CN114196783A - 一种特异性探针、引物、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real‑timePCR检测方法及其在定性或定量检测核酸样品中的应用。

Description

一种特异性探针、引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定核酸样品的探针、探针和引物组合、标准品、Real-time PCR检测试剂盒和检测方法。

背景技术

水稻转化体H23是一种抗虫耐草铵膦除草剂的水稻转基因材料，它对褐飞虱具有优异的抗性，对草铵膦具有良好的耐受性，利用该转化体能培育抗虫抗除草剂水稻品种。建立转化体特异性检测方法能为转基因生物的鉴定和监管提供有效的检测手段，为农业转基因生物安全管理提供技术支撑。

转化体特异性的检测主要利用普通PCR方法，但其缺点是灵敏度不高，且无法实时监控PCR过程，不能定量。随着分子生物学技术的发展，Real-time PCR(实时荧光定量PCR)已广泛应用于转基因检测，与常规PCR技术相比，其具有耗时短、操作简便、特异性好、灵敏度高的特点，过程可实时监控，结果可直接观察，可以进行定量检测。

Real-time PCR方法可分为染料法和探针法两种。染料法Real-time PCR中的荧光染料能与双链DNA结合发出荧光，其结合是非特异性的，体系中的引物二聚体、DNA模板等都会与其结合，所以染料法的特异性不高。而探针法中的探针能与模板特异性结合，其扩增曲线反映的就是特异性产物的积累，不会含有非特异扩增的成分，灵敏度比染料法高出10倍。另外，染料法只支持单通道反应，如果需要进行多通道试验，或是检测相同样本的不同靶标，最常用的还是探针法。

水稻转化体H23及其检测方法已公开，专利申请号为202011498142.7，公开的检测方法是普通PCR，其中所设计的检测引物之间的PCR产物长度过大(908bp和901bp)，不适合直接用于Real-time PCR方法检测，尤其是应用探针法的Real-time PCR检测。因此，需要进一步建立专门的Real-time PCR检测体系。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了用于检测核酸样品的探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real-time PCR检测方法。上述的核酸样品可以是水稻H23转化体的基因组DNA，也可以是H23转化体衍生品系的基因组DNA，或是含有H23转化体的混杂水稻材料的基因组DNA，或是从上述样品中通过PCR扩增等方法分离得到的包含H23身份信息的核酸样品。由于SEQ ID NO.1所示序列是确认H23转化体身份信息的特异性序列，因此只要含有SEQ IDNO.1所示序列核酸分子的样品均可以用本发明提供的方法进行定性和定量检测。

本发明通过设计高灵敏度、特异性的探针、上游引物和下游引物，可准确鉴定水稻H23转化体，能将其与不含H23的常规水稻和其他转基因水稻材料分开。该检测方法具有较高的特异性、灵敏性和操作便利性等优点，弥补了常规PCR方法流程繁琐、检测灵敏度低的缺点。

本发明提供了一种探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为5'-CTTCTTGAAGCTGCCCTGCCCGA-3'。

在一些实施方案中，所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。当探针处于游离状态时，荧光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，与模板紧密结合的探针5’端荧光基团会被Taq酶切开，从而远离3’端的淬灭基团，荧光基团发出的荧光能被仪器接收，产生的荧光信号与样本中扩增产物的量成正比。

在一些实施方案中，所述荧光基团包括FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX、CY5、TAMRA或Texas中的任一种；所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ-X、TAMRA、DABCYL或MGB中的任一种；

在一些实施方案中，所述荧光基团/淬灭基团的组合为FAM/BHQ1、FAM/BHQ2、CY3/BHQ-X、HEX/DABCYL、JOE/TAMRA或VIC/BHQ2中的任一种；

在随机选取的荧光基团和淬灭基团测试试验中，上述荧光基团和淬灭基团标记的探针均能够得到特异性的检测结果。同时，5’端标记FAM、3’端标记BHQ1的探针标记成本最低，可以作为最优选的探针标记方案。

本发明还提供了一种引物和探针组合，其特征在于：包括权利要求1所述的探针和两条引物，所述引物的核苷酸序列为5'-CCTGGCTTCATTTCATTAACTTTTG-3'和5'-CGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTG-3'；

上述的探针以及探针和引物组合是通过软件设计、试验筛选、人工重新组合和再次PCR试验验证挑选出来的，定位于H23转化体外源插入序列上游边界的基因组上。

本发明还提供了一种检测标准品，其特征在于：所述标准品为浓度不低于100拷贝/μL的一个或多个核酸样品；所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子；

在一些实施方案中，所述检测标准品为6个浓度分别为1.0×107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL的质粒样品；所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

在一些实施方案中，所述标准品的制备方法为：取21.46μL浓度为3.3ng/μL的含有SEQ ID NO.1所示的核酸分子的全长6455bp的质粒样品，加入78.54μL ddH2O后，分别稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍。

本发明还提供了一种检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括上述的探针和引物组合以及上述的标准品；

在一些实施方案中，所述检测试剂盒包括：

引物1，序列为5'-CCTGGCTTCATTTCATTAACTTTTG-3'；

引物2，序列为5'-CGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTG-3'；

探针，序列为5'-CTTCTTGAAGCTGCCCTGCCCGA-3'；

标准品，所述检测标准品为6个浓度分别为1.0×107拷贝/μL、1.0×106拷贝/μL、1.0×105拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、1.0×103拷贝/μL、1.0×102拷贝/μL的质粒样品；所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子；

其中，所述探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1。

本发明还提供了一种Real-time PCR检测方法，其特征在于：使用上述的检测试剂盒进行Real-time PCR检测，其中PCR反应体系中的引物1和引物2终浓度均为0.3μM，探针终浓度为0.15μM。

本发明还提供了上述的探针、探针和引物组合、检测标准品、检测试剂盒、检测方法在定性或定量检测核酸样品中的应用；其中，所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子。

本发明的有益效果是：经过软件设计、人工重新组合以及多次试验筛选，从300多组探针引物组合中获得了1条探针和2条引物的组合，在此基础上利用合适浓度梯度的标准品建立并优化了Real-time PCR检测方法，应用上述探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real-time PCR检测方法可以特异性地检测不低于100拷贝/μL的含有SEQ ID NO.1的核酸样品，并能有效地将H23材料与其他不含H23的水稻材料区分开，具有极高的灵敏度和特异性。

附图说明

通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1用普通PCR扩增反应检测15组引物后的电泳结果。M表示DNA Ladder Marker，A1-A15表示组合A1-A15中的引物对。可见，组合A4、A5、A11、A12、A14和A15的引物可获得清晰的符合预期大小的单一条带。

图2用SYBR Green染料法Real-time PCR反应检测组合A4、A5、A11、A12、A14和A15引物对的扩增结果。下图为扩增曲线，上图为熔解曲线。每一条曲线代表一个样本。可见，组合A15扩增失败，组合A14的Ct值＞35；组合A4、A5、A11、A12的扩增曲线正常，Ct值＜35，其中组合A4、A5的熔解曲线为单峰，而组合A11、A12熔解曲线形成了双峰。

图3用探针法Real-time PCR反应检测新组合B1、B2的引物和探针的扩增结果。可见，组合B1和B2都扩增成功，形成稳步上扬的扩增曲线，Ct值分别为29.11和35.26。

图4灵敏度试验曲线。其中，A：1.0×10⁶拷贝/μL；B：1.0×10⁵拷贝/μL；C：1.0×10⁴拷贝/μL；D：1.0×10³拷贝/μL；E：1.0×10²拷贝/μL；F：1.0×10拷贝/μL。

图5标准品扩增曲线。其中，A：1.0×10⁶拷贝/μL；B：1.0×10⁵拷贝/μL；C：1.0×10⁴拷贝/μL；D：1.0×10³拷贝/μL；E：1.0×10²拷贝/μL。

图6绘制标准曲线和线性方程。

图7特异性样品检测试验。其中，A：转化体H23；B：受体对照广占63-4S；C：转化体材料H21；D：空白对照。

图8不同荧光基团探针的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明，以下实例仅用于说明本发明但并不限定本发明的范畴。

所述“水稻”是指亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)，并且包括可以与水稻交配的所有植物品种，包括野生水稻种。

所述“包含”是指“包括但不限于”。

术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以天然生物体中发现的方式连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。

H23转化体是包括转基因水稻H23的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述H23的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自水稻植物H23的产物，例如稻米、稻草、稻壳、稻油、米饭、米粉、米糠、米皮和留在水稻作物田间的生物量。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因水稻H23基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因水稻H23或种子还是来源于转基因水稻H23以及其他衍生品系的植物或种子或提取物，还是从H23中分离得到的包含H23身份信息的核酸分子。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

实施例1水稻转化体H23的特异性引物和探针的设计和筛选

转化体的特异性检测方法需要在插入位点上游和下游的边界序列处设计引物和探针，PCR扩增产物需要包括外源序列和水稻基因组序列。因此，首先要根据水稻H23插入位点的边界序列设计引物和探针。

1、用软件设计引物和探针组合

将上游或下游边界序列的一部分(100-600bp)作为模板输入软件(如ABI PrimerExpress 3.0)中，该模板序列必须同时包含水稻基因组序列(长度至少50bp)和外源插入序列(长度至少50bp)，其中的2条模板SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3如下所示：

水稻转化体H23上游边界模板SEQ ID NO.2：

水稻转化体H23下游边界模板SEQ ID NO.3：

小写字母为外源序列，大写字母为基因组序列。

按以下要求设置软件中的相关参数后，共得到了超过300组的引物和探针组合。其中，每个组合中包含2条引物和1条探针。

探针和引物满足如下所有要求：

①引物的长度在18～25bp之间，探针的长度在18～30bp之间；

②引物的Tm值在58～60℃，探针的Tm值比引物高8-10℃；

③探针内部、引物内部或探针与引物之间避免产生3个碱基以上的互补序列；

④探针5’端第一个碱基不是G；

⑤正向引物和反向引物分别位于水稻基因组和载体插入序列。

⑥正向引物和反向引物之间的PCR产物长度介于80-300bp之间。

最后从中选取软件评分较高的15组引物和探针作为候选组合，以备进一步筛选。候选组合如表1所示。

表1软件设计评分较高的20组候选引物和探针

2、引物合成和筛选

合成表1所示的15组引物，并进行特异性引物筛选。筛选过程如下：

(1)用普通PCR扩增反应检测15个候选组合的引物F和引物R。电泳结果如图1和表2所示。结果表明，组合A2、A3、A6、A7和A8扩增失败，没有条带，而组合A1、A9、A10和A13扩增出来的条带大小不符合预期，为非特异性扩增；只有组合A4、A5、A11、A12、A14和A15的引物扩增获得了符合预期大小(100-250bp)的单一特异性条带，因此组合A4、A5、A11、A12、A14和A15的引物F和引物R为I类特异性引物。组合A1-A3、A6-A10和A13淘汰。

表2普通PCR筛选I类特异性引物

(2)用SYBR Green染料法Real-time PCR反应检测所有I类特异性引物，即组合A4、A5、A11、A12、A14和A15的引物F和引物R。Real-time PCR反应结果如图2和表3所示。结果表明：组合A15扩增失败，无稳步上扬的扩增曲线，无Ct值；组合A14的扩增曲线正常，但Ct值＞35；组合A4、A5、A11和A12的扩增曲线正常，且Ct值＜35，其中组合A4和A5的熔解曲线为单峰，而组合A11和A12熔解曲线形成了两个峰。因此，将组合A4和A5中的引物F和R归为II类特异性引物。组合A11、A12、A14和A15淘汰。

表3 SYBR Green染料法Real-time PCR筛选II类特异性引物

3、探针合成和筛选

合成组合A4和A5中的探针，5’端用荧光标记基团FAM修饰，3’端用荧光淬灭基团BHQ1修饰。

用探针法Real-time PCR反应检测组合A4和A5中的引物和探针，反应结果如表4所示。结果表明：组合A5扩增失败，无稳步上扬的扩增曲线，无Ct值；组合A4虽然扩增成功，但Ct值为35.78。由于组合A5无Ct值，组合A4的Ct>35，因此，淘汰组合A4和A5。

表4探针法Real-time PCR筛选特异性引物、探针组合

经过筛选，在上游和下游边界都没有找到合适的引物和探针组合。

4、重新组合引物和探针

将组合A4、A5中的引物和探针进行重新组合，即组合A4的引物搭配A5的探针成为新的组合B1，而组合A5的引物搭配A4的探针成为新的组合B2(表5)。

表5重新组合的引物和探针

5、新组合的筛选

用探针法Real-time PCR反应检测组合B1、B2中的引物和探针。Real-time PCR反应结果如图3和表6所示。

结果表明：组合B1和B2都扩增成功，形成稳步上扬的扩增曲线，Ct值分别为29.11和35.26。组合B1的Ct值＜35，所以将组合B1,确定为检测水稻转化体H23材料的探针和引物组合。

表6探针法Real-time PCR筛选新组合

组合B1的探针和引物位于外源插入序列上游边界，具体序列和位置如下所示：

小写字母为载体序列，大写字母为基因组序列，阴影部分表示引物所在位置，方框部分表示探针所在位置。

引物和探针序列

引物F：5'-CCTGGCTTCATTTCATTAACTTTTG-3'

引物R：5'-CGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTG-3'

探针P：FAM-CTTCTTGAAGCTGCCCTGCCCGA-BHQ1

实施例2制备标准品

利用Real-time PCR对样品的初始模板量进行定量分析，需要利用已知拷贝数的标准品作出标准曲线，再通过PCR获得待测样品的Ct值，最后从标准曲线上计算出该样品的拷贝数。因此，首先要制备适宜的标准品，其制备方法如下：

1、将实施例1中的上游边界序列片段(SEQ ID NO.2)在华大基因公司合成标准阳性质粒，制备标准品；

2、用紫外分光光度计测量质粒DNA的吸光度A₂₆₀和A₂₈₀，分别计算质粒的浓度和纯度；

3、进行Real-time PCR时，标准品模板浓度需要以“拷贝/μL”为单位。

计算公式：模板拷贝数/μL＝阿伏伽德罗常数×模板摩尔数，其中阿伏伽德罗常数＝6.02×10²³拷贝/mol，模板分子量＝模板DNA长度(碱基数量)×660(碱基的平均分子量)。

4、测得质粒浓度为3.3ng/μL，根据上述公式，质粒拷贝数/μL＝6.02×10²³拷贝/mol×(3.3×10^-9g/μL)/(6455×660g/mol)，即为4.66×10⁸拷贝/μL。

5、取21.46μL上述质粒溶液，加入ddH₂O 78.54μL，得到浓度为1.0×10⁸拷贝/μL的标准品，再进行10倍比梯度稀释，分别得到浓度为1.0×10⁷～1.0×10拷贝/μL的标准品。置于-20℃保存备用。

实施例3探针法Real-time PCR反应体系的建立和优化

本发明通过实施例1的操作获得了可用的探针和引物，通过实施例2得到了系列浓度梯度的标准品，然而具体的Real-time PCR反应体系能否有更好的效果还受到引物和探针浓度等因素的影响，因此要想获得高效准确的定量结果，还需要进一步对PCR反应体系进行优化。

一、建立初步的Real-time PCR反应体系

通过对实施例1筛选的引物和探针组合B1进行稀释，加入去离子水将其浓度稀释为10μM的工作液，进行探针法Real-time PCR扩增，建立反应体系。

PCR反应体系为：2×qPCR Mix 10μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至总体积为20μL。阳性对照(浓度为1.0×10⁵拷贝/μL的质粒DNA)作为模板，ddH₂O为空白对照。

Real-time PCR反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃20s，72℃40s(收集荧光信号)，共进行40-45个循环。

二、优化Real-time PCR反应体系

引物终浓度设置为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5μM 5个浓度梯度，对应的探针浓度为引物浓度的1/2倍。各处理的Real-time PCR试验结果如表7所示。

表7不同引物和探针浓度的测试

结果表明：引物浓度0.3μM、探针浓度0.15μM的PCR反应体系的Ct值最小，荧光信号值最高。因此，确定后续试验引物终浓度为0.3μM，探针浓度为0.15μM。

优化后的反应体系为：

2×qPCR Mix 10μL，10μM上游引物0.6μL，10μM下游引物0.6μL，10μM探针0.3μL，模板DNA1μL，ddH₂O补足至总体积为20μL。阳性对照(浓度为1.0×10⁷拷贝/μL的质粒DNA)作为模板，ddH₂O为空白对照。

实施例4 Real-time PCR体系检测水稻H23的灵敏度试验

灵敏度是指PCR扩增反应能检出样品的最低拷贝数，即最低检测限。用Real-timePCR检测不同浓度的标准品时，当某个浓度的标准品能形成扩增曲线但Ct值>35时，则认为该浓度标准品超出了PCR体系的最低检测限。

使用实施例1中所述的探针、引物组合B1、实施例3所优化的反应体系，以及以实施例2的标准品(浓度1.0×10⁶～1.0×10拷贝/μL)为模板(每个浓度3次平行试验)，ddH₂O为空白对照，进行Real-time PCR扩增，以确定本发明检测方法的最低检出限。根据仪器检测的荧光信号获得扩增曲线，结果见图4和表8。结果显示，当标准品浓度＜100拷贝/μL时，扩增曲线Ct＞35。因此，Real-time PCR的检出下限为100拷贝/μL。

上述灵敏度检测结果表明，当样品未出现典型扩增曲线或Ct值大于35，即样品中的转化体浓度低于100拷贝/μL，则认为样品中未检出H23转化体，检测结果为阴性。

表8灵敏度试验结果

实施例5绘制标准曲线

以梯度浓度的多个标准品作为模板进行Real-time PCR并记录Ct值，根据初始模板量(拷贝数的对数)及Ct值绘制标准曲线，得到标准方程。当需要对待测样品初始模板进行定量时，只需要得到扩增曲线，读得Ct值，带入标准方程即可算出待测样品的初始模板量。

以实施例2的标准品(浓度1.0×10⁶～1.0×10²拷贝/μL)为模板(每个浓度3次平行试验)，ddH₂O为空白对照，使用实施例1探针、引物组合B1，采用实施例2中的反应体系，进行Real-time PCR扩增，扩增曲线见图5。

以标准品浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，见图6。本发明标准曲线方程为y＝-2.267x+35.696(y表示Ct值，x为拷贝数的对数)，标准曲线呈良好的线性关系，R²＝0.9988，相关系数高，满足Real-time PCR定量检测的要求。

实施例6检测水稻转化体H23的Real-time PCR试剂盒

按照下列组成配制用于检测水稻H23的试剂盒：2×qPCR Mix，10μM上游引物、10μM下游引物、10μM探针、实施例2的标准品(浓度1.0×10⁶～1.0×10²拷贝/μL)和ddH₂O。

引物、探针为实施例1中所述组合B1。

该试剂盒的反应体系可以为：2×qPCR Mix 10μL，10μM上游引物0.6μL，10μM下游引物0.6μL，10μM探针0.3μL，模板DNA 1μL，ddH₂O 7.5μL，反应总体积为20μL。

该试剂盒进行Real-time PCR的反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃20s，72℃40s(收集荧光信号)，共进行40-45个循环。

应用该试剂盒对样品进行检测时，通过仪器所检测到的荧光信号获得扩增曲线，根据标准品建立的标准方程和待测样品的Ct值计算样品拷贝数。

实施例7特异性试验和样品检测

用实施例2的DNA提取方法(CTAB法)提取水稻转化体H23、受体对照广占63-4S、其他转化体材料H21的基因组DNA

以上述的水稻转化体H23、受体对照广占63-4S和H21的基因组DNA为模板，ddH₂O为空白对照，使用实施例6中所述的试剂盒，采用实施例3的反应体系进行Real-time PCR扩增，以进行特异性试验检测。根据仪器所检测到的荧光信号获得扩增曲线，如图7所示。

根据扩增曲线中各个样品的Ct值计算其拷贝数，结果如表9所示：水稻转化体H23的扩增曲线Ct值为27.93，拷贝数为2665，检测结果为阳性；受体广占63-4S和其他转化体材料H21的扩增曲线Ct值均大于35，拷贝数均低于最低检测限100，因此，检测结果均为阴性。由此可见，本发明建立的检测体系具有很好的特异性。

表9受试样品特异性试验检测结果

实施例8不同荧光基团的测试

使用实施例1筛选的引物和探针组合B1，探针两端分别标记常用的不同种类的荧光基团和淬灭基团，如表6所示。使用实施例6中所述的试剂盒、采用实施例3的反应体系，以实施例2的标准品(浓度为1.0×10⁵的质粒DNA)为模板，进行Real-time PCR检测，以确定较合适的荧光标记基团。

根据仪器检测的荧光信号获得扩增曲线，如图8所示。结果如表10所示，编号A、B、C、D、E和F的荧光标记组合均能成功扩增，扩增曲线的平均Ct值介于27.5-31.5之间。但是，从扩增曲线的y轴高度来看，组合A、B和C的荧光收集效率较高。同时，在所有受试组合中，组合A的探针标记成本最低，所以将组合A(5’端标记FAM、3’端标记BHQ1)确定为优选探针标记方案。

表10探针两端标记不同荧光基团的测试

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 武汉莱肯博奥科技有限公司

<120> 一种特异性探针、引物、试剂盒和方法

<130> 1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 191

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 1

cctggcttca tttcattaac ttttgccttc ttgaagctgc cctgcccgac agaagatggc 60

aatgagccag cacacggtgt ctctttcaca gtctttctac tttggttttc cacaggcttt 120

cttgaacggt ggcggtttct gttgatgtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca 180

cattgcggac g 191

<210> 2

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 2

tactgtgatt cagtctgtag cactaaaata cttgcacgtt gagaatatta aaccaagttt 60

aaggatgtat taacctgttc aaactatctg tccaatagct gatactgcct ggcttcattt 120

cattaacttt tgccttcttg aagctgccct gcccgacaga agatggcaat gagccagcac 180

acggtgtctc tttcacagtc tttctacttt ggttttccac aggctttctt gaacggtggc 240

ggtttctgtt gatgtaaaca aattgacgct tagacaactt aataacacat tgcggacgtt 300

tttaatgtta gactgaatta acgccgaatt aattcggggg atctggattt tagtactgga 360

ttttggtttt aggaattaga aattttattg atagaagtat tttacaaata caaatacata 420

ctaagggttt cttatatgct caacacatga gcgaaaccct ataggaaccc taattccctt 480

atctgggaac tactcacaca ttattatgga gaaactcgag tcaaatctcg gtgacgggca 540

ggaccggacg gggcggta 558

<210> 3

<211> 497

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 3

tcgagtttct ccataataat gtgtgagtag ttcccagata agggaattag ggttcctata 60

gggtttcgct catgtgttga gcatataaga aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa 120

tacttctatc aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat ccagtactaa aatccagatc 180

ccccgaatta attcggcgtt aattcagtct aacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta 240

agttgtctaa gcctcaagct gctctaacaa cttgtggtcg gccatggcct cctttgaaca 300

ccgccatttc ttgccatctg ttcgacggca tcttccaggt tctgggtcag agtctgcatt 360

tgggaagcct tgatagagag gcctccagct cactgcagta caataagtat gtcatgtttc 420

catttgattt acatatcacg ttgccttttg tcataataaa cctgaactgg tgagaactga 480

gaacgtaaca ttgatac 497

Claims (6)

1.探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为5'-CTTCTTGAAGCTGCCCTGCCCGA-3'；

任选地，所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；

任选地，所述荧光基团包括FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX、CY5、TAMRA或Texas中的任一种；所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ-X、TAMRA、DABCYL或MGB中的任一种；

任选地，所述荧光基团和淬灭基团的组合为FAM/BHQ1、FAM/BHQ2、CY3/BHQ-X、HEX/DABCYL、JOE/TAMRA或VIC/BHQ2中的任一种；

任选地，所述荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ1。

2.引物和探针组合，其特征在于：包括权利要求1所述的探针和两条引物，所述引物的核苷酸序列为5'-CCTGGCTTCATTTCATTAACTTTTG-3'和5'-CGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTG-3'。

3.检测标准品，其特征在于：所述标准品为浓度不低于100拷贝/μL的一个或多个核酸样品；所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子；

任选地，所述检测标准品为6个浓度分别为1.0×107拷贝/μL、1.0×106拷贝/μL、1.0×105拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、1.0×103拷贝/μL、1.0×102拷贝/μL的质粒样品；所述质粒样品含有SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

任选地，所述标准品的制备方法为：取21.46μL浓度为3.3ng/μL的含有SEQ ID NO.1所示的核酸分子的全长6455bp的质粒样品，加入78.54μL ddH2O后，分别稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍。

4.检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括权利要求2所述的探针和引物组合以及权利要求3所述的标准品；

任选地，所述检测试剂盒包括：

引物1，序列为5'-CCTGGCTTCATTTCATTAACTTTTG-3'；

引物2，序列为5'-CGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTG-3'；

探针，序列为5'-CTTCTTGAAGCTGCCCTGCCCGA-3'；

标准品，所述检测标准品为6个浓度分别为1.0×107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL的质粒样品；所述质粒样品含有SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

其中，所述探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1。

5.Real-time PCR检测方法，其特征在于：使用权利要求4所述的检测试剂盒进行Real-time PCR检测，其中PCR反应体系中的引物1和引物2终浓度均为0.3μM，探针终浓度为0.15μM。

6.权利要求1所述的探针、权利要求2所述的探针和引物组合、权利要求3所述的检测标准品、权利要求4所述的检测试剂盒、权利要求5所述的检测方法在定性或定量检测核酸样品中的应用；

其中，所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子。

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