CN112522306B - 一种弱光处理显著提高桃叶片瞬时转化效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及桃叶片瞬时转化方法，特别是指一种桃实生苗叶片瞬时转化方法。本发明主要解决的问题是桃叶片转化效率低的问题。具体的方法如下：（1）经低温（4℃）沙藏的桃核，去除其外部坚硬的内果皮，将种子播于营养土中，并置于温度为22℃，湿度为75%，光照为6000‑8000lux的环境下培养；（2）将10‑15 d苗龄的桃实生苗置于光照强度为600‑800 lux条件下，培养5‑8天，待用；（3）选取经步骤（2）处理后的桃苗，以常规农杆菌介导的叶片抽真空方法进行瞬时转化。经弱光处理的桃实生苗叶片转化效率极显著提高，与常规转化方法相比，瞬时转化GUS基因后，GUS活性提高了5.64倍。

Description

一种弱光处理显著提高桃叶片瞬时转化效率的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及桃叶片瞬时转化方法，特别是指一种桃实生苗叶片瞬时转化方法。
背景技术
桃是我国重要的落叶果树之一，其果实多汁、香甜，深受消费者喜爱，具有极高的经济价值。随着桃基因组测序工作的完成以及高通量测序技术的发展，针对桃重要农艺性状的研究已深入到分子层面。由于桃尚未构建出成熟的稳定遗传转化体系，因此验证桃基因的功能及其调控机理任然是目前研究人员经常面临的难题。
在果树研究领域，缺少成熟稳定的遗传转化体系是一个较为常见的现象，例如石榴、梨、枣等。为解决这一问题，瞬时转化方法被广泛利用。目前在桃上，成熟桃果实的瞬时转化方法已较为成熟，可被应用于研究桃基因功能。然而，成熟桃果实中蛋白含量急剧减少，因此成熟桃果实的瞬时转化方法不适合应用于桃基因调控机理的研究。因此，开发出一种新的桃瞬时转化方法则显得尤为必要。利用叶片进行瞬时转化方法，进而研究基因的调控机理是一个广受业内认可的方法。目前，有关桃叶片瞬时转化的研究极少且转化效率非常低。
因此，在桃稳定转化技术难题尚未被攻克的背景下，开发出可应用于基因功能和基因调控基因研究的桃叶片瞬时转化方法，具有重要研究意义。同时，与稳定转化相比，瞬时转化方法具有简单，快速和高效的特点。
发明内容
本发明提出一种高效桃叶片瞬时转化方法，解决了桃叶片瞬时转化效率低的技术问题。
本发明的技术方案为：
（1）当年收桃核经低温4℃沙藏处理2月后，去除外部坚硬内果皮，将种子播于营养土中，并置于温度为22℃，湿度为75%，光照为6000-8000lux的环境下培养；
（2）将10-15 d苗龄的桃实生苗置于光照强度为600-800 lux条件下，培养5-8天，待用；
（3）选取经步骤（2）处理后的桃苗，以常规农杆菌介导的叶片抽真空方法进行瞬时转化。
进一步的，步骤（1）中所述去除内果皮时切勿损坏种子。
进一步的，步骤（1）中所述播种时应将种子胚根一端的种皮去除，并将胚根一端插入到土里进行播种。
进一步的，步骤（2）中所述10-15d苗龄的桃苗，其株高应尽量为15-20 cm。
进一步的，步骤（2）中所述桃苗在600-800 lux条件下，培养5-8天后，其叶片表现为叶宽略微增加，叶色变暗。
上述方法在快速验证基因功能中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明与现有桃叶片瞬时转化方法相比，改进之处主要有两方面：选用10-15d苗龄的桃实生苗和幼苗需经弱光（600-800Lux）培养5-8d。与常规方法相比，选用10-15d苗龄的桃实生苗进行叶片瞬时转化，其GUS基因转化效率显著提高。如图1所示实生苗大多数叶片都可被染上蓝色，而室外一年生枝条只有下部叶片被染上蓝色。进一步，如果选用10-15d苗龄且经过弱光培养5-8d的桃实生苗作为瞬时转化材料，其转基因效率可进一步提高。如图1所示弱光处理实生苗的大多数叶片都被染上深蓝色。上述结果说明，与现有桃叶片瞬时转化方法相比，本发明极显著地提高了桃叶瞬时转化效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
图1为桃实生苗和室外桃枝条叶片GUS染色结果：室外桃枝条（A），HM为正常光照材料（HM）和LM为弱光培养材料（C）。
图2为GUS基因转录水平检测结果：CK为空白对照、CM为室外桃枝条，HM为正常光照材料和LM为弱光培养材料。
图3为GUS蛋白活性检测结果：CK为空白对照、CM为室外桃枝条，HM为正常光照材料和LM为弱光培养材料。
图4为GUS蛋白含量检测结果： CK为空白对照、CM为室外桃枝条和LM为弱光培养材料。
图5为GFP荧光检测结果：空白对照（左）和试验组（右）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
桃叶片GUS和GFP基因瞬时转化试验
试验方法
1、桃实生苗准备和田间桃一年生枝条采集
当年收桃核经低温（4℃）沙藏处理2月后，去除外部坚硬内果皮，在温水中浸泡过夜后，剥除靠近胚根一端的种皮，25℃光照培养箱中催芽3~5天后，将其种植于培养基质中，并置于温度为22℃，湿度为75%，光照为6000-8000lux的环境下培养。
桃一年生枝条主要采集的是室外两年生桃树的幼嫩二次枝。
2、桃实生苗弱光处理及对照
将10-15 d苗龄、叶片伸展正常的桃实生苗置于光照强度为600-800 lux条件下，待叶片变宽、叶色加深（约培养5-8天），进行瞬时转化试验，并设置强光对照试验。
3、农杆菌介导叶片瞬时转化
3.1 转化前重悬液制备
选用载体pCAMBIA1381-GUS和pSAK277-GFP，通过液氮冻融法转入农杆菌GV3101中。挑单克隆于0.5ml LB培养基28℃过夜摇菌后，第二天转至50ml含有10 mM MES+20µM AS的LB液体培养基中过夜摇菌，4000g离心10分钟收菌，用10 mM MgCl2 +10 mM MES +150µMAS重悬农杆菌至浓度达到OD600为0.8左右，并加入0.02% Silwet L-77表面活性剂，室温静置2-3 小时后用于侵染。
3.2侵染及后续叶片培养
将正常桃叶片、经弱光处理的10-15D桃叶片及经强光处理的10-15D桃叶片浸没于农杆菌重悬液中进行抽真空侵染（-0.09MPa，侵染20分钟）。
用无菌水清洗侵染完成后叶片，套袋保湿，并放置25℃培养室中黑暗培养48h。
4、GUS染色及GUS基因转录水平检测、蛋白含量检测、GUS活性检测
GUS染色：取桃枝条于90%丙酮中固定20 min。使用GUS染色试剂盒（中科瑞泰生物科技有限公司）通过抽真空进行染色（-0.09Mpa，侵染20分钟），在37℃黑暗条件下孵育24h。染色完成后进行75%乙醇脱色，98℃水浴25分钟，直至去除叶绿素，结果如图1，室外枝条只有下部叶片被局部染上浅蓝色；正常培养条件下桃实生苗大部分叶片被染上浅蓝色；而经弱光培养的桃实生苗大部分叶片被染上深蓝色，由此可以看出常规方法选用室外桃幼嫩枝条进行GUS基因瞬时转化的效率非常低，而改进后方法（弱光处理的实生苗）转化效率极显著提高。
基因转录水平检测：将侵染后48h的桃叶片用液氮进行取样，利用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取桃叶片的RNA，通过反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）获得单链cDNA，进行GUS转录水平检测。检测所用GUS定量引物为：1381-qF：CTGGGTGGACGATATCACCG；1381-qR：TCCAGTTGCAACCACCTGTT；以水处理为对照，选取PpTEF2作为内参基因（PpTEF2-qF：GGTGTGACGATGAAGAGTGATG；反向引物PpTEF2-qR：TGAAGGAGAGGGAAGGTGAAAG），将获得的CT值按照2-△△CT方法分析表达量，结果如图2，由图2可知本申请的方法LM的GUS转录水平是常规方法CM的3.35倍。
活性检测：称取0.5g桃叶片提取总蛋白（同上），并通过BSA蛋白浓度测定试剂盒（索莱宝）进行浓度测定，并根据测定浓度调整体积，用0.5µg蛋白通过植物β-葡萄糖苷酸酶（β-GUS）酶联免疫分析（上海酶联生物科技有限公司）试剂盒测定桃叶片中β-葡萄糖苷酸酶的含量。结果如图3，由图3可知本申请的方法LM的GUS转录水平是常规方法CM的5.64倍。
蛋白含量检测：称取0.5g桃叶片使用植物蛋白提取试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）提取总蛋白，取40 µL蛋白液，加入10 µL的5*SDS Loading Buffer进行煮沸10 min变性。取15 µL样品加至12% SDS-PAGE胶（南京金斯瑞生物科技有限公司）进行电泳，电泳后将胶进行分适当分割后分别用于转膜和考马斯亮蓝染色。稳定电流300mA 1.5 h进行转膜，用含5 %脱脂奶粉的1*TBST进行室温封闭2 h。一抗孵育用His标签小鼠单克隆抗体（5000：1）（Abbkine）4 ℃过夜。二抗孵育用羊抗小鼠IgG抗体（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）室温1 h。使用ECL化学发光检测试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）显色并通过超高灵敏度化学发光成像系统（BIO-RAD）进行拍照，结果如图4。改进方法LM的GUS蛋白含量明显高于是常规方法CM。
5、GFP荧光检测
取侵染后两天的桃叶片制作成玻片，使用体视荧光显微镜（Nikon SMZ18）进行观测及拍照，结果如图5，由图5可知GFP荧光蛋白也可在桃叶片中被表达并检测到绿色荧光信号。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种桃叶片弱光瞬时转化方法，其特征在于，步骤如下：
（1）当年收桃核经低温沙藏处理后，去除外部坚硬的果皮，播于营养土中培养；步骤（1）中桃核经过2个月的低温4℃沙藏；培养的条件为温度22℃，湿度75%，光照6000-8000lux；
（2）将步骤（1）培养10-15 d苗龄的桃苗置于弱光照条件下，培养5-8天待用；其中弱光照条件为光照强度为600-800lux；
（3）选取经步骤（2）处理后的桃苗，以农杆菌介导的叶片抽真空方法进行瞬时转化。
2.根据权利要求1所述的桃叶片弱光瞬时转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中桃苗苗龄为10-15d，株高为10-15cm。
3.权利要求1-2任一项方法在验证基因功能中的应用。
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