通常需要批量筛选成千上万的序列，因此在利用经典方式研究基因功能的同时，有必要建立一些快速验证基因表达、检测蛋白质互作、短期内能高效表达外源蛋白质的新方法。转基因技术是开展目标基因功能研究的主要手段，如何提高番茄转基因技术的转化效率是影响番茄分子生物学发展的瓶颈因素。

番茄具有生长周期短，自花授粉易于获得纯合植株等优点，在生产中番茄可在温室内实现周年化生产，因此番茄逐渐成为园艺作物中研究分子生物机制和基因功能的模式作物。近年来，番茄的遗传转化体系逐渐成熟，转化效率不断提高，但实际操作过程中仍面临着转化效率不稳定，转化周期长等问题，获得遗传稳定的番茄植株仍需一年的时间，而且实验操作需要严格的无菌条件和无菌操作，这些问题严重制约了实验进程和效率。

目前基于瞬时表达的功能基因筛选方法正在快速发展进步，越来越成熟的瞬时表达技术被广泛应用于基因功能的前沿研究。随着国际范围内强调的基于同源物种的基因功能验证和我国对农业种质资源保护和创新的不断重视，瞬时表达技术正在成为一种研究基因功能的主要技术手段。瞬时表达技术是指引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合，将目标基因通过特定的植物表达载体导入到植物活体内，目标基因进入细胞后12h左右就可表达，基因产物在2～4天内即可被检测。

瞬时表达技术能够准确快速的反应基因功能，在分析基因功能、检测蛋白质互作，发现新型强启动子、亚细胞定位等领域用途广泛。瞬时表达系统可在短时间内操纵组织细胞中相关基因的表达与沉默，进而加快了基因功能的研究。将启动子序列与报告基因(Gus、GFP、Luciferase等)融合构建表达载体后转入植物细胞，通过报告基因的瞬时表达，短时间内即可确定启动子活性以及活性的强弱。植物细胞瞬时表达系统结合荧光蛋白融合技术或免疫荧光技术可用于蛋白质水平的研究，快速检测蛋白质在细胞中的分布，验证蛋白互作，揭示配体与受体的识别机理等。

瞬时过表达系统在越来越多的物种中得到应用，烟草、莴苣、水稻、马铃薯等多种作物的瞬时表达系统已逐渐完善。目前在番茄中缺乏高效的瞬时表达应用体系，而且多是利用叶片注射法，但是叶片注射法存在操作严格，对叶片状态要求高，在注射过程中容易造成损伤和交叉污染，注射面积小且不均匀等问题。注射叶片耗时多，且只能单叶片注射，适合研究蛋白互作，亚细胞定位等小面积叶片表达的实验，难以实现整株番茄的瞬时表达，无法用于研究基因表型功能鉴定。其次，注射的难易程度取决于叶片背面气孔开闭程度，如果气孔没有完全打开，会大大增加注射的难度。

目前番茄已经有了完善的基因组数据库，迫切需要在番茄中建立高效稳定的瞬时表达技术，为更快速的验证基因功能，发掘功能基因提供有力手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的适用于番茄植株的瞬时表达应用体系，用于基因功能的验证研究。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种番茄植株中基因瞬时表达的方法，包括以下步骤：

(1)配制农杆菌侵染液，所述农杆菌携带含有目标基因的重组质粒；

(2)选择在三叶一心到六叶一心期的番茄幼苗，将番茄植株倒置使得叶片完全浸没于农杆菌侵染液中，在≤-0.1MPa的真空条件下处理1～5min；

(3)恢复至常压后将番茄植株从农杆菌侵染液中取出，培养，获得目标基因导入的番茄转化株，目标基因在植株体内瞬时表达。

本发明采用农杆菌介导转化法结合真空渗透技术实现将目标基因高效转化到番茄植株中，进而目标基因在番茄植株内瞬时表达。

步骤(1)中，利用分子生物学技术将目标基因构建到植物双元表达载体上，再将重组质粒转入农杆菌中，然后将含有目标基因重组质粒的农杆菌加入到渗透液中制备得到农杆菌侵染液。

所述目标基因为待验证研究的基因。所述载体、农杆菌可采用本领域适用于番茄植株实现外源基因导入表达的植物双元表达载体、农杆菌菌株。

优选的，农杆菌菌株采用C58C1。原始载体采用pAC402-GFP或pAC004-HA。

具体的，农杆菌侵染液的配制方法包括：首先配制渗透液，渗透液的组成包括：10mM吗啉乙磺酸，10mM MgCl₂，150mM乙酰丁香酮，pH5.6；再往渗透液中加入终浓度为0.03％～0.05％的表面活性剂，混匀后加入含有目标基因重组质粒的农杆菌，重悬制得农杆菌侵染液，侵染液中重组农杆菌的浓度为OD₆₀₀＝0.5～1.0。

添加表面活性剂有助于降低溶液的表面张力，增强渗透液的侵染效率。优选的，所述表面活性剂为三硅氧烷聚乙氧基化物、聚山梨醇酯20或辛基苯酚乙氧基化物。

步骤(2)中，本发明利用真空渗透技术将目标基因转入番茄植株，研究表明，对于番茄叶片而言，利用真空渗透技术更能够提高目标基因的表达效率。

具体的，选择苗龄为25～40天的幼苗期番茄(即三叶一心至六叶一心的幼苗期番茄)进行农杆菌介导转化。

优选的，采用四叶一心期的番茄幼苗进行农杆菌侵染。

番茄幼苗的培养包括：番茄种子于55℃浸种10min后置于28℃催芽2天，待种子发芽后播种于含有基质的穴盘中，播种7天后，将两片真叶充分展开的番茄幼苗移至营养钵中继续生长，并给予番茄幼苗适宜的生长环境。待番茄长至4叶1心时进行侵染。

侵染时，将带有营养钵的番茄植株倒置，叶片部分完全浸没于农杆菌侵染液中，抽真空至-0.1MPa，保持压强直到叶片组织表面气泡渗出速度明显下降，大约需要1～5min。然后恢复至常压条件，保持1～2min，让含有目的基因的侵染液完全深入番茄叶片。

步骤(3)中，侵染结束，将番茄植株从农杆菌侵染液中取出，先在弱光环境下恢复，再置于适宜的生长环境下培养2～3天，在此过程中，目标基因在番茄植株体内瞬时过量表达。该植株可用于后续基因功能的分析研究。

具体地，侵染后的番茄幼苗置于光照强度为30～50μmol·m^-2·s^-1的环境下恢复1～2h后，再置于光照强度为200～250μmol·m^-2·s^-1，光周期为昼12h/夜12h，温度为昼25℃/夜21℃，相对湿度60％的生长环境中培养2～3天。

针对上述利用真空渗透技术将目标基因导入番茄植株表达的应用，本发明提供了一种农杆菌介导番茄转基因的装置，该装置包括：

筒体，包括用于盛放农杆菌侵染液的下部以及直径大于下部的上部，所述上部的筒壁上设有用于搁置倒置状态番茄植株的搁架，所述搁架的设置高度与番茄植株株高适配；

搁板，架设于筒体的搁架上，搁板上开设有供倒置状态番茄植株茎秆通过的开口，所述开口自搁板边沿延伸到搁板中心；

密闭容器，用于容置筒体，包括密闭筒和盖体；

真空泵，通过管路连接密闭容器，所述管路上设有三通旋塞阀，三通旋塞阀的两个连接口连接于管路上，第三个连接口连通外界空气。

所述筒体为一体化成型，下部与上部之间具有台阶面，所述搁架为两根对称布置的横杆，横杆的两端嵌入上部筒壁。

所述搁板与筒体为分体设置，使用时，搁板架设于搁架上。

具体的，本发明装置的使用方法为：首先，将筒体置于密闭筒内，制备好的农杆菌侵染液倒入筒体下部，将搁板从开口处穿过番茄植株的茎秆，再将植株和搁板整体倒转，此时番茄植株茎秆及叶片在搁板下方，种植营养钵在搁板上方，然后将搁板架设在筒体的搁架上，此时番茄植株的叶片完全浸没于筒体下部的侵染液中，盖上密闭容器的盖体，组装完毕。连通三通旋塞阀和真空泵，抽出密闭容器中的空气至压强达到-0.1MPa，保持压强直到叶片组织表面气泡渗出速度明显下降；然后打开三通旋塞阀释放真空，容器内压强恢复至常压。

优选的，筒体盛放菌液的下部设计成直径16cm高度8cm的圆柱形，筒体上部设计成直径22cm高度14cm的圆柱形筒壁。

优选的，筒体下部菌液的深度为5～8cm，菌液容量为1L～1.6L。更优选为菌液的深度为8cm，菌液容量为1.6L。以确保番茄叶片能够完全浸入菌液，而叶片不至于漂浮于液面。

优选的，所述搁板上设置有一对提手，方便将搁板架设到搁架上以及将搁板从筒体内取出。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明利用真空渗透的侵染方式使基因在番茄叶片组织中表达，可以用于基因功能的研究，该方法适用于任何品种的番茄幼苗，操作简单用时短，对叶片状态要求低，菌液渗透均匀，可以一次性实现对整株番茄叶片的侵染渗透。

(2)利用本发明的装置进行农杆菌介导转化，不会损伤叶片，不易造成交叉污染，操作便捷。

(3)采用本发明建立的基因瞬时表达方法及配套装置，对植株无损伤，方法简单易操作且表达效果好，在一定程度上解决了番茄遗传转化体系周期长表达不稳定的问题，最大程度节省了转化周期和成本，可用于番茄分子生物学研究中批量进行基因功能鉴定和快速筛选功能。

附图说明

图1为真空渗透装置工作示意立面图。

图2为真空渗透装置中筒体的结构示意图，其中筒体上半部分的作用是保护植株免受气流冲击，下半部分用于盛放菌液，使得植株叶片完全浸入菌液，提高侵染效率。

图3为真空渗透装置中搁板的结构示意图，搁板的作用是放置倒立的植株，固定培养钵。

图4为图3的侧面示意图。

图5为真空渗透装置工作实拍图。

图6为利用不同浓度的侵染液在番茄叶片过表达SlβCA3后的Western Blot检测图。

图7为利用瞬时表达技术在番茄叶片中过表达SlβCA3的亚细胞定位图。

图8为番茄接种细菌性叶斑病的叶片表型图(A)、台盼蓝染色(B)和叶片菌落数(C)；小写字母a、b代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

图9为利用瞬时表达技术在番茄叶片中过表达SlNAC43的Western Blot检测图。

图10为利用瞬时表达技术在番茄叶片中过表达SlNAC43的番茄干旱处理表型图(A)和电解质渗透率(B)。小写字母a、b代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例方式对本发明的处理装置和处理方式作进一步详细说明，但本发明并不局限于此。

如图1-5所示，本发明提供了一种农杆菌介导番茄转基因的装置，该装置包括：筒体1、搁板2、密闭容器3以及通过管路连接密闭容器3的真空泵4。

筒体1由用于盛放农杆菌侵染液的下部11和直径大于下部11的上部12组成，下部11与上部12之间具有台阶面。上部11的筒壁上设有用于搁置倒置状态番茄植株的搁架13，搁架13的设置高度与番茄植株株高适配；具体的，筒体1为一体成型结构，盛放菌液的下部11设计成直径16cm高度8cm的圆柱形，筒体上部12设计成直径22cm高度14cm的圆柱形筒壁。

搁板2架设于筒体1的搁架13上，搁板2上开设有供番茄植株茎秆通过的开口21，开口21自搁板边沿延伸到搁板中心，开口宽度为2cm。使用时，番茄植株倒置于搁板2上。搁板2上设置有一对提手22，方便将搁板2架设到搁架13上以及将搁板2从筒体内取出。

密闭容器3的内部可容置筒体2，包括密闭筒31和盖体32。连接密闭容器3和真空泵4的管路上设有三通旋塞阀5，三通旋塞阀5的两个连接口连接于管路上，第三个连接口连通外界空气。当密闭容器需要抽真空时，旋转三通旋塞阀5使得密闭容器3与真空泵4连通，当密闭容器需要释放真空时，旋转三通旋塞阀5使得密闭容器3与外界空气连通。真空泵4上设有压强检测表。

上述装置的使用方法为：首先，将筒体1置于密闭筒31内，制备好的农杆菌侵染液倒入筒体下部11，菌液的深度为8cm，将搁板2从开口处穿过番茄植株的茎秆，再将植株和搁板整体倒转，此时番茄植株茎秆及叶片在搁板2下方，种植营养钵在搁板2上方，然后将搁板2架设在筒体1的搁架13上，此时番茄植株叶片完全浸没于筒体下部11的侵染液中，盖上密闭容器3的盖体32，组装完毕。连通三通旋塞阀5和真空泵4，抽出密闭容器中的空气至压强达到-0.1MPa，保持压强直到叶片组织表面气泡渗出速度明显下降；然后打开三向旋塞阀5释放真空，容器内压强恢复至常压。

下面利用具体目标基因结合上述处理装置对本发明的处理方式作进一步详细说明。

实施例l：不同侵染液浓度对番茄瞬时表达转化效率的影响

(一)实验方法

1.含有目标基因SlβCA3(SEQ ID No.1)的农杆菌转化培养

以番茄中碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase)SlβCA3，在番茄基因组数据库SolGenomics Network中搜索βCA3(Solyc02g067750)。设计引物SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，克隆获得目标基因片段。将目标基因构建到载体pDONR-Zeo上，再通过Gateway的方法将目标基因转化到载体pAC402-GFP上，然后把重组质粒电转入农杆菌C58C1，在含有卡那霉素、庆大霉素和利福霉素的固体培养基28℃培养2天后，挑选单克隆菌株，PCR检验后加入5mL含有卡那霉素、庆大霉素和利福霉素的LB中，过夜培养后，扩大培养体系到500mL，分别培养至OD₆₀₀＝0.5、1.0、1.5、2.0、2.5，然后把菌液进行离心(4℃，5000g，10min)，收集菌体待用；

2.侵染溶液的制备

渗透液(10mM MES，10mM MgCI₂，150mM乙酰丁香酮，pH 5.6)中加入0.04％的表面活性剂混匀后，加入步骤1中获得的农杆菌菌体。经过重悬浮后，常温放置2h，待用。表面活性剂可以选用三硅氧烷聚乙氧基化物(SilwetL-77)，或聚山梨醇酯20(Tween20)或聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-100)。

3.番茄幼苗的培养

番茄幼苗的培养：番茄种子于55℃浸种10min后置于28℃催芽2天，待种子发芽后播种于含有草炭与蛭石为2:1(v/v)的50孔穴盘中，播种7天后，将两片真叶充分展开的番茄幼苗移至营养钵(外径10cm，高8.5cm)中继续生长，控制生长环境条件为：温度为25℃/21℃(昼/夜)，光周期为12h/12h(昼/夜)，光照强度为200μmol·m^-2·s^-1，相对湿度60％左右。待番茄长至4叶1心时进行侵染。

4.番茄叶片的真空渗透侵染

(1)利用真空渗透方式把目标基因转入叶片组织，将番茄叶片完全浸入侵染溶液中，抽真空至-0.1MPa，保持压强直到叶片组织表面气泡渗出速度明显下降，大约需要1～5min。

(2)打开三向旋塞阀释放真空，让含有目的基因的侵染液完全深入番茄叶片，这个过程大约需要1～2min。

5.番茄叶片侵染后的继续培养

将侵染后的番茄幼苗于光照强度为50μmol·m^-2·s^-1的弱光环境下恢复1～2h后，置于步骤3所述的生长环境中培养2～3天。然后开展叶片组织中的目标基因表达检测，实现目标基因的瞬时过量表达，并用于后续基因功能的分析研究。

6、蛋白免疫印迹

取0.1g番茄叶片加液氮磨成粉状，加入200μL提取缓冲液提取蛋白，将提取好的蛋白样品进行高温变性，将变性后的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，等到不同大小的蛋白完全分开后，转移到硝酸纤维素膜上。将2g脱脂奶粉溶于30mLl×TBST配成封闭液，将膜放入封闭液中封闭1h。封闭结束后用l×TBST洗4～5次，每次5min。按照1:10000比例将一抗加入含有1％BSA的l×TBST中，孵育1h，结束后用l×TBST洗4～5次，每次5min。按照1:10000比例将相应二抗加入含有1％BSA的l×TBST中，孵育lh，结束后用l×TBST洗4-5次，每次5min。用发光检测试剂盒(ThermoFisherScientific，34080)检测抗原抗体复合物。

(二)、实验结果

Western Blot检测结果如附图6所示，在番茄叶片中瞬时过表达SlβCA3后检测相应的蛋白条带并用Image Lab软件对蛋白条带进行定量分析，以通过农杆菌侵染法得到的过表达植株35S::SlβCA3(参考文章“High CO₂-and pathogen-driven expression of thecarbonic anhydraseβCA3confers basal immunity in tomato”，利用来自番茄cDNA的βCA3的编码序列，插入到pFGC1008载体中构建重组质粒，用根癌农杆菌侵染子叶，并利用子叶进行组织培养)作为对照(左边第一个条带)。结果表明，当侵染液浓度为OD₆₀₀＝1.0时，侵染效果最好，瞬时过表达SlβCA3的相对表达量最高。

实施例2：番茄叶片中瞬时过表达碳酸酐酶SlβCA3(SEQ ID No.1)鉴定其亚细胞定位

(一)实验方法

1.含有目标基因SlβCA3的农杆菌转化培养

具体见实施例1。

2.侵染溶液的制备

具体见实施例1，侵染液浓度为OD₆₀₀＝1.0。

3.番茄幼苗的培养

具体见实施例1。

4.番茄叶片的真空渗透侵染

具体见实施例1。

5.番茄叶片侵染后的继续培养

具体见实施例1。

6.亚细胞定位

两天后用共聚焦仪器(ZeissLSM780)对番茄叶片进行观察。激发光的参数为488nm，发射光的参数为500～530nm。

(二)实验结果

如附图7所示，在番茄中瞬时过表达SlβCA3后，经GFP荧光观察蛋白表达位置发现番茄βCA3位于细胞质、细胞核和细胞膜中。

实施例3：番茄叶片中瞬时表达碳酸酐酶SlβCA3增强番茄对细菌性叶斑病的抗病性

(一)实验方法

1.含有目标基因SlβCA3的农杆菌转化培养

具体见实施例1。

2.侵染溶液的制备

具体见实施例1。

3.番茄幼苗的培养

具体见实施例1。

4.番茄叶片的真空渗透侵染

具体见实施例1。

5.番茄叶片侵染后的继续培养

具体见实施例1。

6.原菌的培养与接种

病原菌采用香假单胞菌番茄变种(P.syringaepv.tomato DC3000，PstDC3000)。

Pst DC3000菌种在含有25mg·L^-1利福平的KB固体培养基上于28℃光照培养箱中培养2天。挑取单菌落于同样浓度抗生素的KB液体培养基中于28℃，200r/min扩大培养约8～12h后，调浓度至OD₆₀₀＝0.8～1.0，4000×g，4℃下离心5min，得到的沉淀即为菌体。将菌体用10mM MgCl₂清洗两次后重新悬浮，浓度调为OD₆₀₀＝0.01，加入有机硅至终浓度为0.03％，制得病原菌溶液。

接病处理为将病原菌溶液均匀的喷施番茄叶面，对照处理则喷施含有终浓度为0.03％有机硅的10mM MgCl₂溶液。

7.番茄植株感病评估

发病率统计：番茄叶片接种Pst DC3000约3天后，观察番茄植株不同处理下细菌性叶斑病的病情发展，记录发病小叶数和发病症状。发病症状按严重程度由轻到重依次为0、1、2、3、4五个等级。分级标准为：0级，叶片正常；1级，叶片主叶尖处可见少数病斑；2级，叶片叶尖及主叶脉处密集病斑；3级，叶片多部位叶脉密集病斑，但未散布整片叶；4级，叶片全片叶可见病斑分布。同时每个处理至少统计50片番茄小叶。

发病率和发病指数的公式计算方法分别如下：

发病率＝(染病叶片数/调查总叶片数)×100％

发病指数＝∑(各级叶片数×该级指数)×10/(总叶片数×最高级别数)

台盼蓝染色，将番茄叶圆片浸入65℃预热的染色液中，煮沸10min后用保鲜膜包严，摇床上染色5～6h。染色后将叶圆片置于脱色液中，脱色3～4次，每次洗涤5～6h至叶片透明。透明叶片分别置于LEICA-DM400B显微镜下拍照。

(二)、实验结果

如附图8所示，在番茄叶片中瞬时过表达SlβCA3显著提高了番茄对细菌性叶斑病的抗性，显著降低了番茄幼苗的发病率，实验结果表明SlβCA3参与了番茄对细菌性叶斑病抗性的调控。

实施例4：番茄叶片中瞬时过表达转录因子SlNAC43(SEQ ID No.4)后进行WesternBlot检测

(一)实验方法

1.含有目标基因SlNAC43的农杆菌转化培养

以番茄中SlNAC43，在番茄基因组数据库Sol Genomics Network中搜索NAC43(Solyc05g007770)。设计引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，克隆获得目标基因片段。将目标基因通过双酶切的方式构建到载体pAC004-HA上，然后把重组质粒电转入农杆菌C58C1，在含有氯霉素、庆大霉素和利福霉素的固体培养基28℃培养2天后，挑选单克隆菌株，PCR检验后加入5mL含有氯霉素、庆大霉素和利福霉素的LB中，过夜培养后，扩大培养体系到500mL，培养至OD₆₀₀＝0.8～1.0，然后把菌液进行离心(4℃，5000g，10min)，待用；

2.侵染溶液的制备

具体见实施例1。

3.番茄幼苗的培养

具体见实施例1。

4.番茄叶片的真空渗透侵染

具体见实施例1。

5.番茄叶片侵染后的继续培养

具体见实施例1。

6、蛋白免疫印迹

(二)、实验结果

Western Blot检测结果如附图9所示，在番茄叶片中瞬时过表达SlNAC43后可以检测到对应的蛋白条带，而对照叶片无法检测到对应的蛋白条带。

实施例5：番茄叶片中瞬时表达转录因子SlNAC43增强番茄对干旱胁迫的抗性

(一)实验方法

1.含有目标基因SlNAC43的农杆菌转化培养

具体见实施例4。

2.侵染溶液的制备

具体见实施例1。

3.番茄幼苗的培养

具体见实施例1。

4.番茄叶片的真空渗透侵染

具体见实施例1。

5.番茄叶片侵染后的继续培养

具体见实施例1。

6.番茄干旱胁迫处理

将侵染恢复后的番茄幼苗干旱处理7天，7天后观察表型并采取图像。

7.电解质渗透率的测定

叶片电解质渗透率(EL值)的测定：取0.1g新鲜的番茄叶片剪成约1cm²的碎片放入50mL的离心管中，加入30mL的ddH₂O在室温25℃下200rpm摇晃3h，待静置后用电导率仪测定EL1，然后在95℃下水浴15min，待静置到室温后用电导率仪测定EL2。电解质渗透率EL(％)＝EL1/EL2×100。

(二)、实验结果

如附图10所示，在番茄叶片中瞬时过表达SlNAC43后，番茄的抗旱能力提升，番茄叶片在干旱胁迫下，电解质渗透率显著降低。实验结果表明SlNAC43参与了对番茄耐旱性的调控。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种番茄植株中基因瞬时表达的方法及装置

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1054

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum Lycopersicum)

<400> 1

atggcaaaca aatcttacga ggaggccatt gtttccctcc agaaccttat cagtgagaag 60

ggagagctgg gaccatttgt agcagaaaga attgatgaaa tgacagctga gttacaaaca 120

agcagtaaac cgttcgatcc agttcacagg atcaagtgtg gcttcaatta tttcaaaaca 180

gagatatatg acaaaaatcc agaattgttt gacaaactca aaaaaggcca ggaacccaag 240

ttttttgtgt ttgcgtgctc ggattcacga gtgagcccat cccatatcct caatttccag 300

cccggtgagg ctttcatggt tcgaaacata gccaacatgg tccctcctta tgacaagctt 360

aggtactctg gaactggagc tgctatcgag tacgctgttc tccatcttaa ggtagaaaat 420

attctagtca ttggacacag tagttgtgga ggtatcaagg ctctcatgag tcttccagaa 480

gatggttctg aatcaactga atttattgag aattgggtga aaattgggtt acctgccaag 540

gccaaggtgc tagctgagca tccgaatata agttttgaag aacagtgcaa atactgtgaa 600

aaggaagctg tgaatgtatc actagccaac ttgctgacct atccatttgt gagagatggt 660

ttggtgaata aaacactgtc attgaaggga ggttactatg attttattaa aggagaattt 720

aagctatggg gacttcactt tggtctttct catccttgtt ctatctgaat tcaactacac 780

catttttcta gtgggagaat aatacacctc ttgttccttt tttatctttc ttgttgtatt 840

cgtctacgta gtttaaatga ctaaataaaa tagaggataa attctcccgt tttatgatat 900

aagactagtg gtaaattgtt ttatgttcat tatataaggt ataaataatg tttatgtacg 960

ttctgcccat ttgggtttgt tgtaataatg actctgtacg ttctgcagag ggaattaaaa 1020

taaattatat tggctcaaaa aaaaaataaa ttaa 1054

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt tatggcaaac aaatcttacg a 51

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gatagaacaa ggatgagaaa 50

<210> 4

<211> 1308

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum Lycopersicum)

<400> 4

ctaaaatttc attttctctc aatttccttg cttttgttta aaaaaaacaa agaaaaagaa 60

gaattgttcc attttattta tttctatatt tttgtataaa atggttggaa aaattagctc 120

tgatcttcct cctggattta ggtttcatcc aacagatgag gaattaatca tgtactatct 180

tcgatatcaa gctacttcaa ggccatgccc tgtctcaatt atccccgaaa ttgatgtcta 240

caagttcgat ccctgggtat tacctgaaaa ggcagaattt ggagacaatg agtggtattt 300

ttttacccct agagatagaa aatatccaaa tggtgttagg ccaaatagag cagctgtgtc 360

aggttattgg aaggctactg gcactgataa agcaatttat agtgcaaata aatatgttgg 420

aattaaaaaa gcacttgttt tttacaaagg caaaccacca aaaggtgtca agactgattg 480

gatcatgcat gaatatcgtt tgagtgattc aaagtctcaa acatctaagc aaagtggatc 540

tatgaggtta gatgattggg tactatgtag aatttataag aagaaaaatt tggggagaac 600

tatagagatg atgaaagttg aagaagaaga attagaggca caaaatgtga gtactacaaa 660

taatgaaatt gaagttgttg gtggaccaca aacaatgaaa ttaccaagaa tttgttcatt 720

gtcacatcta ttggaattgg attattttgg atcaattcca caattactaa gtgacaattt 780

attatatgat gaccaaggtt acacaatgaa taatgtgaat aacacaagta atgtggatca 840

agtatcatca caacaacaaa atacaaataa tattacaagc aataattgta atattttctt 900

caattatcaa caaccacttt ttgtgaatcc aacatttcaa tctcagtgat gatcaatagc 960

ggagacagaa ttttcatcaa gaatcttcta aatagattct cagttatatc aaaggggttc 1020

aatatgtaga taattatata taaaatattt tttcaacgaa gaggttcatg gccgggtgaa 1080

aatatattta tatgaaggct attggatgaa aaggtgacat caaaagttta tgacaacaat 1140

tgtaaaatat aatcaaatgt tatgtcatta gtattattag caacaaacct tgtagtaggg 1200

caacaaattg ttgttgtatt attttagaat ttagtttctc agtttgtatt tggaaaaaaa 1260

aaactaattt actttgtgaa attttaataa atatttttca gtattcta 1308

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttggcgcgcc atggttggaa aaattagctc 30

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggggtaccc tgagattgaa atgttgg 27

Claims

1.一种番茄植株中基因瞬时表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的番茄植株中基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(1)中，农杆菌侵染液的配制方法包括：首先配制渗透液，渗透液的组成包括：10mM吗啉乙磺酸，10mMMgCl₂，150mM乙酰丁香酮，pH5.6；再往渗透液中加入终浓度为0.03％～0.05％的表面活性剂，混匀后加入含有目标基因重组质粒的农杆菌，重悬制得农杆菌侵染液，侵染液中重组农杆菌的浓度为OD₆₀₀＝0.5～1.0。

3.如权利要求2所述的番茄植株中基因瞬时表达的方法，其特征在于，所述表面活性剂为三硅氧烷聚乙氧基化物、聚山梨醇酯20或辛基苯酚乙氧基化物。

4.如权利要求1所述的番茄植株中基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(1)中，农杆菌菌株采用C58C1。

5.如权利要求1所述的番茄植株中基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(1)中，重组质粒的原始载体为pAC402-GFP或pAC004-HA。

6.如权利要求1所述的番茄植株中基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用四叶一心期的番茄幼苗进行农杆菌侵染。

7.如权利要求1所述的番茄植株中基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(3)中，恢复常压后保持1～2min，再从农杆菌侵染液中取出番茄植株。

8.如权利要求1所述的番茄植株中基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(3)中，侵染后的番茄幼苗置于光照强度为30～50μmol·m^-2·s^-1的环境下恢复1～2h后，再置于光照强度为200～250μmol·m^-2·s^-1，光周期为昼12h/夜12h，温度为昼25℃/夜21℃，相对湿度60％的生长环境中培养2～3天。

9.一种农杆菌介导番茄转基因的装置，其特征在于，包括：

密闭容器，用于容置筒体，包括密闭筒和盖体；

10.如权利要求9所述的农杆菌介导番茄转基因的装置，其特征在于，所述筒体下部菌液的深度为5～8cm，菌液容量为1L～1.6L。