CN108753816A - Syta基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于用于植物转基因技术领域，公开了一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系为OE21和OE41。所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括：用根癌农杆菌浸染花序的方法获得SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系。本发明进行了一次Kan筛选，结果证明选用的过表达株系OE21和OE41能够在Kan的MS平板上萌发生长，而野生型和syta突变体只能萌发，子叶不能变绿，也不能继续生长。说明过表达株系OE21和OE41是遗传稳定的转基因株系。

Description

SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法
技术领域
本发明属于用于植物细胞技术领域，尤其涉及一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：转基因技术的原理是将人工分离和修饰过的优质基因，导入到生物体基因组中，从而达到改造生物的目的。由于导入基因的表达，引起生物体的性状，可遗传的修饰改变。常用的遗传转化方法有农杆菌介导转化法、基因枪法、花粉管通道法等。农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。在用农杆菌浸染花序的方法构建转基因植物时，首先是获得目的基因的片段，再连接到适宜的质粒上形成转基因载体，再将载体转入农杆菌并筛选阳性克隆，然后将阳性克隆扩大培养并侵染受体植株的花序，从而导入受体植物细胞，再收获被侵染的拟南芥种子并繁殖得到T1代，最后用基因鉴定等方法进行验证，以达到预想的特性，满足人们的要求。由于每个技术环节的严谨和准确决定着得到的转基因株系具有目的基因的专一性和特异性，以及稳定的转化率，而现有技术往往比较笼统，不贴合，这是造成转化率降低和转基因株系性状不稳定的主要原因。因此，对每个步骤进行技术优化非常必要，如质粒的选择和改造，目的基因和质粒的连接，农杆菌菌种选择和阳性克隆的准确性，浸染花序的方法和转基因植株的培养方法，转基因株系的检测鉴定等。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)构建的转基因载体中，目的基因不能正常或大量表达。
(2)传统小提得到的质粒浓度过低而不能满足下一步转化农杆菌的需要。
(3)在筛选农杆菌阳性克隆时，常出现假阳性克隆，从而影响筛选和下一步判断的准确性。
(4)单纯依靠抗生素筛选，忽视了遗传本质，造成筛选不准确。
解决上述技术问题的难度和意义：
转基因技术应用广泛，通过转基因技术可以验证基因功能，从而助推生物学理论的发展，同时具有新性状的转基因株系丰富了农业生产的种质资源库。而载体的构建，农杆菌转化和阳性克隆的筛选，都是转基因技术的重要环节，这些环节出现技术问题，都会造成转基因株系筛选不准确，构建不成功，进而根本不能得到转基因株系。
目前有一些技术可以解决个别问题，但缺乏系统性和针对性。如Silica吸附法可以大量提取质粒，但是没有进一步的细化，而只注重是农杆菌浸染法还是基因枪法这样的大类的区别。另一方面，由于转基因技术本身存在很高的难度，如目的基因和载体的合理连接，以保证目的基因的正常表达和大量表达；如构建载体的质粒浓度要达到技术要求的浓度；转化和筛选株系时，阳性克隆的准确判断等等。更重要的是，在技术方面的选择直接影响转基因技术的安全性。因此，用科学、安全，稳定性强、并且操作可行性强，可重复的公开技术来发展和完善转基因技术迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法。
本发明是这样实现的，一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系为OE21和OE41。
本发明的另一目的在于提供一种所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括：用根癌农杆菌浸染花序的方法获得SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系。
进一步，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括以下步骤：
步骤一，植物培养，将春化处理的拟南芥种子播种于营养土和蛭石的混合物中，置于相对湿度60％，培养温度22-25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养；
步骤二，KCl法制备E.coilDH5α感受态细胞；
步骤三，转基因载体pBI121-35S：SYTA的活化和鉴定；
步骤四，Silica吸附法大量提取质粒；
步骤五，农杆菌的活化和鉴定，在含有三种抗生素的LB平板上，划线培养农杆菌EHA105菌株，48h后选择生长良好的单菌落；
步骤六，CaCl2法制备农杆菌感受态细胞；
步骤七，pBI121-35S：SYTA载体转化农杆菌；
步骤八，阳性农杆菌转化子的鉴定，随机挑取重组平板上的农杆菌单菌落接种于LB+Str+Kan液体培养基中进行振荡培养，培养后，以菌液作模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增以鉴定重组质粒是否转入；
步骤九，农杆菌介导的遗传转化；
步骤十，转基因植株T1代的获得及分离比的鉴定；
步骤十一，转基因植株T1代的DNA水平、RNA水平及蛋白水平的鉴定。
进一步，所述步骤二具体包括：在平板上挑取E.coilDH5α单菌落于10mL的LB培养基中，于37℃，225rpm摇床上振荡培养过夜；在50mL的LB培养基中加入0.5mL活化的DH5α培养液，于18℃，225rpm摇床上振荡培养过夜，测定OD600为0.6时终止振荡；把培养的菌液在冰上放置10min后倒入4℃预冷的离心管中，在4℃，3500rpm下离心10min；倒掉上清，在菌体沉淀中加入4℃预冷的TB缓冲液15mL并混匀，冰上放置10min后，再于4℃，3500rpm下离心5min；弃上清，加入TB缓冲液4mL，混匀后再加入DMSO280μL，冰浴10min后分装于EP管中；用封口膜封装每个EP管，并在液氮中处理使其冻透，再置于-80℃冰箱内长期保存。
进一步，所述步骤三具体包括：pBI121-35S:SYTA质粒中SYTA基因的N端连接35S强启动子，C端带有HA标签；将该质粒转化至E.coliDH5α感受态细胞，以长出的菌落为模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR检测；电泳检测为阳性的菌落扩大培养，Silica法提取质粒，酶切检测并基因测序验证。
进一步，所述步骤四具体包括：取培养至对数生长后期的含目标质粒的细菌培养液500mL，分至50mL离心管中，4℃下6000g离心5min，弃上清；按1：50的比例加入溶液I，振荡使菌体重悬；加入新配制的溶液II，颠倒混匀后冰浴5-8min；再加入0℃预冷的溶液III，摇动混匀后冰浴10min，使之出现白色絮状沉淀；4℃，8000rpm下离心15min，取上清至干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃条件下静置沉淀1h；4℃，8000rpm下离心15min，弃上清，加入TE缓冲液2mL溶解沉淀；再向溶解的沉淀中加入5mol/L的LiCl8mL，混匀后于4℃，10000g下离心10min；移出上清，加入10mL的Bind mix，室温培养3min；再次混合，于2000rpm下离心3min；弃上清，加入10mL的Bind mix，于2000rpm下离心3min；弃上清，加入50％的乙醇20mL，于2000rpm下离心3min；在室温下干燥沉淀15min；用500μLTE重悬沉淀，并在65℃条件下培养3min后于10000rpm下离心5min；移出上清，用于下一步或冷冻保存。
进一步，所述步骤六具体包括：挑取农杆菌EHA105单菌落接种到LB+Str的液体培养基中，并于28℃振荡培养过夜；在50mL的LB+Str的液体培养基中加入2mL上述培养液，继续于28℃振荡培养；检测菌液的OD600值，至达到0.5时，把培养液置于冰上冷却10min；在4℃，8000rpm条件下离心10min后，弃上清；用冰上预冷的CaCl2溶液1mL重悬农杆菌，以100μL分装到1.5mL的EP管中，液氮速冻后放入-80℃保存。
进一步，所述步骤七具体包括：取出制好的农杆菌感受态于冰上融化；加入适量Silica吸附法提取的重组质粒，液氮冻2min，然后37℃水浴5min；加入1mL的LB培养基，28℃振荡培养3h，离心收集菌体，将其涂在LB+Str(25μg/mL)+Kan(50μg/mL)平板上，28℃继续培养2-3d。
进一步，所述步骤九具体包括：在生长条件为22℃，16h光照/8h黑暗的组培室中培养拟南芥野生型植株至开花期；去掉第一个花薹，使多个花薹的同步生长；当10cm高时开始浸染花序；将保种的农杆菌划线培养于LB+Str(25μg/mL)+Rif(100μg/mL)+Kan(50μg/mL)平板上，28℃培养2d后挑取单菌落接入10mL无菌的LB+Str+Rif+Kan液体培养基中，于28℃，230rpm下振荡培养过夜；取2-4mL得到的菌液接入200mL的LB+Str+Rif+Kan培养基中，于28℃，230rpm下培养，检测菌液的OD600值，至达到1.8时，停止培养；在4℃，3000rpm下离心15min，弃上清后用5％蔗糖和0.02％SilwetL-77重悬沉淀，并调OD600＝0.6-0.8；把已开花的拟南芥花序全部浸没于调好OD值的农杆菌悬浮液中30-40s；用润湿且不透光的塑料袋覆盖浸染过的花序，22℃条件下黑暗培养24h后揭掉袋子；在22℃，16h光照/8h黑暗的条件下正常浇水和培养；一周之后再侵染一次，如此共浸染2-4次；收获：植株生长至荚果变干后收获种子，即T0代种子。
进一步，所述步骤十具体包括：在MS+Kan(50μg/mL)平板上种植T0代转基因种子，生长的阳性苗为筛选获得的T1代株系，把株系移栽至新的培养盆中继续生长，得到的种子为T1代的种子；再选取100颗左右T1代种子继续用MS+Kan(50μg/mL)筛选，统计正常生长的和不能正常生长的比例；对统计数据进行卡方检验X2＝(Oi-Ei)2/Ei，Oi为实际观测值，Ei为理论值；
所述步骤十一具体包括：取叶片用CTAB法提取总DNA，以提取的总DNA为模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增，电泳检测；提取分离比符合3：1的株系的总RNA，反转录成cDNA，以定量引物进行RT-PCR分析，以确定株系是否为真正的过量表达株系；加入HA抗体结合漂洗后，直接进行化学发光检测。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
(1)在构建转基因载体时，为增强SYTA基因的表达，将该基因的N端连接35S强启动子，并在SYTA的C端连接HA标签，便于后续在蛋白水平鉴定转基因株系。
(2)在构建转基因载体后，由于有些质粒优点多但拷贝数低(如pBI121-35S:AtSYTA)，用传统小提质粒的方法得到的质粒浓度过低，无法测序，故改用Silica吸附法大量提取质粒。
(3)在农杆菌阳性克隆的筛选中，使用同时含有三种抗生素(Str1:2000+Rif1:500+Kan1:1000)的LB培养基，简单快速，并确保得到的阳性克隆特异性高。
(4)在获得转基因种子后，在其T0代和T1代连续用含有抗生素Kan的培养基进行筛选，并结合统计学中的卡方测验法对抗性培养基筛选出来的T1代进行遗传分析，将Kan抗性和非Kan抗性的分离比例为3:1的株系确定为下一步检测对象，这样提高了筛选的准确性。
本发明通过教育部科技查新工作站检索，与对比文件(SYTA has positiveeffects on the heat resistance of Arabidopsis)相比具备很大的创造性。
附图说明
图1是本发明实施例提供的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的pBI121载体图谱示意图。
图3是本发明实施例提供的pBI121-35S:SYTA的酶切和转化农杆菌的鉴定示意图；
图中：A.pBI121-35S:SYTA转化E.coli DH5α的PCR检测；泳道1,2:阳性克隆；泳道3:阴性克隆；B.pBI121-35S:SYTA转化农杆菌及阳性克隆酶切产物的鉴定，泳道1,2,3,4为4个农杆菌转化子；泳道5为E.coli DH5α阳性克隆的酶切产物(阳性对照)；6为未转基因的农杆菌的扩增产物(阴性对照)；C.MS培养基上鉴定转基因幼苗；D.C、E图版株系分布示意；E.含卡那霉素的平板(Kan+MS)上鉴定转基因幼苗(Kan浓度为50ng/μL)。
图4是本发明实施例提供的SYTA转基因株系的鉴定示意图；
图中：A.Kan+MS培养基上的T0代阳性苗；B.卡方测验分离比为3:1的株系；C.转基因T3代纯合株系幼苗；D.转基因株系的DNA水平鉴定；E.转基因株系的mRNA水平鉴定；F.转基因株系的蛋白水平鉴定。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
AtSYTA基因属于现有序列(At2g20990)；pBI121载体，大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α)及根癌农杆菌菌种(EHA105)属于现有的，来源于四川大学教育部生物资源与生态环境重点实验室。
本发明实施例提供的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系为OE21和OE41。
如图1所示，本发明实施例提供的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括以下步骤：
S101：植物培养，将春化处理的拟南芥种子(野生型Col生态型)均匀播种于营养土和蛭石的混合物中，置于相对湿度60％，培养温度22-25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养；
S102：KCl法制备E.coilDH5α感受态细胞；
S103：转基因载体pBI121-35S：SYTA的活化和鉴定；
S104：Silica吸附法大量提取质粒；
S105：农杆菌的活化和鉴定，在含有三种抗生素(Str1:2000+Rif1:500+Kan1:1000)的LB平板上，划线培养农杆菌EHA105菌株，48h后选择生长良好的单菌落；
S106：CaCl2法制备农杆菌感受态细胞；
S107：pBI121-35S：SYTA载体转化农杆菌；
S108：阳性农杆菌转化子的鉴定，随机挑取重组平板上的农杆菌单菌落接种于LB+Str+Kan液体培养基中进行振荡培养，培养一定时间后，以菌液作模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增以鉴定重组质粒是否转入；
S109：农杆菌介导的遗传转化；
S110：转基因植株T1代的获得及分离比的鉴定；
S111：转基因植株T1代的DNA水平、RNA水平及蛋白水平的鉴定。
步骤S102具体包括：在平板上挑取E.coilDH5α单菌落于10mL的LB培养基中，于37℃，225rpm摇床上振荡培养过夜；在50mL的LB培养基中加入0.5mL活化的DH5α培养液，于18℃，225rpm摇床上振荡培养过夜，测定OD600约为0.6时终止振荡；把上述培养的菌液在冰上放置10min后倒入4℃预冷的离心管中，在4℃，3500rpm下离心10min；倒掉上清，在菌体沉淀中加入4℃预冷的TB缓冲液15mL并混匀，冰上放置10min后，再于4℃，3500rpm下离心5min；弃上清，加入TB缓冲液4mL，轻轻混匀后再加入DMSO280μL，冰浴10min后分装于EP管中(每管100-200μL)；用封口膜封装每个EP管，并在液氮中处理使其冻透，再置于-80℃冰箱内长期保存。
步骤S103具体包括：pBI121-35S:SYTA质粒为本实验室保存，该质粒中SYTA基因的N端连接35S强启动子，C端带有HA标签。将该质粒转化至E.coliDH5α感受态细胞，以长出的菌落为模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR检测。电泳检测为阳性的菌落扩大培养，Silica法提取质粒，酶切检测并基因测序验证。
步骤S104具体包括：取培养至对数生长后期的含目标质粒的细菌培养液500mL，分至50mL离心管中，4℃下6000g离心5min，弃上清(反复至收集全部菌液)；按1：50的比例加入溶液I，充分振荡使菌体重悬；加入新配制的溶液II(加入的体积为2倍的溶液I)，轻轻地颠倒混匀后冰浴5-8min；再加入0℃预冷的溶液III(加入的体积为1.5倍的溶液I)，摇动混匀后冰浴10min，使之出现白色絮状沉淀；4℃，8000rpm下离心15min，取上清至干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃条件下静置沉淀1h；4℃，8000rpm下离心15min，弃上清，加入TE缓冲液(pH8.0)2mL溶解沉淀；再向溶解的沉淀中加入5mol/L的LiCl8mL，混匀后于4℃，10000g下离心10min；移出上清，加入10mL的Bindmix(将Silica溶于10mL的4mol/L GuSCN中，再加入4％的Triton X-100即为Bind mix。其中每100mL过夜的培养液对应20mg的Silica)，室温培养3min；再次混合，于2000rpm下离心3min；弃上清，加入10mL的Bind mix，于2000rpm下离心3min；弃上清，加入50％的乙醇20mL，于2000rpm下离心3min。重复此步骤，尽可能多的除去上清；在室温下干燥沉淀15min；用500μLTE重悬沉淀，并在65℃条件下培养3min后于10000rpm下离心5min；移出上清，用于下一步实验或冷冻保存(可再次离心除去剩余的Silica)。
步骤S106具体包括：挑取农杆菌EHA105单菌落接种到LB+Str的液体培养基中(Str浓度为25μg/mL)，并于28℃振荡培养过夜；在50mL的LB+Str的液体培养基中加入2mL上述培养液，继续于28℃振荡培养；检测菌液的OD600值，至达到0.5时，把培养液置于冰上冷却10min；在4℃，8000rpm条件下离心10min后，弃上清；用冰上预冷的CaCl2溶液(100mM)1mL重悬农杆菌，以100μL分装到1.5mL的EP管中，液氮速冻后放入-80℃保存。
步骤S107具体包括：取出制好的农杆菌感受态于冰上融化；加入适量Silica吸附法提取的重组质粒(视浓度而定)，液氮冻2min，然后37℃水浴5min；加入1mL的LB培养基，28℃振荡培养3h，离心收集菌体，将其涂在LB+Str(25μg/mL)+Kan(50μg/mL)平板上，28℃继续培养2-3d。
步骤S108具体包括：随机挑取重组平板上的农杆菌单菌落接种于LB+Str+Kan液体培养基中进行振荡培养，培养一定时间后，以菌液作模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增以鉴定重组质粒是否转入。
步骤S109具体包括：在生长条件为22℃，16h光照/8h黑暗的组培室中培养拟南芥野生型植株至开花期。去掉第一个花薹，使多个花薹的同步生长。并当大多数花序约10cm高时开始浸染花序；将保种的农杆菌划线培养于LB+Str(25μg/mL)+Rif(100μg/mL)+Kan(50μg/mL)平板上，28℃培养2d后挑取单菌落接入10mL无菌的LB+Str+Rif+Kan液体培养基中，于28℃，230rpm下振荡培养过夜；取2-4mL上一步得到的菌液接入200mL的LB+Str+Rif+Kan培养基中，于28℃，230rpm下培养，检测菌液的OD600值，至达到1.8时，停止培养；在4℃，3000rpm下离心15min，弃上清后用5％蔗糖和0.02％SilwetL-77重悬沉淀，并调OD600＝0.6-0.8；把已开花的拟南芥花序全部浸没于上述调好OD值的农杆菌悬浮液中30-40s；用润湿且不透光的塑料袋覆盖浸染过的花序，22℃条件下黑暗培养24h后揭掉袋子；在22℃，16h光照/8h黑暗的条件下正常浇水和培养。一周之后再侵染一次，如此共浸染2-4次左右(具体次数以花序的多少为准)；收获：植株生长至荚果变干后收获种子，即T0代种子。
步骤S110具体包括：在MS+Kan(50μg/mL)平板上种植T0代转基因种子，能够生长的阳性苗为筛选获得的T1代株系，把这些株系移栽至新的培养盆中继续生长，得到的种子为T1代的种子。再选取100颗左右T1代种子继续用MS+Kan(50μg/mL)筛选，统计可以正常生长(带Kan抗性)的和不能正常生长(不带Kan抗性)的比例。然后对统计数据进行卡方检验X2＝(Oi-Ei)2/Ei(Oi为实际观测值，Ei为理论值)，分析这些株系的分离比是否符合3：1。
步骤S111具体包括：取少量叶片用CTAB法提取总DNA，然后以提取的总DNA为模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增，电泳检测；提取分离比符合3：1的株系的总RNA，反转录成cDNA，以定量引物进行RT-PCR分析，以确定这些株系是否为真正的过量表达株系。加入一抗(HA抗体)结合漂洗后，直接进行化学发光检测。
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1材料
1.1植物材料和菌种
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)野生型种子(Columbia生态型)，pBI121-SYTA质粒，大肠杆菌(E.coli)DH5α，农杆菌EHA105菌株均由本实验室保存。
1.2载体
pBI121双元表达载体，该载体含有卡那霉素选择抗性标记，35S强启动子和一个GUS基因(图2)。
1.3主要试剂
T4DNA连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker DL2000为北京天根产品；Tryptone、Yeast Extract购自Oxiford公司；PrimerstarMax高保真酶购自Takara公司；卡那霉素(Kan)、链霉素(Str)、利福平(Rif)为Amresco产品；HA抗体购自Roche公司；Silwet L-77购自博瑞克公司；其他试剂为国产分析纯。
1.4主要仪器设备
PCR仪(Bio-Rad)，电泳仪(Bio-Rad)，凝胶成像系统(Bio-Rad)，pH计(Hanna)，高速冷冻离心机(Bechman)，紫外可见分光光度计(Pharmacia)，超净工作台(苏州净化设备SW-CJ-2FD)，高压灭菌锅(上海申安LZDX-75KBS)，水浴锅(精宏DK-8D)，电子天平(上海精科天平FA1004)等。
1.5主要培养基和缓冲液
(1)LB培养基(1L)
用NaOH调pH至7.0，高压灭菌15min，固体培养基加入琼脂粉15g。
(2)MS培养基
A.大量元素20×(1L)
B.微量元素200×(1L)
C.Fe盐200×(500mL)
D.有机溶液200×(500mL)
MS培养基(1L)
用NaOH调PH值至5.8-6.0，固体培养基加琼脂粉8g，121℃高压蒸汽灭菌18min。
(3)2×CTAB提取缓冲液
上述溶液预先配好，用时需加入β-巯基乙醇至终浓度为0.1％-2％。
(4)2×植物蛋白质提取液
上述溶液预先配好，用时需加入等体积的2×蛋白质酶抑制剂(complete)
及β-巯基乙醇至终浓度7mM。
(5)SDS-PAGE 2×Loading Buffer
1.6主要引物
2方法
2.1植物培养
英国营养土和蛭石按1：1混匀，灭菌并冷却，将春化处理3d的拟南芥种子均匀播种在土壤和蛭石的混合物中，置于相对湿度60％，培养温度22-25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。
2.2 KCl法制备E.coil DH5α感受态细胞
(1)在平板上挑取单菌落于10mL的LB培养基中，于37℃，225rpm摇床上振荡培养过夜；
(2)在50mL的LB培养基中加入0.5mL活化的DH5α培养液，于18℃，225rpm摇床上振荡培养过夜，测定OD600约为0.6时终止振荡；
(3)把上述培养的菌液在冰上放置10min后倒入4℃预冷的离心管中，在4℃，3500rpm下离心10min；
(4)倒掉上清，在菌体沉淀中加入4℃预冷的TB缓冲液15mL并混匀，冰上放置10min后，再于4℃，3500rpm下离心5min；
(5)弃上清，加入TB缓冲液4mL，轻轻混匀后再加入DMSO280μL，冰浴10min后分装于EP管中(每管100-200μL)。
(6)用封口膜封装每个EP管，并在液氮中处理使其冻透，再置于-80℃冰箱内长期保存。
2.3转基因载体pBI121-35S:SYTA的活化和鉴定
pBI121-35S:SYTA质粒为本实验室保存，该质粒中SYTA基因的N端连接35S强启动子，C端带有HA标签。将该质粒转化至E.coliDH5α感受态细胞，以长出的菌落为模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR检测。电泳检测为阳性的菌落扩大培养，Silica法提取质粒，酶切检测并送华大基因公司测序验证。
2.4 Silica吸附法大量提取质粒
(因为pBI121为低拷贝质粒，传统小提，质粒浓度太低，无法测序，故用Silica法提取)。
(1)取培养至对数生长后期的含目标质粒的细菌培养液500mL，分至50mL离心管中，4℃下6000g离心5min，弃上清(反复至收集全部菌液)。
(2)按1：50的比例加入溶液I，充分振荡使菌体重悬。
(3)加入新配制的溶液II(加入的体积为2倍的溶液I)，轻轻地颠倒混匀后冰浴5-8min。
(4)再加入0℃预冷的溶液III(加入的体积为1.5倍的溶液I)，摇动混匀后冰浴10min，使之出现白色絮状沉淀。
(5)4℃，8000rpm下离心15min，取上清至干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃条件下静置沉淀1h。
(6)4℃，8000rpm下离心15min，弃上清，加入TE缓冲液(pH8.0)2mL溶解沉淀。
(7)再向溶解的沉淀中加入5mol/L的LiCl8mL，混匀后于4℃，10000g下离心10min。
(8)移出上清，加入10mL的Bind mix(将Silica溶于10mL的4mol/L GuSCN中，再加入4％的TritonX-100即为Bindmix。其中每100mL过夜的培养液对应20mg的Silica)，室温培养3min。
(9)再次混合，于2000rpm下离心3min。
(10)弃上清，加入10mL的Bind mix，于2000rpm下离心3min。
(12)弃上清，加入50％的乙醇20mL，于2000rpm下离心3min。重复此步骤，尽可能多的除去上清。
(13)在室温下干燥沉淀15min。
(14)用500μLTE重悬沉淀，并在65℃条件下培养3min后于10000rpm下离心5min。
(15)移出上清，用于下一步实验或冷冻保存(可再次离心除去剩余的Silica)。
2.5.农杆菌的活化和鉴定
在含有三种抗生素(Str1:2000+Rif1:500+Kan1:1000)的LB平板上，划线培养农杆菌EHA105菌株，48h后选择生长良好的单菌落备下一步实验使用。
2.6.CaCl2法制备农杆菌感受态细胞
(1)挑取农杆菌EHA105单菌落接种到LB+Str的液体培养基中(Str浓度为25μg/mL)，并于28℃振荡培养过夜；
(2)在50mL的LB+Str的液体培养基中加入2mL上述培养液，继续于28℃振荡培养；
(3)检测菌液的OD600值，至达到0.5时，把培养液置于冰上冷却10min；
(4)在4℃，8000rpm条件下离心10min后，弃上清；
(5)用冰上预冷的CaCl2溶液(100mM)1mL重悬农杆菌，以100μL分装到1.5mL的EP管中，液氮速冻后放入-80℃保存。
2.7 pBI121-35S:SYTA载体转化农杆菌
(1)取出农杆菌感受态于冰上融化；
(2)加入适量Silica吸附法提取的重组质粒(视浓度而定)，液氮冻2min，然后37℃水浴5min；
(3)加入1mL的LB培养基，28℃振荡培养3h，离心收集菌体，将其涂在LB+Str(25μg/mL)+Kan(50μg/mL)平板上，28℃继续培养2-3d。
2.8阳性农杆菌转化子的鉴定
随机挑取重组平板上的农杆菌单菌落接种于LB+Str+Kan液体培养基中进行振荡培养，培养一定时间后，以菌液作模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增以鉴定重组质粒是否转入。
2.9农杆菌介导的遗传转化
(1)在生长条件为22℃，16h光照/8h黑暗的组培室中培养拟南芥野生型植株至开花期。去掉第一个花薹，使多个花薹的同步生长。并当大多数花序约10cm高时开始浸染花序。
(2)将保种的农杆菌划线培养于LB+Str(25μg/mL)+Rif(100μg/mL)+Kan(50μg/mL)平板上，28℃培养2d后挑取单菌落接入10mL无菌的LB+Str+Rif+Kan液体培养基中，于28℃，230rpm下振荡培养过夜。
(3)取2-4mL上一步得到的菌液接入200mL的LB+Str+Rif+Kan培养基中，于28℃，230rpm下培养，检测菌液的OD600值，至达到1.8时，停止培养。
(4)在4℃，3000rpm下离心15min，弃上清后用5％蔗糖和0.02％SilwetL-77重悬沉淀，并调OD600＝0.6-0.8。
(5)把已开花的拟南芥花序全部浸没于上述调好OD值的农杆菌悬浮液中30-40s。
(6)用润湿且不透光的塑料袋覆盖浸染过的花序，22℃条件下黑暗培养24h后揭掉袋子。
(7)在22℃，16h光照/8h黑暗的条件下正常浇水和培养。一周之后再侵染一次，如此共浸染2-4次左右(具体次数以花序的多少为准)。
(8)收获：植株生长至荚果变干后收获种子，即T0代种子。
2.10转基因植株T1代的获得及分离比的鉴定
在MS+Kan(50μg/mL)平板上种植T0代转基因种子，能够生长的阳性苗为筛选获得的T1代株系，把这些株系移栽至新的培养盆中继续生长，得到的种子为T1代的种子。再选取100颗左右T1代种子继续用MS+Kan(50μg/mL)筛选，统计可以正常生长(带Kan抗性)的和不能正常生长(不带Kan抗性)的比例。然后对统计数据进行卡方检验X2＝(Oi-Ei)2/Ei(Oi为实际观测值，Ei为理论值)，分析这些株系的分离比是否符合3：1。
2.11转基因植株T1代的DNA水平鉴定
取少量叶片用CTAB法提取总DNA(见2.2.4.1)，然后以提取的总DNA为模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增，电泳检测(条件同2.2.4.2)。
2.12转基因植株T2代的RNA水平鉴定
提取分离比符合3：1的株系的总RNA，反转录成cDNA，以定量引物(见8.1.6)进行RT-PCR分析(见2.2.5)，以确定这些株系是否为真正的过量表达株系。
2.13转基因植株T2代蛋白质水平的鉴定
同2.2.6。加入一抗(HA抗体)结合漂洗后，直接进行化学发光检测。
3结果与分析
3.1 pBI121-35S:SYTA的PCR检测
用35Sup引物和SYTAdn引物对转化E.coli菌落的进行PCR检测结果显示(图3A)，多数被测菌落均表现为阳性，初步表明质粒pBI121-35S:SYTA转化E.coliDH5α成功。进一步扩大培养阳性克隆并对其质粒的酶切验证表明(图3B)，SYTA基因存在于E.coli阳性菌落的质粒中。华大基因公司的测序结果也证明了送出的酶切片段序列与目标基因SYTA序列相同。
3.2农杆菌的转化鉴定
用35Sup引物和SYTAdn引物对农杆菌转化子和未转基因的农杆菌菌液(阴性对照)进行PCR扩增(图3B)，对扩增产物和E.coli阳性克隆质粒的酶切产物(阳性对照)进行电泳检测。结果显示大多数农杆菌菌落由PCR扩增出了与阳性对照相同的约1600bp的条带，说明pBI121-35S:SYTA质粒已成功转入农杆菌。
3.3 SYTA转基因株系的鉴定
在含有Kan的培养基上培养T0代种子，由于转基因植株中有含Kan抗性的载体，因此能够在含Kan的MS平板上生长。这样筛选出T1代阳性苗(图4A)。提取各转基因株系的DNA并进行PCR检测，电泳结果表明至少有10株过表达转化株系均为阳性株系(图4D)。
把T1代阳性苗转入土壤中继续生长，并分株统计收获种子。继续用含Kan的MS平板筛选T1每个单株的种子。这时，有的单株的后代能够全部在Kan平板上生长，而有的单株的后代则只有部分可以生长。通过卡方测验进行分离比分析，发现仅有少量株系的分离比符合3：1(图4B)。这说明这些株系中的外源基因只有一个拷贝整合到基因组上。再将T2代转基因株系的种子播于含Kan的MS平板，经筛选后，得到了不再有分离比出现的株系(图4C)，即纯合的转基因株系。
本发明提取了这些株系及syta突变体的总RNA检测其SYTA的mRNA表达水平，结果表明部分株系的SYTA的转录水平都明显高于野生型，而突变体的表达低于野生型(图4E)。由于质粒pBI121-35S:SYTA上带有HA标签，因此进一步对mRNA水平高于野生型的株系进行Westernblot分析，以检测SYTA蛋白质水平的变化，结果显示这些株系中都可以检测到目标条带(图4F)，野生型对照则没有。说明这些株系中外源转入的SYTA都得以正常的表达。
对于即将用于实验的过表达株系，野生型和突变体，还进行了一次Kan筛选(图3C,图3D,图3E)，结果证明选用的过表达株系OE21和OE41能够在Kan的MS平板上萌发生长，而野生型和syta突变体只能萌发，子叶不能变绿，也不能继续生长。说明过表达株系OE21和OE41是遗传稳定的转基因株系。
本发明用根癌农杆菌浸染花序的方法获得了SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系。通过DNA表达水平，mRNA转录表达水平，蛋白水平的表达检测和验证，表明获得的过量表达SYTA的转基因株系满足下一步的需要，为接下来研究SYTA的功能提供了材料。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括：用根癌农杆菌浸染花序的方法获得SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系。
2.如权利要求1所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法包括以下步骤：
步骤一，植物培养，将春化处理的拟南芥种子播种于营养土和蛭石的混合物中，置于相对湿度60％，培养温度22-25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养；
步骤二，KCl法制备E.coilDH5α感受态细胞；
步骤三，转基因载体pBI121-35S：SYTA的活化和鉴定；
步骤四，Silica吸附法大量提取质粒；
步骤五，农杆菌的活化和鉴定，在含有三种抗生素的LB平板上，划线培养农杆菌EHA105菌株，48h后选择生长良好的单菌落；
步骤六，CaCl2法制备农杆菌感受态细胞；
步骤七，pBI121-35S：SYTA载体转化农杆菌；
步骤八，阳性农杆菌转化子的鉴定，随机挑取重组平板上的农杆菌单菌落接种于LB+Str+Kan液体培养基中进行振荡培养，培养后，以菌液作模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增以鉴定重组质粒是否转入；
步骤九，农杆菌介导的遗传转化；
步骤十，转基因植株T1代的获得及分离比的鉴定；
步骤十一，转基因植株T1代的DNA水平、RNA水平及蛋白水平的鉴定。
3.如权利要求2所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：在平板上挑取E.coilDH5α单菌落于10mL的LB培养基中，于37℃，225rpm摇床上振荡培养过夜；在50mL的LB培养基中加入0.5mL活化的DH5α培养液，于18℃，225rpm摇床上振荡培养过夜，测定OD600为0.6时终止振荡；把培养的菌液在冰上放置10min后倒入4℃预冷的离心管中，在4℃，3500rpm下离心10min；倒掉上清，在菌体沉淀中加入4℃预冷的TB缓冲液15mL并混匀，冰上放置10min后，再于4℃，3500rpm下离心5min；弃上清，加入TB缓冲液4mL，混匀后再加入DMSO280μL，冰浴10min后分装于EP管中；用封口膜封装每个EP管，并在液氮中处理使其冻透，再置于-80℃冰箱内长期保存。
4.如权利要求2所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：pBI121-35S:SYTA质粒中SYTA基因的N端连接35S强启动子，C端带有HA标签；将该质粒转化至E.coliDH5α感受态细胞，以长出的菌落为模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR检测；电泳检测为阳性的菌落扩大培养，Silica法提取质粒，酶切检测并基因测序验证。
5.如权利要求2所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述步骤四具体包括：取培养至对数生长后期的含目标质粒的细菌培养液500mL，分至50mL离心管中，4℃下6000g离心5min，弃上清；按1：50的比例加入溶液I，振荡使菌体重悬；加入新配制的溶液II，颠倒混匀后冰浴5-8min；再加入0℃预冷的溶液III，摇动混匀后冰浴10min，使之出现白色絮状沉淀；4℃，8000rpm下离心15min，取上清至干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃条件下静置沉淀1h；4℃，8000rpm下离心15min，弃上清，加入TE缓冲液2mL溶解沉淀；再向溶解的沉淀中加入5mol/L的LiCl8mL，混匀后于4℃，10000g下离心10min；移出上清，加入10mL的Bind mix，室温培养3min；再次混合，于2000rpm下离心3min；弃上清，加入10mL的Bind mix，于2000rpm下离心3min；弃上清，加入50％的乙醇20mL，于2000rpm下离心3min；在室温下干燥沉淀15min；用500μLTE重悬沉淀，并在65℃条件下培养3min后于10000rpm下离心5min；移出上清，用于下一步或冷冻保存。
6.如权利要求2所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述步骤六具体包括：挑取农杆菌EHA105单菌落接种到LB+Str的液体培养基中，并于28℃振荡培养过夜；在50mL的LB+Str的液体培养基中加入2mL上述培养液，继续于28℃振荡培养；检测菌液的OD600值，至达到0.5时，把培养液置于冰上冷却10min；在4℃，8000rpm条件下离心10min后，弃上清；用冰上预冷的CaCl2溶液1mL重悬农杆菌，以100μL分装到1.5mL的EP管中，液氮速冻后放入-80℃保存。
7.如权利要求2所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述步骤七具体包括：取出制好的农杆菌感受态于冰上融化；加入适量Silica吸附法提取的重组质粒，液氮冻2min，然后37℃水浴5min；加入1mL的LB培养基，28℃振荡培养3h，离心收集菌体，将其涂在LB+Str(25μg/mL)+Kan(50μg/mL)平板上，28℃继续培养2-3d。
8.如权利要求2所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述步骤九具体包括：在生长条件为22℃，16h光照/8h黑暗的组培室中培养拟南芥野生型植株至开花期；去掉第一个花薹，使多个花薹的同步生长；当10cm高时开始浸染花序；将保种的农杆菌划线培养于LB+Str(25μg/mL)+Rif(100μg/mL)+Kan(50μg/mL)平板上，28℃培养2d后挑取单菌落接入10mL无菌的LB+Str+Rif+Kan液体培养基中，于28℃，230rpm下振荡培养过夜；取2-4mL得到的菌液接入200mL的LB+Str+Rif+Kan培养基中，于28℃，230rpm下培养，检测菌液的OD600值，至达到1.8时，停止培养；在4℃，3000rpm下离心15min，弃上清后用5％蔗糖和0.02％SilwetL-77重悬沉淀，并调OD600＝0.6-0.8；把已开花的拟南芥花序全部浸没于调好OD值的农杆菌悬浮液中30-40s；用润湿且不透光的塑料袋覆盖浸染过的花序，22℃条件下黑暗培养24h后揭掉袋子；在22℃，16h光照/8h黑暗的条件下正常浇水和培养；一周之后再侵染一次，如此共浸染2-4次；收获：植株生长至荚果变干后收获种子，即T0代种子。
9.如权利要求2所述的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法，其特征在于，所述步骤十具体包括：在MS+Kan(50μg/mL)平板上种植T0代转基因种子，生长的阳性苗为筛选获得的T1代株系，把株系移栽至新的培养盆中继续生长，得到的种子为T1代的种子；再选取100颗左右T1代种子继续用MS+Kan(50μg/mL)筛选，统计正常生长的和不能正常生长的比例；对统计数据进行卡方检验X2＝(Oi-Ei)2/Ei，Oi为实际观测值，Ei为理论值；
所述步骤十一具体包括：取叶片用CTAB法提取总DNA，以提取的总DNA为模板，用35Sup引物和SYTAdn引物进行PCR扩增，电泳检测；提取分离比符合3：1的株系的总RNA，反转录成cDNA，以定量引物进行RT-PCR分析，以确定株系是否为真正的过量表达株系；加入HA抗体结合漂洗后，直接进行化学发光检测。
10.一种由权利要求1所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系的构建方法构建的SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系，其特征在于，所述SYTA基因过量表达的转基因拟南芥株系为OE21和OE41。
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