CN104450775B - 抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用。本发明提供了一种培育转基因大豆的方法，为将外源DNA片段插入目的大豆基因组第17号染色体的第7,980,527‑7,980,541位间，得到转基因大豆。本发明的转基因大豆对高剂量的草甘膦具有耐受性，可进一步通过与优良大豆株系杂交来改良以优化其他农艺性状如产量、品质等。本发明的检测方法可以鉴定插入的T‑DNA和植物基因组DNA的结合区域并进一步鉴定转基因大豆及其后代的细胞、组织、器官、制品等。

Description

抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术或育种领域，具体地，本发明涉及转基因大豆及其应用，更具体地，本发明涉及抗草甘膦转基因大豆及其制备方法与应用。

背景技术

大豆(Glycine max(L.).Merr)起源于中国，是重要的油料作物和经济作物，也是食用植物油与植物蛋白质的主要来源。杂草是农业生态系统中的重要组成部分，杂草与作物竞争光、水、养分等资源，使作物减产。因此，大豆田间杂草的有效防除是大豆稳产高产的关键因素之一。传统的人工除草包括手工拔草和使用简单农具除草等，耗时耗力，功效低且不能大面积及时防除。除草剂的使用大大提高了农田杂草的防治效率，传统除草剂氯嘧磺隆、甲磺隆等在土壤中残留严重、污染环境，使用范围较小。

草甘膦(Glyphosate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂，具有杀草谱广、高效、低毒、无残留等优点，尤其对人畜毒害小，是全球应用范围最广的除草剂之一，其作用机制是通过不可逆地与植物体内EPSPS合酶(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶)结合催化植物和微生物体内莽草酸的代谢途径，扰乱莽草酸合成途径导致代谢过程紊乱，干扰蛋白质合成，阻止次生产物的形成，最终使植株死亡；另一个重要的作用机理是抑制植物的光合磷酸化。但草甘膦在杀灭杂草的同时也伤害大豆，培育抗草甘膦转基因作物是保护作物不受草甘膦伤害，提高杂草综合防治效率的重要途径之一。已有的研究和转基因作物商业化发展历史证明大豆对除草剂草甘膦的耐受性将是对于杂草防除、管理的有用性状。

为赋予农作物草甘膦的耐受性，研究者集中于向植物体内导入能增加草甘膦耐受性的基因，如EPSPS，EPSPS基因通常来自于微生物，具有草甘膦抗性，因而在存在草甘膦的情况下保持了他们的催化活性(PCT/CN03/00651)。当前全球商业化种植的草甘膦抗性转基因作物绝大多数为针对EPSPS所设计。

在植物组织中N-乙酰转移酶(GAT)能够通过N-乙酰化作用使得草甘膦被有效的降解，从而失去除草剂活性，且乙酰化的草甘膦不是EPSPS的有效作用底物，从而赋予植物对草甘膦的耐受性(ZL 2005 1 0086626.X)。利用N-乙酰化的手段培育转基因作物可以使得草甘膦在植物整个生长周期都可以应用，不受生长发育阶段的限制。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种培育转基因大豆的方法。

本发明提供的方法，为将外源DNA片段插入目的大豆基因组第17号染色体的第7,980,527-7,980,541位间，替换掉第17号染色体的第7,980,527-7,980,541位间13bp的碱基序列，得到转基因大豆；

所述转基因大豆的草甘膦抗性高于所述目的大豆；

所述外源DNA片段为含有5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因和N-乙酰转移酶基因的DNA分子。

上述方法中，所述5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因为G2-aroA；

所述N-乙酰转移酶基因为GAT；

所述外源DNA片段为序列表中序列10或序列1自5’末端第6189-10927位核苷酸。上述方法中，所述外源DNA片段在所述转基因大豆的上游侧翼片段为所述目的大豆基因组第17号染色体的自第7,980,527位核苷酸起向其上游方向延伸得到的长度为0至5Kb的任意一个DNA片段；

所述上游侧翼片段具体为序列表中序列8所示的核苷酸；

所述外源DNA片段在所述转基因大豆的下游侧翼片段为所述目的大豆基因组第17号染色体的自第7,980,541位核苷酸起向其下游方向延伸得到的长度为0至5Kb的任意一个DNA片段；

所述下游侧翼片段具体为序列表中序列9所示的核苷酸。所述上游侧翼片段为所述转基因大豆基因组中紧邻所述外源DNA片段5’末端的片段；

所述下游侧翼片段为所述转基因大豆基因组中紧邻所述外源DNA片段3’末端的片段；

上述方法中，所述外源DNA片段通过含有所述外源DNA片段的重组载体导入所述目的大豆；

所述重组载体的核苷酸序列具体为序列表中序列1。

上述方法中，所述目的大豆为中黄10号。

本发明另一个目的是提供用于检测植物样品是否来源于上述方法制备的转基因大豆或其后代的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测所述植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，所述DNA片段A由权利要求3中的所述外源DNA片段在所述转基因大豆的上游侧翼片段、权利要求3中的所述外源DNA片段和权利要求3中的所述外源DNA片段在所述转基因大豆的下游侧翼片段组成；

若含有所述DNA片段A，则所述植物样品为或候选为所述转基因大豆或其后代；

若不含有所述DNA片段A，则所述植物样品不为或候选不为所述转基因大豆或其后代。

上述方法中，

所述方法为如下1)或2)或3)：

1)直接测序植物样品的基因组DNA，判断所述测序植物样品含有所述DNA片段A；

2)用引物对1或引物对2进行PCR扩增，若有目的扩增产物，则所述测序植物样品含有所述DNA片段A；

所述引物对1为能够扩增由所述外源DNA片段5’端和紧邻其的所述上游侧翼序列部分或全部片段组成的DNA分子甲的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子甲；

所述引物对2为能够扩增含有所述外源DNA片段3’端和紧邻其的所述下游侧翼序列的部分或全部组成的DNA分子乙的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子乙；

3)用能特异结合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探针对所述待测植物样品DNA进行Southern杂交，若能杂交得到杂交片段，则所述植物样品来源于所述转基因大豆或其后代。

上述方法中，所述引物对1由序列表中序列10所示的单链DNA分子和序列表中序列11所示的单链DNA分子组成；

所述引物对1对应的目的特异片段大小为810bp，其核苷酸序列具体为序列15；

所述引物对2由序列表中序列12所示的单链DNA分子和序列表中序列13所示的单链DNA分子组成；

所述引物对2对应的目的特异片段大小为1627bp，其核苷酸序列具体为序列16；

3)中，所述探针的核苷酸序列为序列6。

本发明第三个目的是提供用于检测样品是否来源于所述转基因大豆或其后代的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括1)所述外源DNA片段、2)所述引物对1、3)所述引物对2或4)所述探针。

上述试剂盒还可以记载上述方法的说明书。

上述方法制备的转基因大豆在育种中的应用。

本发明的实验证明，本发明采用在大豆17号染色体的7980527至7980541位置间插入外源DNA片段，得到含有外源DNA片段的转基因大豆；外源DNA片段包括草甘膦抗性基因G2-aroA和草甘膦降解基因N-乙酰转移酶基因GAT基因；转基因大豆草甘膦抗性高于未转基因的野生型大豆。该转基因大豆对高剂量草甘膦有耐受性，其可进一步通过与优良大豆株系杂交来改良以优化其他农艺性状如产量、品质等。该转外源DNA片段大豆共表达抗草甘膦基因EPSPS(G2-aroA)和草甘膦降解基因N-乙酰转移酶基因(GAT)，在苗期(子叶出土且真叶未展开时期)单株对1-1.5ul的草甘膦异丙胺盐(Roundup)原液处理具有耐受性，田间对每公顷约3至12升的草甘膦异丙胺盐(Roundup)处理具有耐受性。获得良好杂草控制的总标准计量根据杂草压力在每公顷3-6升之间变动。本发明中的转基因大豆在这些浓度处理时甚至更高浓度(12升/公顷)处理时，除草剂处理对植物活力和叶持绿等性状不产生任何可测的影响。

附图说明

图1为转基因大豆T0代耐1.5L/公顷草甘膦喷施鉴定材料PCR分析

图2为转基因大豆ZH10-6外源T-DNA的拷贝数分析

图3为转基因大豆ZH10-6的T1植株的草甘膦抗性鉴定

图4为转基因大豆ZH10-6纯合抗性株系在12L/公顷草甘膦异丙胺盐处理下抗性

图5为转基因大豆ZH10-6纯合株系的PCR分子检测

图6为转基因大豆ZH10-6外源T-DNA插入位点及整合方式示意图

图7为转基因大豆ZH10-6验证引物所在位置示意图

图8为所述转基因大豆ZH10-6后代植株定性PCR扩增图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大豆品种为中黄10号(Zhonghuang10，其统编号：ZDD23873，记载在如下文献中：<<中国大豆品种志>>，邱丽娟、王曙明主编，中国农业出版社，2007，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，取中黄10号的子叶节作为转化材料；

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株为Ag10，记载在如下文献中：程伟.AtMGT4基因在水稻中异位表达的初步研究(D).湖南师范大学，2012；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

大豆组织培养基以MS和B5培养基为主,121℃灭菌15-20min。

萌发培养基：B5+20g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH5.8；

共培养基：1/10 B5+30g/L蔗糖+3.9g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)+1.67mg/L6-BA+39mg/L乙酰丁香酮+0.25mg/L赤霉素(GA3)+1mmol/L二硫苏糖醇+1mmol/L硫代硫酸钠+1mmol/L半胱氨酸+5g/L琼脂粉，pH5.4；

共培养液：1/10 B5+30g/L蔗糖+3.9g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)+1.67mg/L6-BA+39mg/L乙酰丁香酮+0.25mg/L赤霉素(GA3)；

丛生芽诱导培养基：B5+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.6g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)+1.67mg/L 6-BA+150mg/L噻孢霉素+400mg/L羧苄青霉素+15mg/L glyphosate，pH5.7；

芽伸长培养基：MS+B5有机+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.6g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)+50mg/L天冬氨酸+50mg/L谷氨酰胺+0.3mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)+0.5mg/L赤霉素(GA3)+150mg/L噻孢霉素+400mg/L羧苄青霉素+0.1mg/L玉米素(Ze)+5mg/L glyphosate，pH5.7；

生根培养基：MS+B5有机+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+0.6g/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)50mg/L天冬氨酸+50mg/L谷氨酰胺,pH5.7；

农杆菌培养用YEP和LB培养基。

乙酰丁香酮、MS和B5干粉培养基和乙酰丁香酮为sigma公司产品，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、噻孢霉素、羧苄青霉素、琼脂粉、玉米素、天冬氨酸、谷氨酰胺、赤霉素素(GA3)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)为Biodee公司产品，蔗糖为国产试剂。

以下实施例进一步描述了得到本发明和随后的结果时所用的材料和方法，它们通过举例说明提供，并且它们的叙述不应认为是要求权利和本发明的限制。

实施例1、转基因大豆的遗传转化

1、重组载体的获得

(1)根据A.thaliana-rbcS加G2-EPSPS基因优化后合成序列，重新设计PCR引物，上游带有酶切位点是XbaI，下游带有酶切位点SacI，PCR扩增rbcS-G2-EPSPS片段(序列1自5’末端第8204-9784位核苷酸)，连接到T-A载体上，获得质粒prbcS-G2-EPSPS，酶切及测序验证。

(2)pBI121(王华新，曹家树，向珣等.pBI121表达载体构建及其转化植株的快速鉴定.浙江大学学报(农业与生命科学版)，2008，34(2)：137-142；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得)和pCAMBIA2300(巩元勇,冯永坤,倪万潮等.植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GUS-CaMVterm的构建及验证.中国生物工程杂志，2013，33(3):86-91；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得)用HindⅢ/EcoRⅠ双酶切，将pBI121带有p35S-GUS-Nos的3.0kb片段连入pCAMBIA2300，形成中间载体p35S-2300-GUS；

(3)p35S-2300-GUS载体及prbcS-G2-EPSPS用XbaI/SacⅠ酶切后，9.8kb的p35S-2300-GUS载体骨架与1.5kb rbcS-G2-EPSPS片段连接，得到中间载体p35S-2300-rbcS-G2-EPSPS，该载体为将prbcS-G2-EPSPS中的rbcS-G2-EPSPS片段替换(2)得到的p35S-2301-GUS相应酶切位点中的GUS片段形成的。将p35S-2300-rbcS-G2-EPSPS用XhoI单酶切除掉植物筛选标记kan，收集10.4kb中间载体载体骨架。(4)根据优化后GAT基因合成序列，基因上下游带有单酶切位点XhoI，连接优化后GAT基因和上述(3)得到的中间载体载体骨架到重组载体pKT-rGE；，其全序列为序列1。

序列表中序列1中，自5’末端第9789-10360位核苷酸为导肽Rbcs和草甘膦抗性基因Rbcs-EPSPS(G2-aroA)的启动子增强型35S、5’末端第8255-9784位核苷酸为导肽Rbcs和草甘膦抗性基因Rbcs-EPSPS(G2-aroA)、5’末端第7926-8196位核苷酸为草甘膦抗性基因EPSPS(G2-aroA)终止子NOS、5’末端第6903-7673位核苷酸为草甘膦降解基因N-乙酰转移酶基因增强型35S、5’末端第6456-6896位核苷酸为草甘膦降解基因N-乙酰转移酶基因GAT、5’末端第6248-6455位核苷酸为草甘膦降解基因N-乙酰转移酶基因终止子CaMV 35S polyA。

2、转基因大豆的获得

1)、重组根瘤农杆菌的获得

将上述1获得的重组载体pKT-rGE导入根癌农杆菌Ag10中，得到重组农杆菌Ag10/pKT-rGE。

2)再生大豆植株的获得

重组农杆菌Ag10/pKT-rGE转化离体培养的大豆(Glycine max)中黄10号的子叶节外植体，农杆菌与外植体共侵染后共培养3天，在含有草甘膦的筛选环境下经器官再生途径诱导转基因植株，丛生芽诱导阶段，使用15mg/L浓度的草甘膦(Sigma公司)作为筛选剂，诱导3-6周；伸长芽诱导阶段，使用5mg/L浓度的草甘膦(sigma公司)作为筛选剂，诱导4-8周；诱导和伸长阶段，每2周更换一次培养基，使转化细胞再生，为抑制根癌农杆菌的快速生长，在诱导和伸长培养基中分别添加150mg/L浓度的噻孢霉素和400mg/L浓度的羧苄青霉素，待伸长芽伸长至4-6cm时，转入生根培养基中诱导生根，获得再生大豆植株。

3)转基因大豆的鉴定

(1)草甘膦筛选

将再生植株移栽至土壤中温室或培养箱继续培养，光照条件是16h光照和8h黑暗，在第一至第三复叶期，用草甘膦异丙胺盐(Roundup)喷施处理来自独立转化体，使用刻度喷雾器，以每公顷1.5L的草甘膦异丙胺盐(Roundup)剂量施用除草剂水溶液。草甘膦施用2周后，调查每个植株对草甘膦处理的反应，其中5个转化子对1.5L/公顷的草甘膦异丙胺盐(Roundup)喷施处理表现出较强的耐受性(给予编号为ZH10-1，2，3，5，6)，其中编号ZH10-6耐受性最高，较对照植株(中黄10号)生长旺盛，生长活力不受影响，叶片未发现变黄褪绿的症状，编号为ZH10-1，2，3，5，6的再生植株为T0代转基因大豆，T0代转基因大豆的草甘膦抗性高于野生型大豆中黄10号。

(2)PCR筛选

聚合酶链式反应(PCR)用于鉴定EPSPS(G2-aroA)和GAT基因的存在，从编号ZH10-1，2，3，5，6的T0代转基因大豆植株上收集20-50mg新鲜幼嫩的叶子置于2mL离心管中用于提取植物基因组DNA，DNA提取方法参照Murray and Thompson(1980)介绍的方法。用Takara公司生产的EX-Taq PCR试剂盒，参照说明书进行PCR反应，20μl PCR反应体系含10×EX-Taqbuffer 2μl,2mM dNTPs 2μl,10μM的基因特异性上下游引物各0.5μl，EX-Taq酶0.2μl，补水至20μl；PCR反应程序为94℃,4min(1循环)；94℃,30s(变性),60℃,30s(退火),72℃,45s(延伸)35循环；72℃(终延伸)10min(1循环)。

扩增EPSPS(G2-aroA)的引物对：

5’-ACCAGGAGCCTTGTACCTTGAG-3’(序列2)和5’-ATCGGGTTCGATCAGGTAATC-3’(序列3)

扩增GAT基因的引物对：

5’-CTCAGACCAAACCAGCCGATAG-3’(序列4)和5’-GTGTCGAATACCTCTCCCTGCTC3’(序列5)

PCR鉴定结果如图1所示，M为100bp DNA Marker；1为野生型中黄10号阴性对照；2为无菌水对照；3为质粒pKT-rGE阳性对照；4、5、6、7、8分别为转基因大豆ZH10-1，2，3，5，6；结果表明，编号为ZH10-1，2，3，5，6的转基因大豆均呈PCR阳性，编号为ZH10-1，2，3，5，6的转基因大豆均转入了外源基因EPSPS和GAT。

用传统的栽培和育种办法繁殖具有草甘膦抗性的转基因大豆，收获该转基因大豆种子。

实施例2、转基因大豆的草甘膦抗性分析

对实施例1中所得到的T0代转基因大豆ZH10-6进行连续多代的草甘膦抗性分析发现，其比非转基因对照中黄10号对草甘膦具有显著的抗性，具体如下：

收集T0代转基因大豆ZH10-6种子，播种，得到T1代转基因大豆ZH10-6，其在苗期(子叶出土真叶未完全展开时期)每株涂抹1μl草甘膦异丙胺盐(Roundup)，2周后调查药害。

不抗植株表型为叶片失水褪绿，叶卷曲、皱缩，顶端分生组织坏死，直至整株死亡；抗性植株表型为生长趋势旺盛、叶片不褪绿、不卷曲、不皱缩。

结果如图3所示，1：不抗T1代转基因大豆ZH10-6；2：未处理T1代转基因大豆ZH10-6：3、4：抗性T1代转基因大豆ZH10-6，表明，T1代转基因大豆ZH10-6在苗期对1μl草甘膦异丙胺盐(Roundup)/株处理的耐药性存在分离，处理3株，具有抗性植株2株，不抗植株1株；与未处理的T1代转基因大豆ZH10-6相比，抗性T1代转基因大豆ZH10-6植株株高、生长趋势不受抑制，叶片不褪绿。

利用传统的育种方法，收集抗性T1代转基因大豆ZH10-6的种子，播种，得到T2代转基因大豆ZH10-6。

将T2代转基因大豆ZH10-6不同株系分别进行3L/公顷和6L/公顷的草甘膦异丙胺盐(Roundup)喷施鉴定，从中选择出2个抗性不分离T2代转基因大豆ZH10-6为T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系；

对2个T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系、转CP4-EPSPS耐草甘膦转基因材料Ag4501，(王秀荣、廖红、何勇等.不同大豆种质材料蛋白质和脂肪含量分析.华南农业大学学报，2006，27(3)：9-11)和野生型对照中黄10号进行12升/公顷草甘膦异丙胺盐(Roundup)喷施处理。

结果如图4所示，1：纯合株系未处理；2：纯合株系喷施12L/公顷草甘膦异丙胺盐(Roundup)；3：转CP4-EPSPS抗草甘膦转基因材料Ag4501喷施12L/公顷草甘膦异丙胺盐(Roundup)；4：转CP4-EPSPS抗草甘膦转基因材料Ag4501未处理；5：纯合株系喷施12L/公顷草甘膦异丙胺盐(Roundup)新叶不变黄不褪绿；6、转CP4-EPSPS抗草甘膦转基因材料Ag4501喷施12L/公顷草甘膦异丙胺盐(Roundup)新叶变黄褪绿；表明，较未喷施对照，上述2个纯合株系无植株枯死死亡，上述2个纯合株系生长不受抑制，叶片不褪绿、不皱缩。且在高浓度12升/公顷草甘膦异丙胺盐(Roundup)喷施处理条件下，上述2个纯合转基因株系较转CP4-EPSPS耐草甘膦转基因材料对照，新叶未发现黄化的现象。

在上述喷施剂量下，中黄10号不具备任何抗性，2周后植株全部枯死，死亡；

上述T2代转基因大豆ZH10-6纯合2个株系具有更好的育种前景和利用价值。

抗草甘膦转基因大豆ZH10-6获得纯合株系，抗性能在后代中稳定遗传。

实施例3、转基因大豆中外源DNA拷贝数及分子整合稳定性分析

1、整合的外源T-DNA的拷贝数

通过对在所用转化载体的左和右边界序列之外延伸的限制性片段的Southernblotting分析测定T1代转基因大豆ZH10-6的基因组内整合的外源DNA片段的拷贝数。

Southern blotting分析的探针为，从载体T-DNA区域选择338bp的载体DNA序列设计探针(序列6)，参照北京美莱博医学科技有限公司生产的PCR法DIG标记试剂盒使用说明书，制备地高辛标记的探针。

参照北京美莱博医学科技有限公司生产的地高辛杂交试剂盒使用说明书，所用重组质粒pKT-rGE为阳性对照，中黄10号的基因组DNA为阴性对照。

提取转基因大豆ZH10-6的基因组DNA，用5个单位的限制性内切酶在200μl的总体积中于37℃中消化50-70μg基因组DNA 5-10h，使消化的DNA沉淀并重新溶解于25μl的无菌水中，每样品加6μl 6×Loading Buffer，消化的DNA、阳性对照、阴性对照、标准的分子大小标记(DNA molecular weight marker III,Digoxigenin-labeled(Roche)和λHind IIImarker)，45V电压下在0.8-1.0％的琼脂糖凝胶电泳上分离DNA。用溴化乙锭观察DNA，并包括荧光标尺进行摄像记录。然后再参照Whatman Schleicher&Schuell公司的RapidDownward transfer system的使用说明书，将DNA转移至Hybond尼龙膜上，所述与探针杂交，用化学显示法显示杂交结果(北京美莱博医学科技有限公司)。

拷贝数测定可以通过对临近左右边界区域的基因组DNA的分析进行，用限制性内切酶DraI、HindIII、XbaI消化基因组DNA。

不同酶切后的Southern blotting杂交结果如图2所示，1:DIG Marker、2:质粒pKT-rGE阳性对照、3：ZH10-6-HindIII、4:ZH10-6-XbaI、5:ZH10-6-DraI、6:中黄10号阴性对照；结果表明，整合的外源DNA为单拷贝插入。

2、纯合抗性株系的PCR分析

提取实施例2中所得到的T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系的基因组DNA，在20ul的PCR反应体系中，约50ng的基因组DNA用作模板DNA，且使用实施例1中扩增EPSPS(G2-aroA)引物对和扩增GAT基因引物对分别进行PCR扩增。

结果如图5所示，1-19：纯合株系不同单株；20：质粒pKT-rGE为阳性对照；21、22：无菌水对照；23、24：野生型中黄10号阴性对照；M：100bp DNA marker，表明，纯合株系的所有单株均呈PCR阳性。草甘膦抗性与PCR阳性能完全对应。

实施例4、转基因大豆中外源DNA分子插入位置确定

用改良的CTAB法提取T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系基因组DNA，以已经公布的大豆基因组(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Gmax；2010)为参照，对上述最耐草甘膦转基因材料进行测序分析，通过比对分析，发现在T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系中，T-DNA插入到大豆17号染色体物理位置为7,980,527-7,980,541位，未插入已知大豆内源基因编码区。T-DNA整合替换了基因组上13bp碱基序列，被替换序列为5’CAAATGCAAAAAT 3’(序列7)，该被替换序列未破坏大豆内源基因编码区。

对外源T-DNA与插入位置的基因组DNA的结合区域进行PCR扩增来验证外源T-DNA插入位置，结果进一步证实了T-DNA插入位点的正确性，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系T-DNA插入结果如图6所示，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系中插入的外源T-DNA的5’端上游侧翼序列为序列8，外源T-DNA的3’端下游侧翼序列为序列9。

进一步的，通过测序分析，获得插入T2代转基因大豆ZH10-6的完整外源T-DNA序列为序列10，整合外源插入外源DNA分子为4739bp，该转基因大豆外源DNA分子整合不含载体骨架序列。

实施例5、检测转基因大豆的方法

根据实施例4中的外源DNA分子插入的位置及其上下游侧翼基因序列，开发特异性引物，建立T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系及其自交或杂交后代的定性PCR鉴定方法。

依据插入的外源T-DNA的5’端大豆基因组DNA上游侧翼序列(序列8)和插入的外源T-DNA(序列10)中GAT基因片段设计引物ZH10P-1和GAT-1(引物对1)；依据插入的外源T-DNA(序列10)中EPSPS基因片段和插入的外源T-DNA的3’端大豆基因组DNA上游侧翼序列(序列9)设计引物G2EP-2和ZH10P-2(引物对2)(图7)。

序列如下：

引物对1：

引物ZH10P-1：5'TAATAGTAGAATGGGACTGGTGGAT 3'(序列11)

引物GAT-1：5'GCGGACTTGCTTTGGTGTAAT 3'(序列12)。

引物对2：

引物G2EP-2：5'CCCGAATCATCAGGCAAACA 3'(序列13)

引物ZH10P-2：5'AACACATCATAGTATTCTAAAACGCTT 3'(序列14)。

大豆基因组DNA和PCR反应的提取参照实施例1中的方法，用上述引物对1进行PCR扩增，水和非转基因植株无扩增条带，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系叶片、种子、茎和花的基因组DNA扩增出目标条带，结果如图8A所示，M，DL 2K Plus DNA Marker；1，水；2，非转基因大豆中黄10；3，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系叶片；4，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系种子；5，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系花；6，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系茎，表明，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系叶片、种子和茎基因组DNA扩增均得到特异性的810bp目的片段，该目的片段具体的核苷酸序列如序列15所示。

大豆基因组DNA和PCR反应的提取参照实施例1中的方法，用上述引物对2进行PCR扩增，水和非转基因植株无扩增条带，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系叶片、种子、花和茎的基因组DNA扩增，结果如图8B所示，M，DL2K Plus DNA Marker；1，水；2，非转基因大豆中黄10；3，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系叶片；4，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系种子；5，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系花；6，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系茎，表明，T2代转基因大豆ZH10-6纯合株系叶片、种子和茎基因组DNA扩增均得到特异性1627bp目的片段，且该目的片段具体的核苷酸序列如序列16所示。

试验说明利用转基因大豆ZH10-6的侧翼序列进行PCR扩增，可以特异性的检测大豆转基因大豆ZH10-6的分子特征，用于鉴定上述转基因大豆及其后代、细胞、种子、营养器官等。

Claims (8)

1.一种培育转基因大豆的方法，为将外源DNA片段插入目的大豆基因组第17号染色体的第7,980,527-7,980,541位间，替换掉第17号染色体的第7,980,527-7,980,541位间13bp的碱基序列，得到转基因大豆；

所述转基因大豆的草甘膦抗性高于所述目的大豆；

所述外源DNA片段为含有5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因和N-乙酰转移酶基因的DNA分子；

所述5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因为G2-aroA；

所述N-乙酰转移酶基因为GAT；

所述外源DNA片段为序列表中序列10或序列1自5’末端第6189-10927位核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源DNA片段在所述转基因大豆的上游侧翼片段为所述目的大豆基因组第17号染色体的自第7,980,527位核苷酸起向其上游方向延伸得到的长度为0至5Kb的任意一个DNA片段；

所述外源DNA片段在所述转基因大豆的下游侧翼片段为所述目的大豆基因组第17号染色体的自第7,980,541位核苷酸起向其下游方向延伸得到的长度为0至5Kb的任意一个DNA片段。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：

所述上游侧翼片段为序列表中序列8所示的核苷酸；

所述下游侧翼片段为序列表中序列9所示的核苷酸。

4.根据权利要求1-3中任一所述方法，其特征在于：

所述外源DNA片段通过含有所述外源DNA片段的重组载体导入所述目的大豆；

所述重组载体的核苷酸序列具体为序列表中序列1；

所述目的大豆为中黄10号。

5.用于检测或辅助检测植物样品是否来源于权利要求1-4中任一所述方法制备的转基因大豆或其后代的方法，包括如下步骤：检测所述植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，所述DNA片段A由权利要求1中的所述外源DNA片段在所述转基因大豆的上游侧翼片段、权利要求1中的所述外源DNA片段和权利要求1中的所述外源DNA片段在所述转基因大豆的下游侧翼片段组成；

若含有所述DNA片段A，则所述植物样品为或候选为所述转基因大豆或其后代；

若不含有所述DNA片段A，则所述植物样品不为或候选不为所述转基因大豆或其后代。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述方法为如下1)或2)或3)：

1)直接测序植物样品的基因组DNA，判断所述植物样品含有所述DNA片段A；

2)用引物对1或引物对2进行PCR扩增，若有目的扩增产物，则所述植物样品含有所述DNA片段A；

所述引物对1为能够扩增由所述外源DNA片段5’端和紧邻其的所述上游侧翼序列部分或全部片段组成的DNA分子甲的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子甲；

所述引物对2为能够扩增含有所述外源DNA片段3’端和紧邻其的所述下游侧翼序列的部分或全部组成的DNA分子乙的引物对；其对应的目的扩增产物为所述DNA分子乙；

3)用能特异结合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探针对所述植物样品DNA进行Southern杂交，若能杂交得到杂交片段，则所述植物样品来源于所述转基因大豆或其后代。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

2)中，所述引物对1由序列表中序列10所示的单链DNA分子和序列表中序列11所示的单链DNA分子组成；

所述引物对2由序列表中序列12所示的单链DNA分子和序列表中序列13所示的单链DNA分子组成；

3)中，所述探针的核苷酸序列为序列6。

8.用于检测样品是否来源于权利要求1-4中任一所述方法制备的转基因大豆或其后代的试剂盒，其包括：1)权利要求5中所述外源DNA片段、2)权利要求6中所述引物对1、3)权利要求6中所述引物对2或4)权利要求6中所述探针；

所述试剂盒还具体记载权利要求5-7中任一所述方法的说明书。