CN110343155B - 越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2 - Google Patents

Abstract

本发明公开了越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2来源于越橘半高丛品种‘北陆’（Northland），其核苷酸序列见SEQ ID No.1；它是以‘北陆’果实总RNA反转录的cDNA为模板，通过PCR方法获得基因全长核苷酸序列。VcMATE2基因在含有乙酰化花色苷的越橘品种中特异表达，而在不含有乙酰化花色苷的越橘品种中表达较低。证明VcMATE2基因乙酰化花色苷转运的特异性；通过基因工程手段调控越橘花色苷和培育高花色苷越橘品种提供新的思路，也为提升我国越橘品种在国际市场的综合竞争力，创造经济效益、社会效益、促进我国果树产业可持续发展奠定基础。

Description

越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一个越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白及其在培育转基因植物中的应用。

背景技术

果实花色苷的积累量和组成是影响果品外观品质、营养保健品质、加工品质的重要因素，提高果实的营养保健品质已经成为园艺植物的重要育种目标。2012 年《Nature》报道了丹麦科学家研究出的一种基于NRT/PTR 转运蛋白研究的新技术，这种被称为“运输工程”的技术可以消除油菜种子中对动物有害的硫代葡萄糖苷，极大地提高油菜作为动物饲料的应用性。这项突破性的研究成果为通过基因工程手段调控重要作物的营养品质提供了新的途径，也为基础研究如何转化为社会生产力提供了极好范例。

越橘中花色苷是天然的植物色素，属于植物的次级代谢物质，是影响果实最主要的呈色物质。植物合成大量次级代谢物质以行使多种生物学功能，包括植物抵抗紫外线辐射、通过花色形成来吸引昆虫授粉。此外，在一些生物或非生物逆境胁迫的刺激下，越橘营养器官的花色苷含量明显提高，这说明花色苷在逆境胁迫应答中起到了一定作用，可以在一定程度上保护植株免受内外不良环境的影响。通过液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术以及代谢组学手段对越橘花色苷进行检测和鉴定，发现越橘花色苷种类和含量因越橘品种而异。在越橘品种‘蓝乐’、‘利伯蒂’、‘德雷珀’、‘北空’果实中检测到15种花色苷，都是五种花色素的3-糖苷，未检测到乙酰化花色苷；而在‘北陆’、‘蓝丰’、‘蓝线’中检测到30种花色苷，包括除上述的15种花色苷外，还检测到10种乙酰化花色苷。

本研究拟在前期工作基础上，综合采用植物生理学、代谢组学、分子生物学、细胞生物学、遗传学等手段深入研究越橘VcMATE2运输活性以及功能鉴定。一方面可以从理论上丰富果实花色苷的转运机制，另一方面为通过基因工程手段调控越橘花色苷和培育高花色苷越橘品种提供新的思路，具有重要的理论和应用前景。本专利公开了一种越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2，该基因在含有乙酰化花色苷的越橘品种中特异表达，而在不含有乙酰化花色苷的越橘品种中表达较低。

发明内容

本发明的目的是为解决越橘果实花色苷转运机制问题，并能提高越橘果实花色苷含量，而提供一个越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2。

越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.1所示。

越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2的制备方法，它是以‘北陆’（Northland）果实总RNA反转录的cDNA为模板用引MATE2-F（ATGGCGGCGGCCGAAGAAT）与MATE2-R（TGCACTGACCAATCGCTCT）扩增获得。

一种表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

本发明的又一个目的是提供的越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2在培育转基因植物的应用。

本发明提供了越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2来源于‘北陆’，其核苷酸序列见SEQ ID No.1。它是以‘北陆’果实总RNA反转录的cDNA为模板，通过PCR方法获得基因全长核苷酸序列。VcMATE2基因在含有乙酰化花色苷的越橘品种中特异表达，而在不含有乙酰化花色苷的越橘品种中表达较低。证明VcMATE2基因乙酰化花色苷转运的特异性；通过基因工程手段调控越橘花色苷和培育高花色苷越橘品种提供新的思路，也为提升我国越橘品种在国际市场的综合竞争力，创造经济效益、社会效益、促进我国果树产业可持续发展奠定基础。

附图说明

图1为越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2的PCR检测，M：DNA MarkerDL2000；1：VcMATE2基因PCR产物。

图2为VcMATE2基因在不同越橘品种果实中表达量分析结果。

图3为VcMATE2基因与pTRV2融合表达载体图。

图4为病毒诱导越橘（‘北陆’）果实VcMATE2基因沉默表型分析，CK：空白对照，注射pTRV1+pTRV2农杆菌菌液的果实；TRV2:VcMATE2：注射含有pTRV1+pTRV2-VcMATE2农杆菌菌液的的果实。

图5为病毒诱导越橘（‘北陆’）果实VcMATE2基因沉默表达量分析结果。

图6为病毒诱导越橘（‘北陆’）果实VcMATE2基因沉默HPLC分析结果。1：飞燕草素-乙酰-半乳糖苷；2：飞燕草素-乙酰-葡萄糖苷；3：矮牵牛素-乙酰-半乳糖苷；4：芍药色素-乙酰-半乳糖苷。

具体实施方式

实施例1 提取越橘果实总RNA

取越橘“北陆”（取自吉林农业大学小浆果种质资源圃）成熟、外观完好的蓝色果实，用改良的CTAB法提取越橘果实总RNA。提取步骤如下：

（1）取12个2 mL离心管，每管加入1200 µL的CTAB缓冲液，再加入2%的β-巯基乙醇置于65℃水浴锅内水浴加热10 min。

（2）取适量越橘果实，置于研钵内加液氮充分研磨并分装入预先准备的离心管中充分混匀。加样后65℃度水浴10 min，期间上下颠倒2-3次。水浴后4℃，14000 r/min离心10min。

（3）取1000 µL上清液，转移至新准备的离心管中，用相同体积的氯仿：异戊醇（体积比24:1）抽提2次，每次抽提10 min，上下颠倒混匀，冰上放置5 min，4℃，14000 r/min离心10 min。

（4）取上清800 µL，转移至新管中并加入1/4体积的10 M LiCl，混匀置于-20℃冰箱沉降2-3小时（或4℃冰上过夜）。

（5）沉降结束后合并为6管，4℃，15000 r/min离心20 min弃上清液。

（6）加入1000 µL冰乙醇洗涤两次，每次4℃，14000 r/min离心5 min。

（7）加入100 µL的SSTE缓冲溶液，并合为3管，SSTE应事先于65℃水浴。

（8）取上清液，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合溶液抽提10 min，于冰上静置5 min，4℃，14000 r/min离心10 min。

（9）取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇混合溶液，抽提5min，冰上静置5 min，4℃，14000 r/min离心10 min。

（10）弃上清，加入2倍体积的冰乙醇于-80℃沉降30 min（或-20℃沉降2 h）。

（11）沉降后4℃，15000 r/min离心20 min弃掉上清，得到沉淀用1000 µL冰乙醇洗涤两次，4℃，14000 r/min离心5 min，在无菌通风橱下溶于50 µL的DEPC水中，放于-80℃冰箱中备用。

实施例2 越橘VcMATE2基因的克隆

（1）cDNA的合成

经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，选择质量好的RNA反转录成cDNA，步骤如下：

1) 按照表1配制去除基因组DNA反应液。

2) 将PCR管放入PCR仪中，按以下程序进行设置：42℃，2分钟；4℃储存。

3) 再按照表2在冰上配制反转录反应液。为保证反应液配制的准确性，需要预先混合该步骤各项试剂，再加入上一步的反应液。

4) 在PCR仪上按以下程序进行设置：37℃，15分钟；85℃，5秒；4℃储存，可以直接进行下一步的实验，若要长期储存，则置于-20℃。

（2）VcMATE2基因的克隆

以此cDNA为模板，利用引物MATE2-F（ATGGCGGCGGCCGAAGAAT）与MATE2-R（TGCACTGACCAATCGCTCT）对VcMATE2基因进行克隆，PCR体系见表3，PCR程序为94℃预变性5min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，延伸1 min 30 s，共进行30个循环。由图1可见，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，获得了一条1506 bp的目的条带，将目的基因连接克隆载体pEASY-T1（购自全式金生物技术有限公司）重组成pEASY-VcMATE2后进行测序，测序结果结果比对完全正确，序列见SEQ ID No.1。

实施例3不同越橘品种果实花色苷

对本实验室保存的60个越橘品种的花色苷含量和种类进行测定，表4测定结果显示，‘蓝乐’、‘利伯蒂’、‘德雷珀’、‘北空’四个品种完全不含有乙酰化花色苷，而‘北陆’、‘蓝丰’、‘蓝线’、则含有多种酰基化花色苷。

实施例4 越橘VcMATE2基因在不同越橘品种果实中的表达量鉴定

(1) 植物材料的获取

选取‘北陆’、‘蓝丰’、‘蓝线’、‘蓝乐’、‘利伯蒂’、‘德雷珀’、‘北空’成熟的果实，利用液氮将植物材料迅速冷冻后置于-80℃冰箱中储存，用于总RNA的提取。

果实总RNA的提取

与实施例1中方法一致。

(2) cDNA的合成

与实施例2中方法一致。

(3) 荧光定量PCR

1) 本实验采用的是加入嵌合式荧光染料SYBR Green

mix （Takara，大连）。采用荧光定量仪器的型号为Applied Biosystems StepOne Plus Real-Time PCR System（Life Technologies，美国）。在超净台中按照表4的反应体系逐一加入各种溶液。加样时每个样品进行三次生物重复和三次技术重复。以GAPDH基因为参照基因计算VcMATE2基因的相对表达量。VcMATE2基因引物为：qRT-VcMATE2-F：ATTTGACCCCATTGCTTGCC，qRT-VcMATE2-R：ATAAGCCACGAGACCTTGCCA。GAPDH基因引物序列为：qRT-GAPDH-F：CATCCACTCTATCACCGCAACAC，qRT- GAPDH-R：GCAGGCAACACCTTACCAACAG。

Real time PCR反应程序为95℃预变性30秒，95℃变性5秒，60℃复性及延伸30秒，进行40个循环后计算各个样品的溶解曲线。

2) 荧光定量PCR的数据处理

荧光定量PCR结束后，检测每个样品的扩增曲线以及扩增效率，以保证无非特异性扩增存在。本实验采用的是相对定量PCR法，将各个样品的Ct值导入到Microsoft OfficeExcel 2003表中，将得到的Ct值带入计算公式2^-△Ct进行计算。VcMATE2基因在不同越橘品种果实总表达量分析结果见图2，在含有酰基化花色苷的品种‘北陆’、‘蓝丰’、‘蓝线’中，高于不含有酰基化花色苷的品种‘蓝乐’、‘利伯蒂’、‘德雷珀’、‘北空’。

实施例5 越橘VcMATE2基因VIGS表达载体的构建及转化越橘果实

(1) 表达载体的构建

将pEASY-VcMATE2质粒与pTRV2质粒分别用EcoRI与Mlu I进行双酶切，分别回收目的基因与载体大片段，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到表达载体pTRV2- VcMATE2，图3为VcMATE2基因与pTRV2融合表达载体质粒图谱。将空载体即pTRV1、pTRV2与pTRV2-VcMATE2分别转化至农杆菌EHA105中，用于浸染越橘果实。

(2) 农杆菌介导的越橘果实转化

1) 2018年7月，选取吉林农业大学小浆果种质资源圃的越橘含乙酰化花色苷品种‘北陆’绿果为实验材料。

2) 以含pTRV2空载体的农杆菌为对照组；以含上述构建成功的pTRV2-MATE2质粒的农杆菌为实验组。

3) 农杆菌的准备。小揺培养农杆菌，将含有植物表达载体的农杆菌（pTRV2-MATE2）、空载体菌液（pTRV1、pTRV2）划线培养后，分别挑取单菌落于1 mL YEP（含卡那霉素50 mg/L，利福平50 mg/L）液体培养基的灭菌处理的2 mL离心管中，200 rpm 28℃培养20小时以上。把预培养的1 mL的农杆菌接种到50 mL YEP（含卡那霉素50 mg/L，利福平50 mg/L）液体培养基的锥形瓶中，200 rpm 28℃培养20小时以上至菌液浓度达到OD₆₀₀=1.0-1.2。

4) 按照表6配置悬浮缓冲液。

将培养好的农杆菌室温条件下5000 rpm 离心15 min，弃掉上清，用适量的悬浮缓冲液悬浮农杆菌，5000 rpm 离心5 min，弃上清以除去培养基中的抗生素。再次用悬浮液重悬菌体，在波长为600nm处检测悬浮液的OD值，使最终的OD值达到0.8左右。将TRV1分别与TRV2、TRV2-MATE2按1:1混合混匀，室温静置3 h。

5) 采用农杆菌注射法处理越橘绿果，用1 mL无菌的注射器吸取农杆菌菌液，用针头轻轻插入果实中心，缓缓施力使侵染液渗进果实。图4为注射10-15 d后越橘果实表型变化，对照组果实由绿色转为蓝色，而实验组则果实则无法由绿色转为蓝色，从表型上证明VcMATE2基因被成功沉默，收集样品。

实施例6 基因沉默越橘果实基因表达量测定

将实施例4中收集的实验组整颗果实和对照组基因沉默的越橘果实，用洁净的新刀片切下绿色部分（即基因沉默部分），于液氮中速冻，研磨至粉末。

(1) 果实总RNA的提取

分别提取VIGS实验中对照组和实验组越橘果实总RNA，方法与实施例1中方法一致。

(2) cDNA的合成

分别将上一步骤中质量合格的对照组和实验组越橘果实总RNA反转录为cDNA，方法与实施例2中方法一致。

(3) 荧光定量PCR

对VIGS实验中对照组和实验组越橘果实中含有的VcMATE2基因进行表达量测定，方法与实施例3中方法一致。

(4) 荧光定量PCR数据处理

方法与实施例3中方法一致，由图5可知，与正常生长条件下的果实相比，在对照组中，VcMATE2基因表达量变化不显著，实验组中VcMATE2基因表达量则显著降低，在基因水平上证明了目的基因被有效沉默。

实施例6 基因沉默越橘果实HPLC测定

(1) 越橘果实花色苷的提取

取注射空载体的越橘果实1 g为对照组，取基因沉默的越橘果实，切下绿色部分（即基因沉默部分）1 g为实验组，在液氮中研磨至粉末，加入2.5 mL 80%甲醇（色谱纯），低温浸提8-10 h。浸提液离心，收集上清液，果渣重复提取1次，合并2次上清液，最后使用甲醇定容至5.0 mL。

(2) 花色苷的测定

吸取全部提取液在旋转蒸发仪上蒸发除去有机相，用超纯水重新定容至5 mL，过0.22 μm有机相滤膜，在Agilent 1260 LC进行HPLC分析，图6为对照组与实验组HPLC分析比对结果，结果证明VcMATE2基因沉默的越橘果实中飞燕草乙酰半乳糖苷、飞燕草乙酰葡萄糖苷、矮牵牛乙酰半乳糖苷、芍药乙酰半乳糖苷减少。因此，说明VcMATE2参与了越橘果实这4种花色苷的转运。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1509

<212> DNA

<213> VcMATE2

<400> 1

atggcggcgg ccgaagaata tcacccactt ctaccgggaa tattacagga ggaatctcta 60

gcatccgcgg aggtcgaaga gattttgatg caaaagccgg tggcggcgag ccggtatatt 120

aagctctttg gctgggaatc gaagctgtta tggatcctat catgggcttc cattgtggtc 180

tccatttgca attacatgct cagttttgtc acccttacgt tttctggtca tttgggtgca 240

ctggaccttg ctggtgcatc tattgctatg gtgggagctc aaggcctcgc ttatgggatc 300

atgctgggaa tggctagtgc tgtgcaaact gtttgcggtc aagcatacgg agcaaaacaa 360

tatggtgcaa tgggcatcat ttgccagagg gctataatct tgcatttggg aatggctatt 420

cttctcacat ttctctatgt ctactttggg gaagtcctaa aaataattgg gcaagcagaa 480

gacatagctg agaaaggcca gatcttcgcg cgggggatga ttcctcaact ctatgcattc 540

tccataagtt gcccccttca gaggttcctt caagcacaga acatcgcgaa ccctctagct 600

tacatgtccc tctcggtgtt ccttgttcat atttttctca gttggctagt cgtttaccac 660

tttgactttg gtctccttgg agcggctctt acacttagcc tctcttggtg gattttggtc 720

atactgcaag gactttacat tcttttgagc ccgtcttgca agaatacttg gacgggcttc 780

tccatgagag cagttcatga gatgtggcct tacttcaagc tgacttttgc ttctgctgtt 840

atgttatgtc tagagatatg gtacgtccaa ggtctggtac taatctcagg atttctttcc 900

aacccaacaa tcgcgctaga ctccctttcc atctgtttga attactggac ttgggacctt 960

gagttcatgc tcgggttgag tgcagcagtg agtgttcgag taagtagtga gctaggagca 1020

ggatatccaa tggttgcaaa attttctgtg attgtagtca acatgacaac cattctcatt 1080

agtgtagttt ttagtgcaat tgttctggtt ttccgggttg ggttaagcga actctttacc 1140

agcgatgagg aggttattga ggctgtgtct aatttgaccc cattgcttgc catctctgtc 1200

ttcttgaatg gcgttcaacc tattctttcc ggtgtggcca ttgggagtgg atggcaaggt 1260

ctcgtggctt atgtgaacct aacaacttat tatattattg gtctgcctat tggatgcgtt 1320

cttggcttca aaactagttt aggagctgca gggatctggt ggggcatgat cataggagtc 1380

atcctacaaa cagctactct aatcgtcata actgcaagaa caaactggaa tgcagaggct 1440

gcaaaagcta ttgatcgctt aaaaaattcg gccaacggat caactttaga gcgattggtc 1500

agtgcatga 1509

Claims (4)

1. 越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2在转运越橘果实乙酰化花色苷方面的应用，所述的越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述的乙酰化花色苷为飞燕草乙酰半乳糖苷、飞燕草乙酰葡萄糖苷、矮牵牛乙酰半乳糖苷和\或芍药乙酰半乳糖苷。

2. 权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2是以越橘品种‘北陆’ Northland总RNA反转录的cDNA为模板用引物F：ATGGCGGCGGCCGAAGAAT与R：TGCACTGACCAATCGCTCT扩增，获得。

3.越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2在培育转基因植物的应用，其特征在于：所述的植物为越橘，它能够生产飞燕草乙酰半乳糖苷、飞燕草乙酰葡萄糖苷、矮牵牛乙酰半乳糖苷和\或芍药乙酰半乳糖苷；所述的越橘果实乙酰化花色苷特异性转运蛋白VcMATE2其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的植物为‘北陆’、‘蓝丰’或‘蓝线’越橘。

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