CN111876522A - 一种定量检测转基因大豆zh10-6的特异性引物及方法 - Google Patents

一种定量检测转基因大豆zh10-6的特异性引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量检测转基因大豆ZH10‑6的特异性引物，它是采用一对特异性的引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，并在PCR反应体系中添加荧光标记的探针对PCR反应过程进行实时监测，在60℃左右对核酸进行扩增，通过稀释标准品制作标准曲线，利用内参校正转基因耐除草剂大豆ZH10‑6转化体序列的百分含量，对未知样品进行相对定量检测。其结果鉴定采用扩增曲线是否起峰及起峰的循环数判断扩增与否，利用标准品制作的标准曲线相对定量未知样品百分含量。本发明的检测方法具有高特异性、高灵敏度、快速、简便等优点，为转基因耐除草剂大豆ZH10‑6的定量检测提供了可行的方法。

Description

一种定量检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种转基因产品的检测方法，具体说是一种基于实时荧光PCR的定量检测转基因大豆ZH10-6的方法，通过标准品制作标准曲线，利用内源基因校正外源种属特异性基因对转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列进行定量检测的方法。
背景技术
根据农业生物技术应用国际服务组织ISAAA最新统计显示，2018年全球有26个国家种植了1.917亿hm2转基因作物，其中转基因大豆以9590万hm2种植面积居首，占全球转基因作物种植面积的50%；从单一作物的种植面积来看，2018年转基因大豆的应用率为78%；共有31个国家/地区批准了38个转基因大豆转化体，主要包括GTS 40-3-2、MON89788、A2704-12、MON88017等转化体。中国是巴西大豆的主要出口市场，在2018年，巴西80%的大豆出口到中国，出口总额预计达到830亿kg，创历史新高。而转基因大豆的研发在国内外均占据举足轻重的地位。
转基因耐草甘膦大豆ZH10-6是由中国农业科学院作物科学研究所研发的转G2-EPSPS基因和GAT基因耐除草剂大豆新品系。研发人采用农杆菌介导转化法，将整合有G2-EPSPS和GAT两个基因的独立表达载体DNA导入大豆受体中，通过多代筛选获得对草甘膦具有抗性的ZH10-6转化体，在中国具有重要产业化应用前景。
基于Taqman水解探针的实时荧光PCR方法，是指通过特异性的引物扩增目的基因序列，通过在体系中添加荧光标记的水解探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，从而实现对反应过程的实时监测。
相对于转基因成分定性PCR检测方法，实时荧光定量PCR检测方法不仅可以检测出产品含有的转基因成分，而且可以相对定量出所含转基因成分的含量，更加有利于转基因产品的管理。目前，多种转基因植物均有其实时荧光PCR检测方法，例如李葱葱等建立了转基因玉米Bt176的实时荧光定量检测方法；汪秀秀等建立了针对转基因棉花GHB119品系的特异性实时荧光PCR定量检测方法。
中国已经研制了ZH10-6大豆的定性PCR检测方法标准，但是其实时荧光定量PCR方法未见报道，建立本转基因耐除草剂大豆ZH10-6实时荧光定量PCR检测方法，以便对转基因大豆ZH10-6转化体进行定量研究。本研究以ZH10-6转化体特异性序列为靶标，依据相关技术要求，建立了基于Taqman水解探针的实时荧光定量PCR检测方法，将对该转化体的安全评价、行政监管和知识产权保护提供重要的技术支撑。
发明内容
本发明克服了普通PCR检测转基因大豆ZH10-6只能定性不能定量的技术缺陷，提供一种定量检测转基因大豆ZH10-6的方法。本发明的目的是解决定量检测转基因大豆ZH10-6方法空缺的问题，具有简单易行、灵敏度高、特异性强、稳定的优点。
本发明的技术内容如下：
（1）实时荧光定量PCR检测方法的特异性引物，其中，转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列：
正向引物序列：5’-CAAATCCTATGGGCATTCTTCC-3’, SEQ ID NO:1
反向引物序列：5’-CTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATC-3’， SEQ ID NO:2
探针序列：FAM-CACCTTCTGGCTCCTTCAAACACTG-BHQ1 SEQ ID NO:3
内源基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’， SEQ ID NO:4
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’， SEQ ID NO:5
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1，SEQ ID NO:6
（2）PCR反应体系：总体积20 μL，包括TaKaRa 2×Premix Ex Taq (probe qPCR) 10 μL，上下游引物(10 µmol/L)各1 μL，探针(10 µmol/L) 0.5 μL，DNA模板(25 ng/μL) 2 μL,用无菌水补充至20 μL。
（3）PCR反应程序：95℃预变性10 min, 1个循环; 95℃变性10 s, 60℃退火30 s,40个循环，在60℃收集荧光信号。
（4）构建转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列定量检测的标准参照物，提取转基因耐除草剂大豆ZH10-6的基因组DNA后，进行梯度稀释，分别得到100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.0064%、0.00128%等8个浓度的DNA，利用8个浓度梯度的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增，分别构建转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列和内源基因Lectin基因的标准曲线。
（5）设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值和靶标浓度，并记录。按照公式A=B/[B+(C-B)/D]×100%，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列百分含量。式中A为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列百分含量，B为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列的靶标浓度，C为Lectin内源基因的靶标浓度，D为转基因大豆ZH10-6成分中掺入非转基因大豆成分的校正系数，即为转基因大豆ZH10-6基因组大小/掺入非转基因大豆基因组大小。
本发明进一步公开了定量检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物在用于ZH10-6快速定量高效筛查方面的应用，实验结果显示该方法能特异、定量检测出转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体成分，线性度大于0.995，RSD为0.17%~2.07%，定量限达0.16%，检测限达到0.032%。该方法为转基因耐除草剂大豆ZH10-6的精准定量检测提供了一种新的技术手段，为农业转基因监管提供技术支撑。
本发明主要考察了定量检测转基因大豆ZH10-6引物对转化体的特异性，解决转基因耐除草剂大豆ZH10-6新品种的分种子特征方法建立，重点是解决筛选合适的特异性引物对转基因大豆ZH10-6进行定量检测的问题，发明的难点在于转基因耐除草剂大豆ZH10-6因为有相邻的2个插入位点，因此具备4个转化体特异性序列(分别为2个插入位点的5’端和3’端)，选择合适的边界设计特异性引物用于转基因大豆的定量检测，本发明的创新点在于建立了相对定量检测转基因大豆ZH10-6的方法，为基于转基因大豆ZH10-6转化体的定量检测提供了可靠的技术手段。
本发明试验效果如下：
（1）特异性测试
以转基因玉米混合样、转基因大豆混合样、转基因油菜混合样、转基因水稻混合样、转基因棉花混合样和非转基因大豆的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增。结果显示(图1)，只有以转基因耐除草剂大豆ZH10-6基因组DNA为模板时出现典型扩增曲线或生成阳性微滴，而以其他转基因作物和非转基因大豆基因组DNA为模板时，没有出现典型扩增曲线或阳性微滴，表明本检测方法的特异性良好。
（2）标准曲线绘制
将提取的转基因耐除草剂大豆基因组DNA (25 ng/μL)稀释至20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.0064%、0.00128%进行PCR扩增。利用8个浓度梯度的DNA (含100%)为模板进行实时荧光PCR扩增，构建转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列标准曲线，以实现对转基因耐除草剂大豆ZH10-6的相对定量分析。结果显示(图2；图3)，本方法在模板含量为0.006 4%~100%范围内线性度大于0.995，扩增效率为95.4%~96.2%，检出限LOD为0.032%，定量限LOQ为0.16%，适合应用于转基因耐除草剂大豆ZH10-6的进一步定量分析。
（3）计算试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列含量
将转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列的靶标浓度和内源基因Lectin的靶标浓度带入公式，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列百分含量。计算试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列百分含量的公式：
A=B/[B+(C-B)/D]×100%，
式中：
A—试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列的百分含量(%)；
B—转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列的靶标浓度；
C—Lectin内源基因的靶标浓度；
D—转基因耐除草剂大豆ZH10-6成分中掺入非转基因大豆成分的校正系数，即为转基因大豆ZH10-6基因组大小/非转基因大豆基因组大小。
试验结论
本研究建立了实时荧光PCR相对定量检测转基因大豆ZH10-6的方法。实时荧光PCR相对定量检测转基因大豆ZH10-6的方法以其转化体特异性序列为靶标，建立了基于Taqman水解探针的实时荧光定量PCR检测方法。该方法能特异、定量检测出转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体成分，线性度大于0.995，RSD为0.17%~2.07%，定量限达0.16%，检测限达到0.032%。该方法为转基因耐除草剂大豆ZH10-6的精准定量检测提供了一种新的技术手段，为农业转基因监管提供技术支撑。
附图说明
图1：实时荧光定量PCR特异性检测；如图标注1: 阳性对照; 2: 转基因耐除草剂大豆ZH10-6; 3: 转基因玉米混样, 转基因大豆混样, 转基因油菜混样, 转基因水稻混样,转基因棉花混样, 非转基因大豆样品；
图2：实时荧光定量PCR特异性序列扩增曲线；
图3：实时荧光定量PCR标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
（1）样品1：转基因耐除草剂大豆ZH10-6成分为5%的自制模拟混合样品，混合方式50g转基因耐除草剂大豆ZH10-6和950g非转基因大豆ZH10充分混匀。
（2）试剂：TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）预混液；上海生工合成的大豆内源Lectin基因和转化体特异性序列扩增引物。
转化体特异性序列引物：
正向引物序列：5’-CAAATCCTATGGGCATTCTTCC-3’
反向引物序列：5’-CTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATC-3’
探针序列：FAM-CACCTTCTGGCTCCTTCAAACACTG-BHQ1
内源基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；
（3）PCR反应体系：总体积20 μL，包括TaKaRa 2×Premix Ex Taq (probe qPCR) 10 μL，上下游引物(10 µmol/L)各1 μL，探针(10 µmol/L) 0.5 μL，DNA模板(25 ng/μL) 2 μL,用无菌水补充至20 μL。
（4）PCR反应程序：95℃预变性10 min, 1个循环; 95℃变性10 s, 60℃退火30 s,40个循环，在60℃收集荧光信号。
（5）构建标准曲线，将100%的转基因大豆ZH10-6基因组DNA稀释至20%、4%、0.8%、0.16%进行PCR扩增。利用5个浓度梯度的DNA(含100%)为模板进行实时荧光PCR扩增，构建转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列和内源Lectin基因的标准曲线。
（6）设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值和靶标浓度，并记录。将转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的靶标浓度和Lectin内源基因的靶标浓度带入公式，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的百分含量为4.60%，结果见表1。
计算试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列百分含量的公式：
A=B/[B+(C-B)/D]×100%，
式中：
A—试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列的百分含量(%)；
B—转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列的靶标浓度；
C—Lectin内源基因的靶标浓度；
D—转基因耐除草剂大豆ZH10-6成分中掺入非转基因大豆成分的校正系数，即为转基因大豆ZH10-6基因组大小/非转基因大豆基因组大小。
表1 盲样1测试结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例2
（1）样品2：转基因耐除草剂大豆ZH10-6成分为3%的自制模拟混合样品，混合方式30g转基因耐除草剂大豆ZH10-6和970g非转基因大豆ZH10充分混匀。
（2）试剂：TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）预混液；上海生工合成的大豆内源Lectin基因和转化体特异性序列扩增引物。
转化体特异性序列引物：
正向引物序列：5’-CAAATCCTATGGGCATTCTTCC-3’
反向引物序列：5’-CTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATC-3’
探针序列：FAM-CACCTTCTGGCTCCTTCAAACACTG-BHQ1
内源基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；
（3）PCR反应体系：总体积20 μL，包括TaKaRa 2×Premix Ex Taq (probe qPCR) 10 μL，上下游引物(10 µmol/L)各1 μL，探针(10 µmol/L) 0.5 μL，DNA模板(25 ng/μL) 2 μL,用无菌水补充至20 μL。
（4）PCR反应程序：95℃预变性10 min, 1个循环; 95℃变性10 s, 60℃退火30 s,40个循环，在60℃收集荧光信号。
（5）构建标准曲线，将100%的转基因大豆ZH10-6基因组DNA稀释至20%、4%、0.8%、0.16%进行PCR扩增。利用5个浓度梯度的DNA(含100%)为模板进行实时荧光PCR扩增，构建转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列和内源Lectin基因的标准曲线。
（6）设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值和靶标浓度，并记录。将转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的靶标浓度和Lectin内源基因的靶标浓度带入公式，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的百分含量为2.72%，结果见表2。
计算试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列百分含量的公式：
A=B/[B+(C-B)/D]×100%，
式中：
A—试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列的百分含量(%)；
B—转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列的靶标浓度；
C—Lectin内源基因的靶标浓度；
D—转基因耐除草剂大豆ZH10-6成分中掺入非转基因大豆成分的校正系数，即为转基因大豆ZH10-6基因组大小/非转基因大豆基因组大小。
表2 盲样2测试结果
Figure DEST_PATH_IMAGE002
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
序列表
<110> 天津市农业科学院
<120> 一种定量检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
caaatcctat gggcattctt cc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ctagagcagc ttgagcttgg atc 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
caccttctgg ctccttcaaa cactg 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gccctctact ccaccccca 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gcccatctgc aagccttttt 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
agcttcgccg cttccttcaa cttcac 26

Claims (3)

1.一种定量检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物，其特征在于包括ZH10-6的第二个5’端外源基因插入侧翼的序列如下：
正向引物序列：5’- CAAATCCTATGGGCATTCTTCC -3’
反向引物序列：5’- CTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATC-3’
探针序列：FAM-CACCTTCTGGCTCCTTCAAACACTG-BHQ1
内源基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1。
2.一种采用权利要求1所述的特异性引物进行快速定量检测方法，其特征在于如下步骤：
（1）实时荧光定量PCR检测方法的特异性引物，其特征在于
正向引物序列：5’-CAAATCCTATGGGCATTCTTCC-3’,
反向引物序列：5’- CTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATC-3’，
探针序列：FAM-CACCTTCTGGCTCCTTCAAACACTG-BHQ1；
内源基因Lectin基因序列：
正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’，
反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’，
探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；
（2）实时荧光定量PCR反应体系：总体积20 μL，包括TaKaRa 2×Premix Ex Taq (probeqPCR) 10 μL，上下游引物(10 µmol/L)各1 μL，探针(10 µmol/L) 0.5 μL，DNA模板(25 ng/μL) 2 μL, 用无菌水补充至20 μL；
（3）实时荧光定量PCR反应扩增程序：95℃预变性10 min, 1个循环；95℃变性10 s, 60℃退火30 s, 40个循环；
（4）构建转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列定量检测的标准参照物，提取转基因耐除草剂大豆ZH10-6的基因组DNA后，进行梯度稀释，分别得到100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.0064%、0.00128%8个浓度的DNA，利用8个浓度梯度的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增，分别构建转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列和内源基因Lectin基因的标准曲线；
（5）设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值和靶标浓度，并记录，按照公式A=B/[B+(C-B)/D]×100%，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列百分含量，式中A为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列百分含量，B为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列的靶标浓度，C为Lectin内源基因的靶标浓度，D为转基因大豆ZH10-6成分中掺入非转基因大豆成分的校正系数，即为转基因大豆ZH10-6基因组大小/掺入非转基因大豆基因组大小。
3.权利要求1所述定量检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物在用于ZH10-6快速定量高效筛查方面的应用。
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