CN111793707B - 一种基因编辑转基因作物编辑位点特异性pcr方法及其应用 - Google Patents

一种基因编辑转基因作物编辑位点特异性pcr方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基因编辑转基因作物编辑位点特异性PCR方法及其应用，具体公开了检测方法包括如下步骤。1)收集序列：收集靶标基因野生型核苷酸序列和基因编辑作物中基因编辑核苷酸序列；(2)设计引物/探针：根据上述核苷酸序列，在编辑序列的两侧设计野生型基因和编辑基因的通用引物对；(3)PCR扩增：以基因编辑作物的基因组DNA为模板，利用引物探针组合进行PCR扩增检测。本发明利用通用引物和编辑位点特异性TaqMan探针，能特异性识别并准确定量基因编辑作物，适用于基因编辑作物的身份鉴定和定量检测。

Description

一种基因编辑转基因作物编辑位点特异性PCR方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中DNA检测方法，尤其涉及一种针对基因编辑转基因作物的编辑位点特异性TaqMan探针PCR方法，用于基因编辑转基因作物的编辑位点特异性定性定量检测。
背景技术
基因编辑技术作为近年来兴起的一种新的育种技术，能够对植物基因组进行高效、精准、特异的修饰，在植物领域广泛应用。如杜邦先锋·公司利用基因编辑技术敲除Wx1基因培育的糯玉米、陶氏益农公司运用ZFN技术培育成的一种基因组编辑玉米、抗除草剂转基因油菜、抗褐变蘑菇、利用CRISPR/Cas9技术编辑ARGOS8启动子区获得的抗旱高产的基因编辑玉米等。
基因组编辑技术可以对基因组进行插入、突变等修饰操作，从而获得不同类型的基因组编辑转基因产品。目前在国际上基因组编辑技术对基因组进行修饰的种类主要分为3类：(1)SDN1类型，不涉及修复模板，不引入任何外源基因，只包括点突变、少量几个碱基插入或缺失；(2)SDN2类型，通过同源重组途径进行修复，导致基因1个到几个碱基突变(<20bp)；(3)SDN3类型,含有长度达到数kb的外源DNA。由于SDN3类转基因作物含有较长的外源DNA片段，可以采用传统的转化体特异性PCR方法对该类基因编辑转基因作物进行特异性识别和定量检测。而SDN1和SDN2类基因编辑作物由于直接在生物自身基因组上进行定向编辑，最终基因编辑产品一般在靶标位点仅含有少数碱基的突变，与传统采用的自然突变和人工诱变突变体具有高度的相似性。对于不含有外源DNA片段的SDN1和SDN2型基因编辑转基因作物不适宜用传统的转化体特异性检测方法进行身份鉴定和定量检测。
我国《农业转基因生物安全评价管理办法》中规定，农业转基因生物是指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的动植物、微生物及其产品。虽然目前在国外批准商业化种植和销售的基因编辑转基因产品与以前传统转基因生物相比，其研究者往往声称并不含有任何外来基因序列或蛋白序列，但其仍然符合“利用基因工程技术改变基因组构成”特征，属于农业转基因生物。依据法规，我国安全管理部门要对研发中和商业化的基因编辑转基因产品进行安全监管和检测。针对基因编辑转基因产品的检测，前期已经提出了很多方法，如限制性片段长度多态性分析(PCR/RE)、CAPS(derivedcleaved amplified polymorphic sequence)衍生方法、限制性酶切PCR法、错配切割法、临界退火温度PCR(ACT-PCR)、高分辨率溶解曲线、Sanger测序法、扩增片段长度多态性、PCR单链构象多态分析法等。除了测序法，以上这些方法都只能定性检测转基因产品中的靶标基因是否被编辑，不能识别特异的编辑位点，不能满足转基因生物安全监管中对转基因产品进行精准身份识别和准确定量检测的需求；测序法虽然能通过序列分析可识别特异的编辑位点，但该方法相对耗时费力，且不能满足转基因生物安全监管中对转基因产品进行准确定量检测的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有基因编辑作物检测方法存在的不足，提供一种基因编辑转基因作物的编辑位点特异性定性定量PCR方法。本发明通过对基因编辑转基因产品的分子特征进行分析，提供一种能对转基因产品进行精准身份识别和准确定量检测的编辑位点特异性定性定量检测方法，为基因编辑转基因产品的安全监管和产权保护提供技术支撑。
本发明的目的是这样实现的：
在基因组编辑位点的两侧设计扩增产物长度小于250bp的特异性强、灵敏度高的引物组合，然后根据基因的野生型序列和编辑序列分别设计TaqMan探针。以野生型和基因编辑作物的基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增和数字PCR扩增，在荧光PCR扩增过程中，荧光信号强度会随着扩增的进行逐渐增加。
根据实时荧光PCR扩增曲线的有无，判定待测样品中是否含有预期的基因编辑转基因产品成分，实现基因编辑转基因产品的精准身份识别；通过荧光定量PCR和数字PCR分别检测基因编辑序列的拷贝数和作物内标基因的拷贝数，实现基因编辑转基因产品的准确定量检测。
本发明一个方面提供了一种适用于基因编辑作物的编辑位点的PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)收集序列
收集靶标基因野生型核苷酸序列和基因编辑作物中基因编辑核苷酸序列；
(2)设计引物/探针
根据上述核苷酸序列，在编辑序列的两侧设计野生型基因和编辑基因的通用引物对；
(3)PCR扩增
以基因编辑作物的基因组DNA为模板，利用引物探针组合进行PCR扩增检测；
其中，步骤(2)设计的引物使得扩增产物大小小于250bp，且扩增产物包含基因编辑位点区域；步骤(2)设计的探针包括野生型探针和基因编辑位点探针，所述基因编辑位点探针能够结合包含基因编辑位点的区域，所述野生型探针包含基因编辑位点的区域对应的野生型基因的区域；所述探针为TaqMan探针。
在本发明的技术方案中，步骤3)PCR扩增检测为实时荧光PCR扩增检测和/或数字PCR扩增检测。
在本发明的技术方案中，步骤(3)中扩增时，以多组引物探针组合分别进行检测。
在本发明的技术方案中，步骤(2)中，针对Cao基因编辑检测设计的引物和探针分别为：
Cao基因编辑序列的引物：
CAO-F:CGGTGATGATGGAGCTGACT SEQ ID No：1
CAO-R:GATATCGAACCGGACCACCT SEQ ID No：2
Cao基因野生型和基因编辑序列的探针：
CAO-WP：TGCAATTGGAACCCTTGGCCC SEQ ID No：3
CAO-E1-P:AAGAACTTGCCTTTTCCCCGG SEQ ID No：4
CAO-E2-P：TTGGAACCCTTGGAACCCCG SEQ ID No：5
CAO-E3-P：CCCTTGCCCGGGTCATC SEQ ID No：6
CAO-E4-P：CAATTGGAACCCTTCCCCGG SEQ ID No：7
CAO-E5-P：AGGCCTTGTTCCCATTGCAAA SEQ ID No：8
CAO-E6-P：CCATGTCGATGACGTTCCAATTGC SEQ ID No：9。
在本发明的技术方案中，步骤(2)中，针对SP1基因编辑检测设计的引物和探针分别为：
SP1基因编辑序列的引物：
SP-F:CCCAAGAAATAATGGATTAAGAGAG SEQ ID No：10
SP-R:GAGCTTGCGTTGAGTGAG SEQ ID No：11
SP1基因野生型和基因编辑序列的探针：
SP-W-P：ACCACCCTTGGGGCCTTG SEQ ID No：12
SP-E1-P:CAAGGCCCCAAGACACCATG SEQ ID No：13
SP-E2-P：TCGGAGCCATCCTTGCCTTGACT SEQ ID No：14
SP-E3-P：AGGCAAGGCCCCACCAT SEQ ID No：15
SP-E4-P：CAAGGCCCCATGGCTGC SEQ ID No：16
在本发明的技术方案中，所述探针的5’末端携带荧光基团X；3’端携带淬灭基团。
在本发明的技术方案中，其中所述探针的5’末端携带荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX；
3’端携带淬灭基团为TAMRA、BHQ。
本发明另一个方面提供了一种检测试剂盒，其中包括权利要求4中所述的引物和探针，或者包括权利要求5中所述引物和探针，
其中，试剂盒中包含多组检测组合物，每种检测组合物中包含引物以及其中一种探针。
在本发明的技术方案中，所述的检测试剂盒用于检测基因编辑水稻的用途。
在本发明的技术方案中，所述的基因编辑水稻为Cao基因编辑水稻或SP1基因编辑水稻。
一、方法
本方法包括以下步骤：
1.收集序列
收集靶标基因的野生型序列和编辑序列。
2.利用上述核苷酸序列特征设计通用引物/位点特异性探针
根据上述核苷酸序列，在编辑序列的两侧设计野生型基因和编辑基因的通用引物对，扩增产物大小一般小于250bp，适合进行荧光PCR扩增；在编辑位点区域分别设计野生型特异性TaqMan探针和编辑位点特异性TaqMan探针。
3.PCR扩增
以基因编辑作物的基因组DNA为模板，利用上述引物探针组合进行实时荧光PCR扩增和数字PCR扩增；根据实时荧光PCR反应中典型扩增曲线的有无判定样品中是否含有预期的基因编辑作物成分；根据样品中基因编辑序列的拷贝数定量样品中基因编辑作物成分的含量。
工作机理：
基因编辑转基因作物与传统转基因作物相比，无外源DNA的插入，仅内源基因发生了个别核苷酸或寡核苷酸片段的插入、缺失或替换。在编辑序列的两侧设计基因野生型序列和编辑序列的通用引物对，在编辑位点区域分别设计野生型特异性TaqMan探针和编辑位点特异性TaqMan探针。将通用引物和不同的编辑位点特异性TaqMan探针组合使用，进行实时荧光PCR扩增，在PCR扩增过程中，若TaqMan探针与特异的编辑序列完全匹配，则退火形成双链，而随着PCR产物的延伸，Taq DNA聚合酶利用5’-3’外切酶活性将TaqMan探针降解，荧光基团和淬灭基团分离并发出荧光信号；若TaqMan探针与特异性的编辑序列不匹配，不能退火形成双链，Taq DNA聚合酶不能酶切探针，无荧光信号。根据荧光扩增曲线的有无，判断待测样品中有无预期的基因编辑转基因产品成分。
将编辑位点特异性引物/探针和作物内标基因引物/探针组合使用，在荧光定量PCR平台上，用梯度稀释的基因编辑转基因DNA作为标准样品，分别绘制编辑序列和内标基因的标准曲线，根据标准曲线和待测样品的Ct值，分别计算编辑序列和内标基因的拷贝数，进而可计算出样品中特定基因编辑转基因产品的含量；在数字PCR平台上，无需标准样品，可直接测量出待测样品中编辑序列和内标基因的拷贝数，进而可计算出样品中特定基因编辑转基因产品的含量。
二、应用
本方法可以用于基因编辑转基因作物的身份识别和定量检测。
已经实验验证的可用本方法进行身份识别和定量检测的基因编辑转基因材料为：Cao基因野生型水稻和Cao基因编辑转基因水稻(6个材料，编号分别为Cao-E1～Cao-E6)；SP1基因野生型和SP1基因编辑转基因水稻(4个材料，编号分别为SP1-E1～SP1-E4)。
与现有的限制性酶切、临界退火温度PCR，高分辨率溶解曲线等基因编辑检测方法相比，本发明具有以下优点和积极效果：
1.本方法避免了现有方法只能检测目的基因是否被编辑，不能检测特异编辑序列的缺陷；
2.本方法可以对基因编辑转基因作物进行身份识别，在优化的反应条件下具有良好的特异性和灵敏度，检测灵敏度可达0.001ng/μl；
3.本方法可以对特定基因编辑转基因作物进行准确定量检测，荧光定量PCR检测限低至1％；数字PCR检测限低至0.1％；
4.本方法适用于基因编辑转基因作物的身份识别和定量检测。
附图说明
图1 Cao基因编辑水稻编辑位点特异性PCR引物/TaqMan探针设计及检测原理图示。a引物探针位置图示，箭头表示通用引物位置；b野生型和编辑水稻中设计编辑位点特异性TaqMan探针的核苷酸序列，下划线所示为Cao基因野生型和编辑序列特异性TaqMan探针序列，灰色表示编辑后删除碱基，灰色且具有下划线表示编辑后插入碱基；c编辑位点特异性PCR引物/TaqMan探针实时PCR扩增结果图示。
图2 SP1基因编辑水稻编辑位点特异性PCR引物/TaqMan探针设计及检测原理图示。a引物探针位置图示，箭头表示通用引物位置；b野生型和编辑水稻中设计编辑位点特异性TaqMan探针的核苷酸序列，下划线所示为SP1基因野生型和编辑序列特异性TaqMan探针序列，红色表示编辑后删除碱基；c编辑位点特异性PCR引物/TaqMan探针实时PCR扩增结果图示。
图3 Cao基因编辑位点特异性PCR方法的扩增特异性检测。DNA模板为Cao基因野生型植株，Cao基因编辑植株CAO-E1、CAO-E2、CAO-E3、CAO-E4、CAO-E5、CAO-E6。
图4 SP1基因编辑位点特异性PCR方法的扩增特异性检测。DNA模板为SP1基因野生型植株，SP1基因编辑植株SP-E1、SP-E2、SP-E3、SP-E4。
图5 Cao基因编辑植株CAO-E4编辑位点和内标基因PLD荧光定量PCR扩增的标准曲线。
图6 Cao基因编辑植株CAO-E6编辑位点和内标基因PLD的数字PCR扩增热图。检测样品分别含5％、2％、1％、0.1％CAO-E6的盲样，每个样品设置2个平行。
图7 SP1基因编辑植株SP-E1编辑位点和内标基因PLD荧光定量PCR扩增的标准曲线。
图8 SP1基因编辑植株SP-E1编辑位点和内标基因PLD的数字PCR扩增热图。检测样品分别含5％、2％、1％SP-E1的盲样，每个样品设置2个平行。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本方法对Cao基因编辑和SP1基因编辑转基因水稻进行检测
本发明一个具体实施例公开了以Cao基因编辑转基因水稻为例进行，包括下列步骤：
(1)收集序列
收集Cao基因野生型序列和Cao基因编辑转基因水稻中的编辑序列；
(2)利用上述序列特征设计引物探针
根据Cao基因编辑序列的两侧的核苷酸序列设计野生型和编辑序列的通用引物
CAO-F:CGGTGATGATGGAGCTGACT SEQ ID No：1
CAO-R:GATATCGAACCGGACCACCT SEQ ID No：2
根据编辑位点特异性序列设计Cao基因野生型和各编辑序列的特异性TaqMan探针
CAO-WP：TGCAATTGGAACCCTTGGCCC SEQ ID No：3
CAO-E1-P:AAGAACTTGCCTTTTCCCCGG SEQ ID No：4
CAO-E2-P：TTGGAACCCTTGGAACCCCG SEQ ID No：5
CAO-E3-P：CCCTTGCCCGGGTCATC SEQ ID No：6
CAO-E4-P：CAATTGGAACCCTTCCCCGG SEQ ID No：7
CAO-E5-P：AGGCCTTGTTCCCATTGCAAA SEQ ID No：8
CAO-E6-P：CCATGTCGATGACGTTCCAATTGC SEQ ID No：9
对上述探针5’的碱基标记荧光基团FAM和3’的碱基修饰淬灭基团BHQ1。
通用引物与特异性TaqMan探针在Cao基因野生型和编辑序列中的位置如图1所示。
(3)PCR扩增
以野生型水稻和Cao基因编辑转基因水稻的基因组DNA为模板，将通用引物CAO-F/CAO-R与特异性TaqMan探针分别组合，进行实时荧光和数字PCR扩增。
本发明一个具体实施例公开了以SP1基因编辑转基因水稻为例进行，包括下列步骤：
(1)收集序列
收集SP1基因野生型序列和SP1基因编辑转基因水稻中的编辑序列；
(2)利用上述序列特征设计引物探针
根据SP1基因编辑序列两侧的核苷酸序列设计野生型和编辑序列的通用引物
SP-F:CCCAAGAAATAATGGATTAAGAGAG SEQ ID No：10
SP-R:GAGCTTGCGTTGAGTGAG SEQ ID No：11
根据编辑位点特异性序列设计SP1基因野生型和各编辑序列的特异性TaqMan探针
SP-W-P：ACCACCCTTGGGGCCTTG SEQ ID No：12
SP-E1-P:CAAGGCCCCAAGACACCATG SEQ ID No：13
SP-E2-P：TCGGAGCCATCCTTGCCTTGACT SEQ ID No：14
SP-E3-P：AGGCAAGGCCCCACCAT SEQ ID No：15
SP-E4-P：CAAGGCCCCATGGCTGC SEQ ID No：16
并对上述探针5’的碱基标记荧光基团FAM和3’的碱基修饰淬灭基团BHQ1。
通用引物与特异性TaqMan探针在SP1基因野生型和编辑序列中的位置如图2所示。
(3)PCR扩增
以野生型水稻和SP1基因编辑转基因水稻的基因组DNA为模板，将通用引物SP-F/SP-R与特异性TaqMan探针分别组合，进行实时荧光和数字PCR扩增。
实施例1Cao基因编辑转基因水稻检测
1、准备工作
利用DNA提取试剂盒提取野生型水稻和基因编辑转基因水稻基因组DNA。将纯合基因编辑转基因水稻的基因组DNA梯度稀释，配置4-5个浓度梯度，作为荧光定量PCR的标准样品。
2、Cao基因编辑转基因水稻检测操作
将Cao基因通用引物对CAO-F/CAO-R与编辑位点特异性探针分别组合。用引物探针组合CAO-F/CAO-R/CAO-W-P特异鉴定和定量Cao基因的野生型水稻；用引物探针组合CAO-F/CAO-R/CAO-E1-P特异鉴定和定量Cao基因编辑的转基因水稻Cao-E1；用引物探针组合CAO-F/CAO-R/CAO-E2-P特异鉴定和定量Cao基因编辑的转基因水稻Cao-E2；用引物探针组合CAO-F/CAO-R/CAO-E3-P特异鉴定和定量Cao基因编辑的转基因水稻Cao-E3；用引物探针组合CAO-F/CAO-R/CAO-E4-P特异鉴定和定量Cao基因编辑的转基因水稻Cao-E4；用引物探针组合CAO-F/CAO-R/CAO-E5-P特异鉴定和定量Cao基因编辑的转基因水稻Cao-E5；用引物探针组合CAO-F/CAO-R/CAO-E6-P特异鉴定和定量Cao基因编辑的转基因水稻Cao-E6。进行基因编辑转基因水稻定量检测时，用水稻内标基因PLD测量水稻的总DNA，PLD基因的引物探针序列分别为PLD-F：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT SEQ ID No：17，PLD-R：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC SEQ ID No：18，PLD-P：
TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG SEQ ID No：19。
将上述引物探针组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96Real-Time System(Bio-Rad,Hercules,USA)上进行，检测及分析软件为CFX ManagerVersion1.6(Bio-Rad,Hercules,USA)。
Cao基因野生型水稻和基因编辑转基因水稻进行实时荧光PCR扩增的初始模板浓度均稀释为20ng/μL。
PCR反应体积为20μL，含DNA模板1μL，1x TaqMan Universal Master 10μl，上下游引物800μmol/L，探针400μmol/L。
荧光定量PCR反应条件为：95℃ 2分钟预变性后，进行45次PCR循环：95℃ 15秒变性，60℃ 1分钟退火及延伸，收集荧光信号。
将上述引物探针组合用于微滴数字PCR分析。微滴数字PCR分析在一台QX200droplet digital PCR System(Bio-Rad,Hercules,USA)上进行，检测及分析软件为QuantaSoft Version1.7.4.0917(Bio-Rad,Hercules,USA)。
Cao基因野生型水稻和基因编辑转基因水稻进行数字PCR扩增的初始模板浓度均稀释为10ng/μl。
PCR反应体积为20μl，含DNA模板1μl，1x ddPCR Supermix(Bio-rad)10μl，上下游引物800μmol/L，探针400μmol/L。
微滴数字PCR反应程序：94℃变性10min；94℃变性30s，58℃退火延伸1min，40个循环；98℃变性10min；4℃保存。扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中读取信号，并用软件QuantaSoft V1.3.2.0分析实验数据，获得绝对定量结果。
进行荧光定量PCR和微滴数字PCR扩增，设置空白对照试验，每个反应设置3个平行。
实施例2SP1基因编辑转基因水稻检测
1、准备工作
利用DNA提取试剂盒提取野生型水稻和基因编辑转基因水稻基因组DNA。将纯合基因编辑转基因水稻的基因组DNA梯度稀释，配置4-5个浓度梯度，作为荧光定量PCR的标准样品。
2、SP1基因编辑转基因水稻检测操作
将SP1基因通用引物对SP-F/SP-R与编辑位点特异性探针分别组合。用引物探针组合SP-F/SP-R/SP-W-P特异鉴定和定量SP1基因的野生型水稻；用引物探针组合SP-F/SP-R/SP-E1-P特异鉴定和定量SP1基因编辑的转基因水稻SP-E1；用引物探针组合SP-F/SP-R/SP-E2-P特异鉴定和定量SP1基因编辑的转基因水稻SP-E2；用引物探针组合SP-F/SP-R/SP-E3-P特异鉴定和定量SP1基因编辑的转基因水稻SP-E3；用引物探针组合SP-F/SP-R/SP-E4-P特异鉴定和定量SP1基因编辑的转基因水稻SP-E4。进行基因编辑转基因水稻定量检测时，用水稻内标基因PLD测量水稻的总DNA，PLD基因的引物探针序列分别为PLD-F：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT SEQ ID No：17，PLD-R：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC SEQ ID No：18，PLD-P：
TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG SEQ ID No：19。
将上述引物探针组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96Real-Time System(Bio-Rad,Hercules,USA)上进行，检测及分析软件为CFX ManagerVersion1.6(Bio-Rad,Hercules,USA)。
SP1基因野生型水稻和基因编辑转基因水稻进行实时荧光PCR扩增的初始模板浓度均稀释为20ng/μl。
PCR反应体积为20μl，含DNA模板1μl，1x ddPCR Supermix(Bio-rad)，上下游引物800μmol/L，探针400μmol/L。
荧光定量PCR反应条件为：95℃ 2分钟预变性后，进行50次PCR循环：95℃ 15秒变性，60℃ 1分钟退火及延伸，收集荧光信号。
将上述引物探针组合用于微滴数字PCR分析。微滴数字PCR分析在一台QX200dropletdigital PCR System(Bio-Rad,Hercules,USA)上进行，检测及分析软件为QuantaSoft Version1.7.4.0917(Bio-Rad,Hercules,USA)。
SP1基因野生型水稻和基因编辑转基因水稻进行数字PCR扩增的初始模板浓度均稀释为10ng/μl。
PCR反应体积为20μl，含DNA模板1μL，1x TaqMan Universal Master，上下游引物800μmol/L，探针400μmol/L。
微滴数字PCR反应程序：94℃变性10min；94℃变性30s，58.7℃退火延伸1min，40个循环；98℃变性10min；4℃保存。扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中读取信号，并用软件QuantaSoft V1.3.2.0分析实验数据，获得绝对定量结果。
进行荧光定量PCR和微滴数字PCR扩增，设置空白对照试验，每个反应设置3个平行。
实验结果
1.利用本发明中设计的编辑位点特异性PCR方法对基因编辑转基因水稻进行身份鉴定
(1)利用本发明中设计的编辑位点特异性PCR方法对Cao基因编辑转基因水稻进行身份鉴定
用引物探针组合CAO-F/CAO-R/CAO-E1-P、CAO-F/CAO-R/CAO-E2-P、CAO-F/CAO-R/CAO-E3-P、CAO-F/CAO-R/CAO-E4-P、CAO-F/CAO-R/CAO-E5-P、CAO-F/CAO-R/CAO-E6-P分别检测Cao基因野生型水稻和Cao基因编辑转基因水稻(6个材料，编号分别为CaoE1-CaoE6)的基因组DNA，在实时荧光PCR仪上进行扩增，考察每个引物探针组合的扩增特异性。检测结果表明CAO-F/CAO-R/CAO-E1-P仅在以Cao基因编辑转基因水稻CaoE1 DNA为模板时有典型扩增曲线，野生型水稻和其他Cao基因编辑转基因水稻DNA均无典型扩增曲线；CAO-F/CAO-R/CAO-E2-P仅在以Cao基因编辑转基因水稻CaoE2DNA为模板时有典型扩增曲线，野生型水稻和其他Cao基因编辑转基因水稻DNA均无典型扩增曲线；CAO-F/CAO-R/CAO-E4-P仅在以Cao基因编辑转基因水稻CaoE4 DNA为模板时有典型扩增曲线，野生型水稻和其他Cao基因编辑转基因水稻DNA均无典型扩增曲线；CAO-F/CAO-R/CAO-E5-P仅在以Cao基因编辑转基因水稻CaoE5 DNA为模板时有典型扩增曲线，野生型水稻和其他Cao基因编辑转基因水稻DNA均无典型扩增曲线；CAO-F/CAO-R/CAO-E6-P仅在以Cao基因编辑转基因水稻CaoE6 DNA为模板时有典型扩增曲线，野生型水稻和其他Cao基因编辑转基因水稻DNA均无典型扩增曲线；CAO-F/CAO-R/CAO-E3-P在以Cao基因编辑转基因水稻CaoE3 DNA为模板时有典型扩增曲线，同时以CAO-E4 DNA为模板的扩增中出现了非特异性扩增曲线，野生型水稻和其他Cao基因编辑转基因水稻DNA均无典型扩增曲线；(图3)。
(2)利用本发明中设计的编辑位点特异性PCR方法对SP1基因编辑转基因水稻进行身份鉴定
用引物探针组合SP-F/SP-R/SP-E1-P、SP-F/SP-R/SP-E2-P、SP-F/SP-R/SP-E3-P、SP-F/SP-R/SP-E4-P分别检测SP1基因野生型和SP1基因编辑转基因水稻(4个材料，编号分别为SP1-E1～SP1-E4)的基因组DNA，在实时荧光PCR仪上进行扩增，考察每个引物探针组合的扩增特异性。检测结果表明SP-F/SP-R/SP-E1-P仅在以SP1基因编辑转基因水稻SP1-E1DNA为模板时有典型扩增曲线，野生型水稻和其他SP基因编辑转基因水稻DNA均无典型扩增曲线；SP-F/SP-R/SP-E2-P仅在以S1P基因编辑转基因水稻SP1-E2 DNA为模板时有典型扩增曲线，野生型水稻和其他SP1基因编辑转基因水稻DNA均无典型扩增曲线；SP-F/SP-R/SP-E3-P仅在以SP1基因编辑转基因水稻SP1-E3 DNA为模板时有典型扩增曲线，野生型水稻和其他SP基因编辑转基因水稻DNA均无典型扩增曲线；SP-F/SP-R/SP-E4-P仅在以SP1基因编辑转基因水稻SP1-E4 DNA为模板时有典型扩增曲线，野生型水稻和其他SP1基因编辑转基因水稻DNA均无典型扩增曲线(图4)。检测结果表明本方法具有良好的特异性，可以准确的对基因编辑转基因产品进行身份鉴定。
2.利用本发明中设计的编辑位点特异性PCR方法对基因编辑转基因水稻进行定量检测
(1)利用本发明中设计的编辑位点特异性PCR方法对Cao基因编辑转基因水稻进行定量检测
1)用荧光定量PCR方法对Cao基因编辑转基因水稻CAO-E4进行定量检测
利用引物探针组合PLD-F/R/P和CAO-F/R/E4-P，进行Cao基因编辑转基因水稻Cao-E4的荧光定量PCR反应。以基因编辑水稻CAO-E4的梯度稀释DNA 100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl为校准品，绘制标准曲线(图5)，其R2值为分别为0.999和0.998，表明编辑序列的拷贝数与Ct值间具有良好的线性关系，适合用于编辑序列的精确定量。
为了验证本研究中建立的编辑位点特异性PCR方法的定量准确性，将野生型水稻的DNA和基因编辑转基因水稻CAO-E4的DNA混合，配置含基因编辑转基因水稻DNA 5％、2％、1％的盲样。根据建立的标准曲线(图5)，计算3个盲样的基因编辑转基因水稻的相对含量，考察盲样的测量值和真实值之间的差异大小。混合样品中的基因编辑转基因水稻CAO-E4含量的测量值和真实值之间的偏差在4％-12.4％之间，均小于25％。四次重复测量值的相对标准偏差在1.09％-4.43％之间，在可接受范围内。结果表明该方法可以准确定量基因编辑转基因水稻CAO-E4的含量，具有良好的准确性和精确性。
2)用数字PCR对Cao基因编辑转基因水稻Cao-E6进行定量检测
利用引物探针组合PLD-F/R/P和CAO-F/R/E6-P，在数字PCR平台上进行Cao基因编辑转基因水稻Cao-E6的定量检测。将野生型水稻的DNA和基因编辑转基因水稻CAO-E6的DNA混合，配置含基因编辑转基因水稻CAO-E6 DNA 5％、2％、1％、0.1％的盲样，数字PCR扩增热图如图6所示。CAO-E6编辑位点和PLD基因的阳性微滴和阴性微滴可以清楚的区分，无明显的下雨现象。计算4个盲样中基因编辑转基因水稻CAO-E6的相对含量，考察盲样的测量值和真实值之间的差异大小。混合样品中的基因编辑转基因水稻CAO-E6含量的测量值和真实值之间的偏差在1％-12％之间，均小于25％；除0.1％样品外，重复间相对标准偏差小于25％。结果表明该方法可准确定量基因编辑转基因水稻CAO-E6的含量，具有良好的准确性和精确性。
(2)利用本发明中设计的编辑位点特异性PCR方法对SP1基因编辑转基因水稻进行定量检测
1)用荧光定量PCR方法对SP1基因编辑转基因水稻SP-E1进行定量检测
利用引物探针组合PLD-F/R/P和SP-F/R/E1-P，进行SP基因编辑转基因水稻SP-E1的荧光定量PCR反应。以基因编辑水稻SP-E1的梯度稀释DNA 100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl为校准品，绘制标准曲线(图7)，其R2值为0.998，表明编辑序列的拷贝数与Ct值间具有良好的线性关系，适合用于编辑序列的精确定量。
为了验证该方法的定量准确性，将野生型水稻的DNA和基因编辑转基因水稻SP-E1的DNA混合，配置含基因编辑转基因水稻DNA 5％、2％、1％的盲样。根据建立的标准曲线(图7)，计算3个盲样的基因编辑转基因水稻的相对含量，考察盲样的测量值和真实值之间的差异大小。混合样品中的基因编辑转基因水稻SP-E1含量的测量值和真实值之间的偏差及四次重复测量值的相对标准偏差均小于25％，在可接受范围内。结果表明该方法可以准确定量基因编辑转基因水稻SP-E1的含量，具有良好的准确性和精确性。
2)用数字PCR对SP1基因编辑转基因水稻SP-E1进行定量检测
利用引物探针组合PLD-F/R/P和SP-F/R/E1-P，进行SP基因编辑转基因水稻SP-E1的数字PCR定量检测。将野生型水稻的DNA和基因编辑转基因水稻SP-E1的DNA混合，配置含基因编辑转基因水稻SP-E1 DNA 5％、2％、1％的盲样，数字扩增热图如图8所示。SP-E1-P和PLD-P阳性微滴和阴性微滴界限明显，可以清楚的区分。盲样测量值与真实值的偏差及重复间的标准偏差均小于25％，表明该方法可以在数字PCR平台上准确定量基因编辑转基因水稻SP-E1的含量。
以上结果表明，本发明为基因编辑转基因作物的身份鉴定和定量检测提供了有效、可靠的测定方法，可以用于不同编辑基因，或同一编辑基因、不同编辑位点基因编辑转基因作物的特异识别和准确定量。本发明为基因编辑转基因作物的监管检测提供了一种有用的参考。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种基因编辑转基因作物编辑位点特异性PCR方法及其应用
<130> CP120030434C
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggtgatgat ggagctgact 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatatcgaac cggaccacct 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcaattgga acccttggcc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagaacttgc cttttccccg g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttggaaccct tggaaccccg 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccttgcccg ggtcatc 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caattggaac ccttccccgg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggccttgtt cccattgcaa a 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccatgtcgat gacgttccaa ttgc 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cccaagaaat aatggattaa gagag 25
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gagcttgcgt tgagtgag 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
accacccttg gggccttg 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caaggcccca agacaccatg 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tcggagccat ccttgccttg act 23
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aggcaaggcc ccaccat 17
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caaggcccca tggctgc 17
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tggtgagcgt tttgcagtct 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctgatccact agcaggaggt cc 22
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgttgtgctg ccaatgtggc ctg 23

Claims (5)

1.一种适用于基因编辑水稻的编辑位点的PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)收集序列
收集靶标基因野生型核苷酸序列和基因编辑水稻中基因编辑核苷酸序列；
(2)设计引物/探针
根据上述核苷酸序列，在编辑序列的两侧设计野生型基因和编辑基因的通用引物和探针；
(3)PCR扩增
以基因编辑水稻的基因组DNA为模板，利用引物探针组合进行PCR扩增检测；
其中，步骤(2)设计的引物使得扩增产物大小小于250bp，且扩增产物包含基因编辑位点区域；步骤(2)设计的探针包括野生型探针和基因编辑位点探针，所述基因编辑位点探针能够结合包含基因编辑位点的区域，所述野生型探针包含基因编辑位点的区域对应的野生型基因的区域；所述探针为TaqMan探针；
其中，
步骤(1)中，收集靶标基因野生型核苷酸序列和基因编辑水稻中基因编辑核苷酸序列为Cao基因野生型核苷酸序列和Cao基因编辑水稻中基因编辑核苷酸序列；或者为SP1基因野生型核苷酸序列和SP1基因编辑水稻中基因编辑核苷酸序列
步骤(2)中，针对Cao基因编辑检测设计的引物和探针分别为：
Cao基因编辑序列的引物：
CAO-F:CGGTGATGATGGAGCTGACT SEQ ID No：1
CAO-R:GATATCGAACCGGACCACCT SEQ ID No：2
Cao基因野生型和基因编辑序列的探针：
CAO-WP：TGCAATTGGAACCCTTGGCCC SEQ ID No：3
CAO-E1-P:AAGAACTTGCCTTTTCCCCGG SEQ ID No：4
CAO-E2-P：TTGGAACCCTTGGAACCCCG SEQ ID No：5
CAO-E3-P：CCCTTGCCCGGGTCATC SEQ ID No：6
CAO-E4-P：CAATTGGAACCCTTCCCCGG SEQ ID No：7
CAO-E5-P：AGGCCTTGTTCCCATTGCAAA SEQ ID No：8
CAO-E6-P：CCATGTCGATGACGTTCCAATTGC SEQ ID No：9；
针对SP1基因编辑检测设计的引物和探针分别为：
SP1基因编辑序列的引物：
SP-F:CCCAAGAAATAATGGATTAAGAGAG SEQ ID No：10
SP-R:GAGCTTGCGTTGAGTGAG SEQ ID No：11
SP1基因野生型和基因编辑序列的探针：
SP-W-P：ACCACCCTTGGGGCCTTG SEQ ID No：12
SP-E1-P:CAAGGCCCCAAGACACCATG SEQ ID No：13
SP-E2-P：TCGGAGCCATCCTTGCCTTGACT SEQ ID No：14
SP-E3-P：AGGCAAGGCCCCACCAT SEQ ID No：15
SP-E4-P：CAAGGCCCCATGGCTGC SEQ ID No：16；
其中，步骤(3)中扩增时，以多组引物探针组合分别进行检测。
2.根据权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于，步骤3)PCR扩增检测为实时荧光PCR扩增检测和/或数字PCR扩增检测。
3.根据权利要求1所述的PCR检测方法，所述探针的5’末端携带荧光基团；3’端携带淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的PCR检测方法，其中所述探针的5’末端携带荧光基团选自FAM、TET、VIC、HEX；3’端携带淬灭基团选自TAMRA、BHQ。
5.一种基因编辑水稻的检测试剂盒，其中包括Cao基因编辑检测设计的引物和探针，或包含针对SP1基因编辑检测设计的引物和探针；
其中，试剂盒中包含多组检测组合物，每组检测组合物中包含引物以及其中一种探针；
所述的基因编辑水稻为Cao基因编辑水稻或SP1基因编辑水稻；
针对Cao基因编辑检测设计的引物和探针分别为：
Cao基因编辑序列的引物：
CAO-F:CGGTGATGATGGAGCTGACT SEQ ID No：1
CAO-R:GATATCGAACCGGACCACCT SEQ ID No：2
Cao基因野生型和基因编辑序列的探针：
CAO-WP：TGCAATTGGAACCCTTGGCCC SEQ ID No：3
CAO-E1-P:AAGAACTTGCCTTTTCCCCGG SEQ ID No：4
CAO-E2-P：TTGGAACCCTTGGAACCCCG SEQ ID No：5
CAO-E3-P：CCCTTGCCCGGGTCATC SEQ ID No：6
CAO-E4-P：CAATTGGAACCCTTCCCCGG SEQ ID No：7
CAO-E5-P：AGGCCTTGTTCCCATTGCAAA SEQ ID No：8
CAO-E6-P：CCATGTCGATGACGTTCCAATTGC SEQ ID No：9；
针对SP1基因编辑检测设计的引物和探针分别为：
SP1基因编辑序列的引物：
SP-F:CCCAAGAAATAATGGATTAAGAGAG SEQ ID No：10
SP-R:GAGCTTGCGTTGAGTGAG SEQ ID No：11
SP1基因野生型和基因编辑序列的探针：
SP-W-P：ACCACCCTTGGGGCCTTG SEQ ID No：12
SP-E1-P:CAAGGCCCCAAGACACCATG SEQ ID No：13
SP-E2-P：TCGGAGCCATCCTTGCCTTGACT SEQ ID No：14
SP-E3-P：AGGCAAGGCCCCACCAT SEQ ID No：15
SP-E4-P：CAAGGCCCCATGGCTGC SEQ ID No：16。
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