CN103149157A

CN103149157A - 卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法

Info

Publication number: CN103149157A
Application number: CN2012105923127A
Authority: CN
Inventors: 向浏欣; 蔡应繁; 付于银; 刘吉军; 冉燕子; 王秋娟; 王小艳
Original assignee: Chongqing University of Post and Telecommunications
Current assignee: Chongqing University of Post and Telecommunications
Priority date: 2012-12-29
Filing date: 2012-12-29
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明公开了一种卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法，所述方法通过切取茎瘤芥叶片并放入含6-苄氨基腺嘌呤和卡那霉素的水溶液的检测液中观察叶片是否黄化死亡来判断转基因与否，实验成本低，方法简单；当筛选的植株量大时，该方法尤其适用，可以大大缩小进一步进行分子生物学实验验证转基因植株的范围，节约人力物力，节约试剂和时间。

Description

卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法。

背景技术

茎瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)，又称青菜头，是十字花科芸薹属植物，该属包含许多有重要经济价值的油料、蔬菜、饲料作物，如油菜、白菜、甘蓝等，茎瘤芥为榨菜的主要原料，口感鲜嫩、营养丰富，是我国重庆、四川、浙江等地区主要的经济作物之一。

多年来，茎瘤芥的相关研究主要集中在遗传育种、良种繁育、栽培技术、品质安全等领域，近年才陆续有生物学方面研究的报道，包括基因的克隆、功能研究以及茎瘤芥瘤状茎膨大相关研究，企图通过基因工程方法提高茎瘤芥的产量、质量以及抗病性、抗逆性等。

茎瘤芥转基因方法目前主要采用的方法为：取外植体进行组织培养，再通过农杆菌浸染外植体使农杆菌中携带的外源基因转化至外植体中从而获得转基因植株，农杆菌转化方法如文献《芥菜转基因再生体系的建立》（杨朝辉等，作物学报）和《芥菜cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化研究》（梁婷等，安徽农业科学），其中农杆菌中的重组表达质粒除携带外源基因序列外，通常还有抗生素抗性标记基因以便筛选转基因植株，当农杆菌侵染外植体后，通过添加相应抗生素以筛选获得可能的转基因植株。

通过组培方法筛选获得的存活下来的植株，由于添加抗生素的浓度和时间可能不适宜（浓度和时间不适宜会导致非转化体逃离筛选）或者由于采用较低的抗生素浓度筛选（采用较低的抗生素浓度是增加再生苗甚至是转基因苗数量的方法，因为浓度低则选择压小，则愈伤组织会更多地生长和分化，因此非转化体数量会增多），则再生苗中很可能多数是假转化体，因此后续必须对这些植株进行进一步的分子生物学筛选，比如提取植株的DNA与RNA进行基因的PCR、RT-PCR、Southern杂交、Northern杂交，甚至Western杂交以确保为转基因植株。另外，农杆菌侵染获得的第一代转基因植株还是杂合子，若要进行功能分析和研究，必须获得纯合子，那么，同样地，需要进行大量的筛选，筛选放方法仍然为提取植株的DNA与RNA进行基因的PCR、RT-PCR、Southern杂交、Northern杂交，甚至Western杂交。

然而，提取植株的DNA与RNA、Southern杂交、Northern杂交等这些分子生物学技术需要使用大量试剂和耗材，而且特异性越强的检测技术所需的费用越昂贵，检测周期长，并且操作复杂，当筛选的植株的量大时显然成本高昂而且费时费力。

为节省实验成本，CN102696477A和CN102217472A分别公开了用卡那霉素溶液浸种筛选转基因棉花和卡那霉素涂抹叶片筛选转基因萝卜的方法，但两者所采用的卡那霉素浓度高，分别为1000-1500mg/L和1000mg/L，后者筛选时间长，需12天；另外，棉花种子大适合浸种筛选，茎瘤芥种子相对棉花非常小，不适宜对种子进行抗生素处理；而且，不同物种、不同组织对同一浓度抗生素的承受能力均不同，因此，更不能将上述筛选棉花和萝卜的方法直接应用于茎瘤芥的转基因筛选。

因此，需要一种快速简单的筛选转基因茎瘤芥的方法，尤其是当筛选植株量较大时，可以节约实验成本和时间成本，以实现初步筛选，缩小后续分子生物学实验的筛选范围。

发明内容

鉴于此，为节约实验成本，缩小分子生物学实验（如提取植株的DNA与RNA进行基因的PCR、RT-PCR、Southern杂交、Northern杂交，甚至Western杂交等）的筛选范围，本发明提供一种简单、低成本的转基因茎瘤芥初步筛选的方法，采用的技术方案是：

通过切取茎瘤芥植株的一小片叶片，并将切下的叶片于含有生长素和抗生素的水溶液中观察叶片的黄化程度来判断是否为转基因植株，具体方法为：

切取茎瘤芥植株的叶片，放入含6-苄氨基腺嘌呤和卡那霉素的水溶液的检测液中，并观察所述叶片是否黄化死亡，若是则判断为非转基因植株，若否则判断为转基因植株。无卡那霉素抗性的叶片在一定浓度的卡那霉素溶液中会黄化甚至死亡，即叶片颜色由绿色变为黄色或褐色，由此作为判断转基因植株的特征；生长素6-苄氨基腺嘌呤可以帮助切下的叶片保持一定生存能力。

进一步地，所述叶片为新生嫩叶，叶面积为2-4cm²，即新长出来的叶面积在2-4cm²的叶片；6-苄氨基腺嘌呤和卡那霉素的浓度分别为1mg/L和120mg/L，且观察5-6天后所述叶片是否黄化死亡。由于不同种植物、甚至同种植物的不同组织器官对同一浓度的抗生素的承受能力均不同，因此必须通过梯度试验获得检测液中卡那霉素的最佳浓度以用于检测。另外，叶片面积过大会延长黄化死亡时间，不利于筛选；叶片过小又不能起到观察黄化程度变化的过程，从而导致判断失误。

进一步地，所述黄化死亡指所述叶片的黄化面积比例为80-100%。当黄化面积达80%，实验证明叶片已经不能进行正常的生存代谢，时间再延长2-3天必定全部黄化即死亡。特别地，在判断是否为转基因植株时，我们以黄化死亡为判定准则，因为只有黄化死亡才能为我们提供更正确的判定结果，才能严格为后续的分子生物学实验缩小筛选范围。

进一步地，所述叶面积为3cm²。

进一步地，所述观察的天数为5天。实验证明5天后叶片均黄化死亡，为减少观察的时间，5天即可。

本发明中，通过切取茎瘤芥叶片并放入含6-苄氨基腺嘌呤和卡那霉素的检测液中观察是否黄化死亡来判断转基因与否的方法，实验成本低，方法简单，在1mg/L6-苄氨基腺嘌呤和120mg/L卡那霉素的检测液中，5-6天即可快速筛选，正确率高；当筛选的植株量大时，该筛选方法尤其适用，可以大大缩小进一步进行分子生物学实验验证转基因植株的范围，节约人力物力，节约试剂和时间。

附图说明

图1为本发明野生型叶片在不同浓度卡那霉素检测液中5天的黄化情况图；

图2为本发明1mg/L6-BA和120mg/L Kana检测液筛选转基因叶片的叶片黄化情况图；

图3为本发明叶片筛选转基因后又进一步以基因组DNA为模板PCR扩增目的基因验证的电泳图。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。

1、通过叶片筛选茎瘤芥转基因植株的卡那霉素浓度梯度实验：

由于不同种植物、甚至同种植物的不同组织器官对同一抗生素的承受能力均不同，因此要获取切下的茎瘤芥叶片对卡那霉素的承受程度以选择合适的抗生素浓度需要做梯度试验，方法如下：

十月中旬将茎瘤芥种子（品种为永安小叶，购买于重庆市涪陵农科所）野生型播种于地里；同时将本实验室获得的超表达茎瘤芥光敏色素A的转基因茎瘤芥种子和超表达茎瘤芥光敏色素B的转基因茎瘤芥种子（二者均携带nptII基因，可以采用卡那霉素筛选）播种于地里。播种一个半月后切取野生型和转基因茎瘤芥的新生嫩叶，其叶面积为3-4cm²，在不同浓度的检测液中检测叶片的黄化情况以判断是否为转基因植株（没有抗性的叶片，在抗生素环境下将逐步黄化死亡）。检测液为含1mg/L的生长素6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和不同浓度的卡那霉素（简写为Kana），其中卡那霉素的浓度设有六个梯度，为：20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L。上述播种的3个品种茎瘤芥均切取叶片于各个浓度中进行检测，每个品种、每个浓度均检测10片嫩叶，并重复3次，在10小时光照、14小时黑暗、20℃条件下培养并定期观察叶片变色情况，叶片的黄化面积比例达80%认为叶片死亡，定期观察为每24小时观察1次。检测统计结果见表1，可见，野生型叶片在120mg/L卡那霉素检测液5天（即叶片放入检测液中120小时）时黄化面积达80-100%，即叶片全部死亡；野生型叶片在160mg/L卡那霉素检测液4天（96小时）时黄化面积达80-100%，即叶片全部死亡；野生型叶片在200mg/L卡那霉素检测液2天（48小时）时黄化面积达80-100%，即叶片全部死亡。图1所示为5天时不同浓度卡那霉素的检测液中野生型叶片的黄化程度，从左至右依次为20mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L，黄化程度约为0-5%、15-30%、40-60%、80-100%。

根据表1，转基因叶片在160mg/L卡那霉素检测液2-3天就会出现黄化现象，200mg/L卡那霉素检测液中黄化现象严重，说明转基因植株不能承受较高浓度的卡那霉素选择压。从时间上、黄化程度上考虑，并参照野生型黄化数据（参照野生型黄化数据较好，因为不同的转基因植株的抗性效率会有差异，有不确定性），最终选择最佳的卡那霉素浓度为120mg/L以筛选转基因植株较合适，即如果叶片于含1mg/L6-BA和120mg/L Kana的检测液中5天仍不死亡则初步判断为转基因植株。

表1不同浓度卡那霉素检测液中叶片黄化程度统计

2、叶片于1mg/L6-BA和120mg/L Kana检测液中筛选转基因茎瘤芥植株的实验例：

将茎瘤芥种子（品种为永安小叶）野生型播种于5瓶MS培养基中，每瓶10-15颗种子，于10小时光照、14小时黑暗、20℃条件下的培养室中培养；七天后，剪取子叶于5瓶预培养基（MS+3mg/L6-BA+0.15mg/L NAA）培养4天，于农杆菌（农杆菌为本实验室保存，该农杆菌含pCAMBIA2300重组质粒，其中的外源基因序列为拟南芥类钙调蛋白AtCML37基因全长开放阅读框ORF序列558bp，且该重组质粒携带有Kana抗性基因）中浸染10分钟，然后于5瓶共培养基（MS+3mg/L6-BA+0.15mg/L NAA+500mg/L Carb）培养4天，于10瓶筛选培养基（MS+3mg/L6-BA+0.15mg/L NAA+500mg/L Carb+20mg/L Kana）中培养筛选培养（筛选培养时期每2周更换新的筛选培养基），30天后共有26个子叶发芽，再过30天这些子叶均长出1-4颗再生苗，且有5-10cm高，于是将各个再生苗分出并转入生根培养基（MS+0.15mg/L NAA+500mg/L Carb）中生根，30天后将所有生根植株移入室外土中生长，共有63株。

室外生长1个月后，每株切取1片嫩叶，叶面积约3cm²，放入含1mg/L6-BA和120mg/L Kana的检测液中筛选转基因植株，叶片黄化面积小于80%为存活，即判断为转基因植株，检测结果见表2，结果显示叶片放于检测液中5天和6天仍然存活的叶片有15片，即63株苗中判断有15株为转基因苗；黄化死亡和仍然存活的叶片照片见图2，图中上层两片叶片为仍然存活即认为是转基因叶片，下层两片叶片已黄化达80%以上，即认为是非转基因叶片。20mg/L Kana的组织培养筛选获得的再生苗中转基因苗达23.8%，得到的转基因苗多，说明20mg/LKana的组织培养筛选对永安小叶品种的茎瘤芥子叶的选择压小，但是有利于转基因再生植株的生长，最终获得的转基因苗多，此浓度是适宜的。

表2叶片于检测液中各天的存活情况

时间	存活叶片数量
		1	63
2	63
		3	60
4	48
		5	15
6	15

进一步，采用分子生物实验验证上述通过叶片筛选获得的再生苗是否为转基因苗以确定本发明方法的可行性和正确性，方法为：

随意从上述15株植株中选取5株植株，采用TaKaRa公司的植物DNA提取试剂盒（试剂盒编号：D9194）提取其嫩叶的基因组DNA，再根据pCAMBIA2300质粒上外源基因插入位点的前后序列设计特异引物2300F和2300R进行PCR，其中2300F序列为5’-CCTTCCTCTATATAAGGAAGT-3’，2300R序列为5’-GCAAATATCATGCGATCATAGG-3’；以基因组DNA为模板、2300F和2300R引物做PCR扩增，PCR条件为：94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃1min（32个循环），72℃10min；PCR结果如图3所示，图中1-5为随意选取的5株植株，M为MarkerIII，可见在650bp左右均有特异目的条带，阳性比例达100%，说明本发明叶片筛选转基因植株可以获得可靠信息，可以大大缩小分子生物学实验进一步验证筛选的范围，节约了实验成本和时间。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法，其特征在于，切取茎瘤芥的叶面积为2-4cm²的新生叶片，放入含1mg/L6-苄氨基腺嘌呤和120mg/L卡那霉素的水溶液的检测液中5-6天，观察所述叶片是否黄化死亡，若是则判断为非转基因植株，若否则判断为转基因植株。

2.如权利要求1所述的卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法，其特征在于，所述黄化死亡指所述新生叶片的黄化面积比例为80-100%。

3.如权利要求1所述的卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法，其特征在于，所述新生叶片的叶面积为3cm²。

4.如权利要求1所述的卡那霉素抗性标记的转基因茎瘤芥筛选方法，其特征在于，将所述新生叶片放入含1mg/L6-苄氨基腺嘌呤和120mg/L卡那霉素的水溶液的检测液中5天。