CN113278720A - 一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，包括以下步骤：S1、确定实验用Kana的适用浓度区间；S2、选取适应浓度的Kana筛选抗性的拟南芥；S3、TPS法提取成活拟南芥的DNA；S4、进行PCR验证；S5、得出结论。本发明首先培养野生型拟南芥，用来确定用Kana喷施的适用浓度区间，为接下来的筛选突变体拟南芥确定一个合适的Kana浓度值，提高实验的准确性和成功率；再培养T0代拟南芥，用上述合适浓度的Kana喷施，存活下来的拟南芥具有抗性，可作为检测时的样本，经过继续培养后进行取样PCR检查，减少了培养的时间，提高了实验效率；利用基质来培养拟南芥，基质成分简单，较容易灭菌，培养时污染较少，Kana溶液通过喷洒的方式进行施加，操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法。
背景技术
现有的鉴定转基因拟南芥的方式通常是通常是用MS培养基对拟南芥进行培养，这种方式的培养对于新手来说，污染率高，进而失败率较高；另一方面，不同拟南芥的抗性不同，对于药剂的浓度，根据前人的实验数据直接培植，容易产生偏差和失败。
为此，我们提出一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，使得效率更高，操作更简单。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，包括以下步骤：
S1、确定实验用Kana的适用浓度区间；
S2、选取适应浓度的Kana筛选抗性的拟南芥；
S3、TPS法提取成活拟南芥的DNA；
S4、进行PCR验证；
S5、得出结论。
在本发明的一种实施例中，S1的实验过程包括以下步骤：
第一步，将普通拟南芥密播于育苗块上，放入智能光照培养箱培养，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光强3000-3500Lux，温度21-23℃，相对湿度为60-75％；
第二步，培养预定时间后，约7天，待拟南芥子叶展开，将其平均分为三组，三组分别喷施50mg/L、75mg/L、100mg/L的Kana溶液，每天喷预定的次数，每次喷施的量相等，喷施kana溶液期间不浇水；
第三步，喷施14到21天后，观察野生型拟南芥生长状态，喷施50mg/L Kana溶液的育苗块，还有健康的普通型拟南芥存活，而喷施75mg/L的Kana溶液的育苗块，普通型拟南芥死亡率超过70％，而喷施100mg/L的Kana溶液的育苗块，普通型拟南芥死亡率超过95％；
第四步，选取75-110mg/L的Kana溶液作为下一步实验的实验药剂。
优选的，选择100mg/L的Kana溶液作为实验药剂。
因为下一步实验时，实验材料为带有Kana抗性的转基因拟南芥，其对Kana溶液具有抗性，浓度过低的情况下，普通拟南芥和带有Kana抗性的转基因拟南芥都能存活，则无法将带有Kana抗性的转基因拟南芥筛选出来。
在本发明的一种实施例中，普通拟南芥选取为野生拟南芥。
在本发明的一种实施例中，在S2中，选取带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥进行培植；
将带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥密播于育苗块，放入培养箱培养，16h光照/8h黑暗，光强3000-3500Lux，温度21-23℃，相对湿度为60-75％，待拟南芥子叶展开，每天喷施预定次数的100mg/L的Kana溶液，每次喷施的量相等，期间不浇水；
一定时间后将成活的鲜绿色的拟南芥移栽到基质中进行培养。
在本发明的一种实施例中，带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥直接选取S1中的施加100mg/L的Kana溶液。可缩短培养的时间，更快的得出数据。
在本发明的一种实施例中，培植带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥的环境和培养普通拟南芥的环境相同。
在本发明的一种实施例中，基质的成分为草炭土：蛭石＝1:1，基质经过150℃-200℃高温杀菌处理20-30分钟。相对于MS培养基来说，基质更容易配置。
在本发明的一种实施例中，在S3中，待拟南芥生长到抽苔前，用镊子取叶片于1.5mL离心管中，加入液氮，用1mL枪头进行碾磨，直至叶片成粉末状。再向离心管中加入400μLTPS溶液，65℃水浴30min(每10min摇匀一次)，室温放置5min，12000rpm离心5min。取上清液350μL，加入等体积异丙醇，室温沉淀5min，再上下颠倒混匀。12000rpm离心5min，弃去上清液，加入500μL的75％乙醇，吸打混匀。10000rpm离心5min，弃去上清液(倒掉)，晾干后加入100μL的ddH2O，静置5min，吸打混匀，静置5min，放入-20℃冰箱保存。
在本发明的一种实施例中，在S4中，用特异引物经行PCR验证，PCR反应体系为：10μL 2x Phanta Max Buffer，0.4μL dNTPs(2mmol/L)，上下游引物F/R各0.8μL，0.4μL酶，1μLDNA，补足ddH2O至20μL体系。PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸1.5min，最后72℃延伸10min，共进行40个循环。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒回收并纯化，然后进行DNA测序鉴定。
综上所述，由于采用了上述技术，本发明的有益效果是：
本发明中，本发明首先培养野生型拟南芥，用来确定用Kana喷施的适用浓度区间，为接下来的筛选突变体拟南芥确定一个合适的Kana浓度值，提高实验的准确性和成功率；再培养T0代拟南芥，用上述合适浓度的Kana喷施，存活下来的拟南芥具有抗性，可作为检测时的样本，经过继续培养后进行取样PCR检查，减少了培养的时间，提高了实验效率；利用基质来培养拟南芥，基质成分简单，较容易灭菌，培养时污染较少，Kana溶液通过喷洒的方式进行施加，操作简单。
附图说明
图1为子叶期的野生型拟南芥；
图2为喷施kana溶液的野生型拟南芥；
图3为喷施100mg/L的Kana溶液的带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥；
图4为带有Kana抗性的转基因拟南芥的PCR鉴定结果。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，指示方位或位置关系的术语为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据说明书具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例1
请参阅图1-图4，本发明提供了一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，包括以下步骤：
S1、确定实验用Kana的适用浓度区间；
S1的实验过程包括以下步骤：
第一步，将普通拟南芥密播于育苗块上，放入智能光照培养箱培养，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光强3000-3500Lux，温度21-23℃，相对湿度为60-75％；
第二步，培养预定时间后，约7天，待拟南芥子叶展开，如图1所示，将其平均分为三组，三组分别喷施50mg/L、75mg/L、100mg/L的Kana溶液，每天喷预定的次数，每次喷施的量相等，喷施kana溶液期间不浇水；
第三步，喷施14到21天后，观察野生型拟南芥生长状态，喷施50mg/L Kana溶液的育苗块，还有健康的普通型拟南芥存活，而喷施75mg/L的Kana溶液的育苗块，普通型拟南芥死亡率超过70％，而喷施100mg/L的Kana溶液的育苗块，普通型拟南芥死亡率超过85％；如图2所示。
第四步，选取75-110mg/L的Kana溶液作为下一步实验的实验药剂。
优选的，选择100mg/L的Kana溶液作为实验药剂。
因为下一步实验时，实验材料为带有Kana抗性的转基因拟南芥，其对Kana溶液具有抗性，浓度过低的情况下，普通拟南芥和带有Kana抗性的转基因拟南芥都能存活，则无法将带有Kana抗性的转基因拟南芥筛选出来。
优选的，普通拟南芥选取为野生拟南芥。
S2、选取适应浓度的Kana筛选抗性的拟南芥；
选取带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥进行培植；
将带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥密播于育苗块，放入培养箱培养，16h光照/8h黑暗，光强3000-3500Lux，温度21-23℃，相对湿度为60-75％，待拟南芥子叶展开，每天喷施预定次数的100mg/L的Kana溶液，每次喷施的量相等，期间不浇水；如图3所示。
一定时间后将成活的鲜绿色的拟南芥移栽到基质中进行培养。
带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥直接选取S1中的施加100mg/L的Kana溶液的普通拟南芥。可缩短培养的时间，更快的得出数据。
培植带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥的环境和培养普通拟南芥的环境相同。
基质的成分为草炭土：蛭石＝1:1，基质经过150℃-200℃高温杀菌处理20-30分钟。相对于MS培养基来说，基质更容易配置，成分简单更容易灭菌。
S3、TPS法提取成活拟南芥的DNA；
待拟南芥生长到抽苔前，用镊子取叶片于1.5mL离心管中，加入液氮，用1mL枪头进行碾磨，直至叶片成粉末状。再向离心管中加入400μLTPS溶液，65℃水浴30min(每10min摇匀一次)，室温放置5min，12000rpm离心5min。取上清液350μL，加入等体积异丙醇，室温沉淀5min，再上下颠倒混匀。12000rpm离心5min，弃去上清液，加入500μL的75％乙醇，吸打混匀。10000rpm离心5min，弃去上清液(倒掉)，晾干后加入100μL的ddH2O，静置5min，吸打混匀，静置5min，放入-20℃冰箱保存。
S4、进行PCR验证；
用特异引物经行PCR验证，PCR反应体系为：10μL 2x Phanta Max Buffer，0.4μLdNTPs(2mmol/L)，上下游引物F/R各0.8μL，0.4μL酶，1μLDNA，补足ddH2O至20μL体系。PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸1.5min，最后72℃延伸10min，共进行40个循环。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒回收并纯化，然后进行DNA测序鉴定。
S5、得出结论；
检测结果如图4所示，通过PCR验证，我们发现叶片为鲜绿色的拟南芥为转基因突变体。说明通过喷施100mg/L的Kana能成功筛选转基因植株。
实施例2
请参阅图1-4，一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，包括以下步骤：
S1、确定实验用Kana的适用浓度区间；
S1的实验过程包括以下步骤：
第一步，将普通拟南芥密播于育苗块上，放入智能光照培养箱培养，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光强3000-3500Lux，温度21-23℃，相对湿度为60-75％；
第二步，培养预定时间后，,约7天，待拟南芥子叶展开，如图1所示，将其平均分为三组，三组分别喷施50mg/L、75mg/L、100mg/L的Kana溶液，每天喷预定的次数，每次喷施的量相等，喷施kana溶液期间不浇水；
第三步，喷施14到21天后，观察野生型拟南芥生长状态，喷施50mg/L Kana溶液的育苗块，还有健康的普通型拟南芥存活，而喷施75mg/L的Kana溶液的育苗块，普通型拟南芥死亡率超过70％，而喷施100mg/L的Kana溶液的育苗块，普通型拟南芥死亡率超过85％；如图2所示。
第四步，选取75-110mg/L的Kana溶液作为下一步实验的实验药剂。
优选的，选择100mg/L的Kana溶液作为实验药剂。
因为下一步实验时，实验材料为带有Kana抗性的转基因拟南芥，其对Kana溶液具有抗性，浓度过低的情况下，普通拟南芥和带有Kana抗性的转基因拟南芥都能存活，则无法将带有Kana抗性的转基因拟南芥筛选出来。
优选的，普通拟南芥选取为野生拟南芥。
S2、选取适应浓度的Kana筛选抗性的拟南芥；
选取带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥进行培植；
将带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥密播于育苗块，放入培养箱培养，16h光照/8h黑暗，光强3000-3500Lux，温度21-23℃，相对湿度为60-75％，待拟南芥子叶展开，每天喷施预定次数的100mg/L的Kana溶液，每次喷施的量相等，期间不浇水；如图3所示。
一定时间后将成活的鲜绿色的拟南芥移栽到基质中进行培养。
带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥直接选取S1中的施加75mg/L的Kana溶液的普通拟南芥。可缩短培养的时间，更快的得出数据。
培植带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥的环境和培养普通拟南芥的环境相同。
基质的成分为草炭土：蛭石＝1:1，基质经过150℃-200℃高温杀菌处理20-30分钟。相对于MS培养基来说，基质更容易配置，成分简单更容易灭菌。
S3、TPS法提取成活拟南芥的DNA；
待拟南芥生长到抽苔前，用镊子取叶片于1.5mL离心管中，加入液氮，用1mL枪头进行碾磨，直至叶片成粉末状。再向离心管中加入400μLTPS溶液，65℃水浴30min(每10min摇匀一次)，室温放置5min，12000rpm离心5min。取上清液350μL，加入等体积异丙醇，室温沉淀5min，再上下颠倒混匀。12000rpm离心5min，弃去上清液，加入500μL的75％乙醇，吸打混匀。10000rpm离心5min，弃去上清液(倒掉)，晾干后加入100μL的ddH2O，静置5min，吸打混匀，静置5min，放入-20℃冰箱保存。
S4、进行PCR验证；
用特异引物经行PCR验证，PCR反应体系为：10μL 2x Phanta Max Buffer，0.4μLdNTPs(2mmol/L)，上下游引物F/R各0.8μL，0.4μL酶，1μLDNA，补足ddH2O至20μL体系。PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸1.5min，最后72℃延伸10min，共进行40个循环。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒回收并纯化，然后进行DNA测序鉴定。
S5、得出结论；
检测结果如图4所示，通过PCR验证，我们发现叶片为鲜绿色的拟南芥为转基因突变体。说明通过喷施75mg/L的Kana能成功筛选转基因植株。
工作原理：首先培养普通拟南芥，一方面可以确定检测用Kana的适用浓度区间，为接下来的筛选确定一个比书面上更为合适的Kana的浓度值，提高实验的准确性和成功率；另一方面，存活下来的普通拟南芥具有抗性，可作为检测时的样本，经过继续培养筛选后进行取样，减少了培养的时间，提高了实验效率；
利用基质来培养拟南芥，基质成分简单，较容易灭菌，培养时污染较少，Kana溶液通过喷洒的方式进行施加，操作简单。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
Claims (9)
1.一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、确定实验用Kana的适用浓度区间；
S2、选取适应浓度的Kana筛选抗性的拟南芥；
S3、TPS法提取成活拟南芥的DNA；
S4、进行PCR验证；
S5、得出结论。
2.根据权利要求1所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：
S1的实验过程包括以下步骤：
第一步，选取普通拟南芥，将普通拟南芥密播于育苗块上，放入智能光照培养箱培养，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光强3000-3500Lux，温度21-23℃，相对湿度为60-75％；
第二步，培养预定时间后，待拟南芥子叶展开，将其平均分为三组，三组分别喷施50mg/L、75mg/L、100mg/L的Kana溶液，每天喷预定的次数，每次喷施的量相等，喷施kana溶液期间不浇水；
第三步，喷施14到21天后，观察野生型拟南芥生长状态，喷施50mg/L Kana溶液的育苗块，还有健康的普通型拟南芥存活，而喷施75mg/L的Kana溶液的育苗块，普通型拟南芥死亡率超过70％，而喷施100mg/L的Kana溶液的育苗块，普通型拟南芥死亡率超过95％；
第四步，选取75-110mg/L的Kana溶液作为下一步实验的实验药剂。
3.根据权利要求2所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：普通拟南芥选取为野生拟南芥。
4.根据权利要求1所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：在S2中，
选取带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥进行培植；
将带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥密播于育苗块，放入培养箱培养，16h光照/8h黑暗，光强3000-3500Lux，温度21-23℃，相对湿度为60-75％，待拟南芥子叶展开，每天喷施预定次数的100mg/L的Kana溶液，每次喷施的量相等，期间不浇水；
一定时间后将成活的鲜绿色的拟南芥移栽到基质中进行培养。
5.根据权利要求4所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥直接选取S1中的施加100mg/L的Kana溶液的普通拟南芥。
6.根据权利要求4所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：培植带有Kana抗性的T0代转基因拟南芥的环境和培养普通拟南芥的环境相同。
7.根据权利要求1所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：
基质的成分为草炭土：蛭石＝1:1，基质经过150℃-200℃高温杀菌处理20-30分钟。
8.根据权利要求所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：在S3中，
待拟南芥生长到抽苔前，用镊子取叶片于1.5mL离心管中，加入液氮，用1mL枪头进行碾磨，直至叶片成粉末状；再向离心管中加入400μLTPS溶液，65℃水浴30min(每10min摇匀一次)，室温放置5min，12000rpm离心5min；取上清液350μL，加入等体积异丙醇，室温沉淀5min，再上下颠倒混匀；12000rpm离心5min，弃去上清液，加入500μL的75％乙醇，吸打混匀；10000rpm离心5min，弃去上清液(倒掉)，晾干后加入100μL的ddH2O，静置5min，吸打混匀，静置5min，放入-20℃冰箱保存。
9.根据权利要求1所述的一种基于喷施Kana鉴定转基因拟南芥的方法，其特征在于：在S4中，用特异引物经行PCR验证，PCR反应体系为：10μL 2x Phanta Max Buffer，0.4μLdNTPs(2mmol/L)，上下游引物F/R各0.8μL，0.4μL酶，1μLDNA，补足ddH2O至20μL体系；PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸1.5min，最后72℃延伸10min，共进行40个循环；PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒回收并纯化，然后进行DNA测序鉴定。
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