CN103045733A - 无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于转基因作物检测的无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法，涉及生物工程技术领域中DNA检测方法。所述的转基因作物包括转基因水稻、玉米、油菜和大豆；所述的方法是：①收集序列；②利用上述序列特征设计引物；③PCR扩增。本发明避免了TaqMan荧光定量PCR必须包含2条引物1条探针从而使最短检测靶标很难达到35-45bp的问题；避免了染料法荧光定量PCR在产物过短情况下很难区分PCR产物和引物二聚体的问题；适用于转基因水稻、油菜、大豆和玉米作物中短片段DNA的检测。

Description

无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域中DNA检测方法，尤其涉及一种无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法，用于短片段DNA检测。

背景技术

近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植和生产。这些转基因作物在被加工成食品、饲料的同时也产生了大量的深加工转基因产品和加工废弃物。

由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，30多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。这就使对于转基因深加工产品和加工废弃物中小片段转基因成分的检测方法的研究显得格外重要。目前，已有许多研究者致力于对深加工产品成分鉴定：Breton等通过简单重复序列的扩增片段多态性、Pafundo等则通过扩增片段长度多态性，检测食用油中的橄榄油成分（Breton等，2004；Pafundo等，2005）；Bai等通过将PCR与芯片杂交技术相结合，快速鉴定植物油中的花生、棉花、油棕、芝麻、玉米、向日葵成分（Bai等，2011）；Zhou等利用磁珠法富集DNA片段，然后通过荧光关联光谱法（Fluorescence cross-correlation spectroscopy），利用P-35S元件对样品进行转基因筛查（Zhou等，2009）。以上方法都是基于DNA降解程度不严重，能成功回收，且有足够的长片段作为模板。但是由于深加工产品自身的特性，DNA的提取回收困难，且回收到的均为弥散小片段，对小片段核苷酸分子的快速检测仍为一大难题。

我们希望通过对于小片段转基因成分的检测方法的研究探索，进而监测转基因深加工产品和原料加工过程中产生的废弃物中转基因成分，规范我国转基因食品市场和加工企业废弃物的排放标准，进一步完善我国转基因安全管理体系，保障我国转基因产业的健康发展。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有转基因检测技术对于短片段DNA的检测存在的困难，提供一种无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法。

本发明的目的是这样实现的：

根据需要检测的DNA靶标序列设计出扩增片段长度在35-45bp、特异性强、灵敏度高的引物组合，分别在其上下游引物接近3'端标记荧光基团和淬灭基团，在定量PCR扩增过程中，荧光信号会随着扩增的进行逐渐降低。

适用于短片段DNA成分的检测，解决了原有TaqMan荧光定量PCR必须包含2条引物1条探针从而使最短检测靶标很难低于70bp，以及染料法在PCR产物过短情况下很难区分PCR产物和引物二聚体的问题。

一、方法

本方法包括下列步骤：

①收集序列

收集水稻、玉米、油菜和大豆等转基因作物内标准基因以及外源基因的序列；

②利用上述序列特征设计引物

利用上述水稻、玉米、油菜和大豆等转基因作物内标准基因以及外源基因的序列分别设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合；

并在上游引物靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；

③PCR扩增

以含有内标准基因和外源基因的转基因作物为研究模板，分别利用上述引物组合进行荧光定量PCR扩增；转基因作物基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。并在延伸步骤后记录荧光信号强度的变化，随着PCR产物的积累，荧光信号会逐渐降低至设定的阈值。

工作机理：

普通Taqman荧光定量PCR需要一对引物以及一条5＇端标记荧光基团，3＇端标记淬灭基团的探针，这样就导致其最短检测靶标长度超过70bp，而本方法则是只需要二条分别标记了荧光集团和淬灭基团的引物，这样其检测靶标长度其实可以达到35-45bp，也就是差不多两条引物的长度，二者的区别在于本方法在PCR反应的过程中荧光基团和淬灭基团是先分开的，然后随着反应的进行而结合在一起，所以其荧光信号随着反应的进行呈下降的趋势并且逐渐降低至设定的阈值，而普通Taqman荧光定量PCR的荧光信号值随着反应的进行是呈上升趋势的。

二、应用

本方法可应用于短片段DNA成分的检测。

已经实验验证的可适用于本方法进行定量检测的基因包括下列6种：

水稻内标准基因PLD、水稻外源基因TT51、油菜内标准基因CruA、玉米内标准基因hmga、大豆内标准基因Lectin和大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS。

已经试验验证的可适用于本方法进行检测的转基因作物包括下列17种：

转基因水稻TT51-1、转基因水稻科丰6号、转基因水稻克螟稻、转基因油菜OXY235、转基因油菜RT73、转基因油菜RF3、转基因油菜RF2、转基因油菜MS8、转基因油菜MS1、转基因油菜Topas19/2、转基因玉米MIR604、转基因玉米MIR162、转基因玉米59122、转基因大豆Mon89788、转基因大豆A2704-12、转基因大豆A5547-127和转基因大豆GTS40-3-2。

    与现有短片段DNA检测方法相比，本发明具有下列优点和积极效果：

1、避免了TaqMan荧光定量PCR必须包含2条引物1条探针从而使最短检测

靶标很难达到35-45bp的问题；

2、避免了染料法荧光定量PCR在产物过短情况下很难区分PCR产物和引物

二聚体的问题。

3、适用于转基因水稻、油菜、大豆和玉米等作物中短片段DNA的检测。

附图说明

图1是基于本方法设计的引物组合PLDF2714F/PLDR2755T在水稻内标准基因PLD的序列中的位置图；

图2是基于本方法设计的引物组合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T在转基因水稻TT51-1转化事件所含Cry1Ac基因的序列中的位置图；

图3是基于本方法设计的引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T在油菜内标准基因CruA的序列中的位置图；

图4是基于本方法设计的引物组合ZmHMGF101F/ZmHMGR144T在玉米内标准基因hmga的序列中的位置图；

图5是基于本方法设计的引物组合GmLeF530F/GmLeR568T在大豆内标准基因Lectin的序列中的位置图；

图6是基于本方法设计的引物组合MoCEF732F/MoCER770T在大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS的序列中的位置图；

图7是基于本方法的水稻内标准基因PLD 加空白对照定量扩增曲线图；

图8是基于本方法的水稻外源基因TT51加空白对照定量扩增曲线图；

图9是基于本方法的油菜内标准基因CruA加空白对照定量扩增曲线图；

图10是基于本方法的玉米内标准基因hmga加空白对照定量扩增曲线图；

图11是基于本方法的大豆内标准基因Lectin加空白对照定量扩增曲线图；

图12是基于本方法的大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS加空白对照定量扩增曲线图；

    图13是基于本方法的水稻内标准基因PLD灵敏度实验定量扩增曲线图；

图14是基于本方法的水稻外源基因TT51灵敏度实验定量扩增曲线图；

图15是基于本方法的油菜内标准基因CruA灵敏度实验定量扩增曲线图；

图16是基于本方法的玉米内标准基因hmga灵敏度实验定量扩增曲线图；

图17是基于本方法的大豆内标准基因Lectin灵敏度实验定量扩增曲线图；

    图18是基于本方法的大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS灵敏度实验定量扩增曲线图；

图19是基于本方法检测转基因水稻TT51-1中内标准基因PLD定量扩增曲线图；

图20是基于本方法检测转基因水稻科丰6号中内标准基因PLD定量扩增曲线图；

图21是基于本方法检测转基因水稻克螟稻中内标准基因PLD定量扩增曲线图；

图22是基于本方法检测转基因水稻TT51-1中外源基因TT51定量扩增曲线图；

图23是基于本方法检测转基因水稻科丰6号中外源基因TT51定量扩增曲线图；

图24是基于本方法检测转基因水稻克螟稻中外源基因TT51定量扩增曲线图；

图25是基于本方法检测转基因油菜OXY235中内标准基因CruA定量扩增曲线图；

图26是基于本方法检测转基因油菜RT73中内标准基因CruA定量扩增曲线图；

图27是基于本方法检测转基因油菜RF3中内标准基因CruA定量扩增曲线图；

图28是基于本方法检测转基因油菜RF2中内标准基因CruA定量扩增曲线图；

图29是基于本方法检测转基因油菜MS8中内标准基因CruA定量扩增曲线图；

图30是基于本方法检测转基因油菜MS1中内标准基因CruA定量扩增曲线图；

图31是基于本方法检测转基因油菜Topas19/2中内标准基因CruA定量扩增曲线图；

图32是基于本方法检测转基因玉米MIR604中内标准基因hmga定量扩增曲线图；

图33是基于本方法检测转基因玉米MIR162中内标准基因hmga定量扩增曲线图；

图34是基于本方法检测转基因玉米59122中内标准基因hmga定量扩增曲线图；

图35是基于本方法检测转基因大豆Mon89788中内标准基因Lectin定量扩增曲线图；

图36是基于本方法检测转基因大豆A2704-12中内标准基因Lectin定量扩增曲线图；

图37是基于本方法检测转基因大豆A5547-127中内标准基因Lectin定量扩增曲线图；

图38是基于本方法检测转基因大豆GTS40-3-2中内标准基因Lectin定量扩增曲线图；

图39是基于本方法检测转基因大豆Mon89788中外源基因修饰过的CP4 EPSPS定量扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明详细说明：

一、本方法分别对下列四种进行

1、以转基因水稻品种TT51-1为例进行

    本方法包括下列步骤：

①收集序列

收集水稻内标准基因PLD和转基因水稻TT51-1转化事件所含Cry1Ac基因的序列；

②利用上述序列特征设计引物

设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合：

PLDF2714F/PLDR2755T和BtTT51F1140F/BtTT51R1180T；

引物序列分别为：

PLDF2714F：gctgggaggacgtgtTcg，

PLDR2755T：ggtgcttggcgttgcTga，

BtTT51F1140F：aacagagttcgcctaTgga，

BtTT51R1180T：cggatggcaagtTagaagagg；

并在上述引物PLDF2714F和BtTT51F1140F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物PLDR2755T和BtTT51R1180T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；

该引物组合PLDF2714F/PLDR2755T在水稻内标准基因PLD序列中的位置如图1所示；引物组合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T在转基因水稻TT51-1转化事件所含Cry1Ac基因的序列中的位置如图2所示；

③PCR扩增

以含有水稻内标准基因PLD和水稻外源TT51-1转化事件的转基因水稻TT51-1为研究模板，分别利用上述引物组合PLDF2714F/PLDR2755T和BtTT51F1140F/BtTT51R1180T进行荧光定量PCR扩增；转基因水稻TT51-1基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。

2、以转基因油菜品种OXY235为例进行

    本方法包括下列步骤：

①收集序列

收集油菜内标准基因CruA的序列；

②利用上述序列特征设计引物

设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合：

BnCruAF1635F/BnCruAR1679T；

引物序列分别为：

BnCruAF1635F：gatgacccatctaatgcTgacg，

BnCruAR1679T：gtaaccgagctgtggcttgTa，

并在上述引物BnCruAF1635F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物BnCruAR1679T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；

该引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T在油菜内标准基因CruA序列中的位置如图3所示；

③PCR扩增

以含有油菜内标准基因CruA的转基因油菜OXY235为研究模板，分别利用上述引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T进行荧光定量PCR扩增；转基因油菜OXY235基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。

3、以转基因玉米品种MIR604为例进行

    本方法包括下列步骤：

①收集序列

收集玉米内标准基因hmga的序列；

②利用上述序列特征设计引物

设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合：

ZmHMGF101F/ZmHMGR144T；

引物序列分别为：

ZmHMGF101F：cgtggcgtccgaagcaTt，

ZmHMGR144T：ggcggatgtcataaTaacagaaa，

并在上述引物ZmHMGF101F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物ZmHMGR144T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；

该引物组合ZmHMGF101F/ZmHMGR144T在玉米内标准基因hmga序列中的位置如图4所示；

③PCR扩增

以含有玉米内标准基因hmga的转基因玉米MIR604为研究模板，分别利用上述引物组合ZmHMGF101F/ZmHMGR144T进行荧光定量PCR扩增；转基因玉米MIR604基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。

4、以转基因大豆品种Mon89788为例进行

    本方法包括下列步骤：

①收集序列

收集大豆内标准基因Lectin和外源基因修饰过的CP4 EPSPS的序列；

②利用上述序列特征设计引物

设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合：

GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T；

引物序列分别为：

GmLeF530F：ctatcagatccaTcaaaacgacg，

GmLeR568T：tggccaaaTcccaagacg，

MoCEF732F：tccatcctctactgcttTccc，

MoCER770T：agcaaggcagcaaccaaTg；

并在上述引物GmLeF530F和MoCEF732F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物GmLeR568T和MoCER770T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；

该引物组合GmLeF530F/GmLeR568T在大豆内标准基因Lectin序列中的位置如图5所示；引物组合MoCEF732F/MoCER770T在大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS序列中的位置如图6所示；

③PCR扩增

以含有大大豆内标准基因Lectin和外源基因修饰过的CP4 EPSPS的转基因大豆Mon89788为研究模板，分别利用上述引物组合GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T进行荧光定量PCR扩增；转基因大豆Mon89788基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。

二、具体方法

1、准备工作

利用SDS法提取转基因作物DNA模板

先将20% SDS 预热到65°C，取15 ml SDS抽提buffer（0.1TrisHCl，0.05M EDTA，1M NaCl pH8.0）加入到50ml离心管，再加入2.5 μl β-巯基乙醇，混匀；液氮研磨3g左右的转基因水稻TT51-1叶片、转基因水稻科丰6号叶片、转基因水稻克螟稻叶片、转基因油菜OXY235叶片，转基因油菜RT73叶片、转基因油菜RF3叶片、转基因油菜RF2叶片、转基因油菜MS8叶片、转基因油菜MS1叶片、转基因油菜Topas19/2叶片、转基因玉米MIR604种子、转基因玉米MIR162种子、转基因玉米59122种子、转基因大豆Mon89788种子、转基因大豆A2704-12种子、转基因大豆A5547-127种子、转基因大豆GTS40-3-2种子，将粉末转至50ml含抽提buffer的50 ml离心管中，在振荡器上振荡混匀，加入2 ml预热的20%SDS，混匀，65°C水浴至少30分钟，其间要轻轻摇动试管；水浴后，迅速将离心管置于冰上，加入3ml 3M KAc，混匀，在冰上放置30分钟；4°C 5000g离心5min；将上清转移到新的50 ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20°C放置30min 以上；6000g ，4°C离心15min ，倒掉上清，用75%乙醇洗一遍，真空干燥，用超纯水溶解DNA，溶解后，将溶液转移到15ml的离心管中；按DNA溶解体积的1%加蛋白酶K，55°C水浴30min；加入等体积苯酚，混匀，轻摇30min，8000g离心10min；转移上清至新的tube中，加等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），轻摇20min，8000g离心15min；转移上清至新的tube中，加等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻摇20min，8000g离心15min；吸取上清，每管加入5μl RNase,混匀，37°C水浴1hr降解RNA；用等体积的苯酚抽提一次，轻摇20min ,8000g离心15 min；转移上清至新的离心管中，加等体积的氯仿-异戊醇（24:1）, 轻摇20min，8000g离心15min；吸上清加入1/10体积 3M NaAC ,混匀，加入等体积异丙醇，-20°C放置30min，沉淀DNA；6000g，4°C离心15min ，倒掉上清，用75%乙醇洗2遍，离心去掉75%乙醇，真空干燥；干燥后，用超纯水溶解DNA备用。

2、具体操作：

①以水稻内标准基因PLD和水稻TT51-1转化事件外源基因Cry1Ac的序列设计扩增片段长度在35-45bp的荧光标记引物组合PLDF2714F/PLDR2755T和BtTT51F1140F/BtTT51R1180T。引物序列分别为：PLDF2714F: gctgggaggacgtgtTcg，PLDR2755T: ggtgcttggcgttgcTga以及TT51F1140F: aacagagttcgcctaTgga，BtTT51R1180T: cggatggcaagtTagaagagg。并在上述引物PLDF2714F和TT51F1140F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团the fluorescent reporter 6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物PLDR2755T和BtTT51R1180T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。

针对无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法设计的上述引物组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96 Real-Time System(Bio-Rad, Hercules, USA)上进行，检测及分析软件为CFX Manager Version 1.6 (Bio-Rad, Hercules, USA)。

转基因水稻TT51-1转化事件的初始模板浓度均稀释为20ng/μl。

PCR反应体积25μl，含模板DNA 1μl，其他组分含量为：1x TaqMan Universal Master, 引物PLDF2714F/PLDR2755T和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T各400μM。 

TaqMan反应条件为：95°C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95°C 15秒变性，60°C 1分钟退火及延伸，收集荧光信号。

    分别以PLDF2714F/PLDR2755T和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T为引物，以上述浓度为20ng/μl的转基因水稻TT51-1转化事件为模板稀释至10ng/μl进行荧光定量PCR扩增，并且做空白对照试验，扩增曲线如图7、8所示。所有的荧光定量反应都重复4次。

用水将转基因水稻TT51-1基因组DNA稀释至不同浓度，以1μl基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释倍数，分别含20，4，0.8，0.16，0.032ng 转基因水稻TT51-1转化事件基因组DNA样品被用于灵敏度分析实验。所有的荧光定量反应都重复4次。

②以油菜内标准基因CruA的序列设计扩增片段长度在35-45bp的荧光标记引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T。引物序列分别为：BnCruAF1635F：gatgacccatctaatgcTgacg，BnCruAR1679T：gtaaccgagctgtggcttgTa。并在上述引物BnCruAF1635F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物BnCruAR1679T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。

针对无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法设计的上述引物组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96 Real-Time System(Bio-Rad, Hercules, USA)上进行，检测及分析软件为CFX Manager Version 1.6 (Bio-Rad, Hercules, USA)。

转基因油菜OXY235转化事件的初始模板浓度均稀释为20ng/μl。

PCR反应体积25μl，含模板DNA 1μl，其他组分含量为：1x TaqMan Universal Master, 引物BnCruAF1635F/BnCruAR1679T各400μM。 

TaqMan反应条件为：95°C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95°C 15秒变性，60°C 1分钟退火及延伸，收集荧光信号。

    以BnCruAF1635F/BnCruAR1679T为引物，以上述浓度为20ng/μl的转基因油菜OXY235转化事件为模板稀释至10ng/μl进行荧光定量PCR扩增，并且做空白对照试验，扩增曲线如图9所示。所有的荧光定量反应都重复4次。

用水将转基因油菜OXY235基因组DNA稀释至不同浓度，以1μl基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释倍数，分别含20，4，0.8，0.16，0.032ng 转基因油菜OXY235转化事件基因组DNA样品被用于灵敏度分析实验。所有的荧光定量反应都重复4次。

③以玉米内标准基因hmga的序列设计扩增片段长度在35-45bp的荧光标记引物组合ZmHMGF101F/ZmHMGR144T。引物序列分别为：ZmHMGF101F：cgtggcgtccgaagcaTt，ZmHMGR144T：ggcggatgtcataaTaacagaaa。并在上述引物ZmHMGF101F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物ZmHMGR144T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。

针对无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法设计的上述引物组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96 Real-Time System(Bio-Rad, Hercules, USA)上进行，检测及分析软件为CFX Manager Version 1.6 (Bio-Rad, Hercules, USA)。

转基因玉米MIR604转化事件的初始模板浓度均稀释为20ng/μl。

PCR反应体积25μl，含模板DNA 1μl，其他组分含量为：1x TaqMan Universal Master, 引物ZmHMGF101F/ZmHMGR144T各400μM。 

TaqMan反应条件为：95°C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95°C 15秒变性，60°C 1分钟退火及延伸，收集荧光信号。

    以ZmHMGF101F/ZmHMGR144T为引物，以上述浓度为20ng/μl的转基因玉米MIR604转化事件为模板稀释至10ng/μl进行荧光定量PCR扩增，并且做空白对照试验，扩增曲线如图10所示。所有的荧光定量反应都重复4次。

用水将转基因玉米MIR604基因组DNA稀释至不同浓度，以1μl基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释倍数，分别含20，4，0.8，0.16，0.032ng 转基因玉米MIR604转化事件基因组DNA样品被用于灵敏度分析实验。所有的荧光定量反应都重复4次。

④以大豆内标准基因Lectin和外源基因修饰过的CP4 EPSPS的序列设计扩增片段长度在35-45bp的荧光标记引物组合GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T。引物序列分别为：GmLeF530F：ctatcagatccaTcaaaacgacg，GmLeR568T：tggccaaaTcccaagacg以及MoCEF732F：tccatcctctactgcttTccc，MoCER770T：agcaaggcagcaaccaaTg。并在上述引物GmLeF530F和MoCEF732F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物GmLeR568T和MoCER770T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。

针对无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法设计的上述引物组合用于荧光定量PCR分析。荧光定量PCR分析在一台CFX96 Real-Time System(Bio-Rad, Hercules, USA)上进行，检测及分析软件为CFX Manager Version 1.6 (Bio-Rad, Hercules, USA)。

转基因大豆Mon89788转化事件的初始模板浓度均稀释为20ng/μl。

PCR反应体积25μl，含模板DNA 1μl，其他组分含量为：1x TaqMan Universal Master, 引物GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T各400μM。 

TaqMan反应条件为：95°C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95°C 15秒变性，60°C 1分钟退火及延伸，收集荧光信号。

    分别以GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T为引物，以上述浓度为20ng/μl的转基因大豆Mon89788转化事件为模板稀释至10ng/μl进行荧光定量PCR扩增，并且做空白对照试验，扩增曲线如图11、12所示。所有的荧光定量反应都重复4次。

用水将转基因大豆Mon89788基因组DNA稀释至不同浓度，以1μl基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。不同稀释倍数，分别含20，4，0.8，0.16，0.032ng 转基因大豆Mon89788转化事件基因组DNA样品被用于灵敏度分析实验。所有的荧光定量反应都重复4次。

二、应用

上述，可适用于本方法进行定量检测的基因包括：水稻内标准基因PLD、水稻外源基因TT51、油菜内标准基因CruA、玉米内标准基因hmga、大豆内标准基因Lectin、大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS。已经试验验证的可适用于本方法进行检测的转基因作物包括基因水稻TT51-1、转基因水稻科丰6号、转基因水稻克螟稻、转基因油菜OXY235，转基因油菜RT73、转基因油菜RF3、转基因油菜RF2、转基因油菜MS8、转基因油菜MS1、转基因油菜Topas19/2、转基因玉米MIR604、转基因玉米MIR162、转基因玉米59122、转基因大豆Mon89788、转基因大豆A2704-12、转基因大豆A5547-127、转基因大豆GTS40-3-2。

    针对无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法分别设计针对于水稻内标准基因PLD、水稻外源基因TT51、油菜内标准基因CruA、玉米内标准基因hmga、大豆内标准基因Lectin、大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS的引物组合PLDF2714F/PLDR2755T、BtTT51F1140F/BtTT51R1180T、BnCruAF1635F/BnCruAR1679T、ZmHMGF101F/ZmHMGR144T、GmLeF530F/GmLeR568T、MoCEF732F/MoCER770T，如下表所示：

转基因水稻TT51-1、转基因水稻科丰6号、转基因水稻克螟稻、转基因油菜OXY235，转基因油菜RT73、转基因油菜RF3、转基因油菜RF2、转基因油菜MS8、转基因油菜MS1、转基因油菜Topas19/2、转基因玉米MIR604、转基因玉米MIR162、转基因玉米59122、转基因大豆Mon89788、转基因大豆A2704-12、转基因大豆A5547-127、转基因大豆GTS40-3-2的初始模板浓度均稀释为10ng/μl。

PCR反应体积25μl，含模板DNA 1μl，其他组分含量为：1x TaqMan Universal Master, 引物PLDF2714F/PLDR2755T、BtTT51F1140F/BtTT51R1180T、BnCruAF1635F/BnCruAR1679T、ZmHMGF101F/ZmHMGR144T、GmLeF530F/GmLeR568T、MoCEF732F/MoCER770T各400μM。

TaqMan反应条件为：95°C 2分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95°C 15秒变性，60°C 1分钟退火及延伸，观察扩增情况。所有荧光定量反应都重复4次。       

三、实验结果

利用本发明中提供的一种无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法进行PCR分析。

以不含转基因植物的非转基因植物基因组DNA为模板，没有荧光信号下降的曲线被观察到。

为了验证本研究中建立的短片段检测方法的灵敏度，我们使用了从水稻、油菜、玉米、大豆等标准转基因作物中提取的基因组DNA用水稀释至一定含量，作为实时荧光定量PCR反应的模板。可以观察到随着模板中转基因含量的下降荧光信号下降到设定阈值的时间在依次往后推迟。

以模板DNA浓度均被分别稀释至20，4，0.8，0.16，0.032ng/μl的转基因水稻TT51-1，转基因油菜OXY235，转基因玉米MIR604，转基因大豆Mon89788为模板，分别以针对于无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法设计的引物组合PLDF2714F/PLDR2755T、BtTT51F1140F/BtTT51R1180T、BnCruAF1635F/BnCruAR1679T、ZmHMGF101F/ZmHMGR144T、GmLeF530F/GmLeR568T、MoCEF732F/MoCER770T为引物进行荧光定量PCR反应，结果分别如图13、14、15、16、17、18所示，均可以观察到随着模板中转基因含量的下降荧光信号下降到设定阈值的时间在依次往后推迟。

分别以转基因水稻TT51-1、转基因水稻科丰6号、转基因水稻克螟稻的基因组DNA为模板，用引物组合PLDF2714F/PLDR2755T检测水稻内标准基因PLD，均可发现荧光信号会逐渐降低至设定的阈值，如图19、20、21所示；分别以转基因水稻TT51-1、转基因水稻科丰6号、转基因水稻克螟稻的基因组DNA为模板，用引物组合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T检测水稻外源基因TT51，均可发现荧光信号会逐渐降低至设定的阈值，如图22、23、24所示；分别以转基因油菜OXY235，转基因油菜RT73、转基因油菜RF3、转基因油菜RF2、转基因油菜MS8、转基因油菜MS1、转基因油菜Topas19/2的基因组DNA为模板，用引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T检测油菜内标准基因CruA，均可发现荧光信号会逐渐降低至设定的阈值，如图25、26、27、28、29、30、31所示；分别以转基因玉米MIR604、转基因玉米MIR162、转基因玉米59122的基因组DNA为模板，用引物组合ZmHMGF101F/ZmHMGR144T检测玉米内标准基因hmga，均可发现荧光信号会逐渐降低至设定的阈值，如图32、33、34所示；分别以转基因大豆Mon89788、转基因大豆A2704-12、转基因大豆A5547-127、转基因大豆GTS40-3-2的基因组DNA为模板，用引物组合GmLeF530F/GmLeR568T检测大豆内标准基因Lectin，均可发现荧光信号会逐渐降低至设定的阈值，如图35、36、37、38所示；以转基因大豆Mon89788的基因组DNA为模板，用引物组合MoCEF732F/MoCER770T检测大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS，可发现荧光信号会逐渐降低至设定的阈值，如图39所示。说明此种无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法在转基因检测领域具有广泛应用性。

    以上结果可以看出，本发明为短片段DNA的检测提供了基于简单、可靠的测定方法，可以用于不同来源、不同含量混合样品中特定短片段DNA的检测。本发明为降解DNA等小分子模板的检测提供了一种有用的参考。    

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法

<140>

<141>

<160> 12；

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<400>

PLDF2714F：5’gctgggaggacgtgtTcg 3’；

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<400>

PLDR2755T：5’ggtgcttggcgttgcTga 3’；

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<400>

BtTT51F1140F：5’aacagagttcgcctaTgga 3’；

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<400>

BtTT51R1180T：5’cggatggcaagtTagaagagg 3’；

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<400>

BnCruAF1635F：5’gatgacccatctaatgcTgacg 3’；

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<400>

BnCruAR1679T：5’gtaaccgagctgtggcttgTa 3’；

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<400>

ZmHMGF101F：5’cgtggcgtccgaagcaTt 3’；

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<400>

ZmHMGR144T：5’ggcggatgtcataaTaacagaaa 3’；

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<400>

GmLeF530F：5’ctatcagatccaTcaaaacgacg 3’；

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<400>

GmLeR568T：5’tggccaaaTcccaagacg 3’；

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<400>

MoCEF732F：5’tccatcctctactgcttTccc 3’；

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<400>

MoCER770T：5’agcaaggcagcaaccaaTg 3’。

Claims (5)

1.一种适用于转基因作物检测的无探针双引物标记交互荧光能量共振转移

定量PCR方法，其特征在于：

所述的转基因作物包括转基因水稻、玉米、油菜和大豆；

①收集序列

收集转基因作物内标准基因以及外源基因的序列；

②利用上述序列特征设计引物

利用上述转基因作物内标准基因以及外源基因的序列分别设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合；

并在上游引物靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；

③PCR扩增

以含有内标准基因和外源基因的转基因作物为研究模板，分别利用上述引物组合进行荧光定量PCR扩增；转基因作物基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应，并在延伸步骤后记录荧光信号强度的变化，随着PCR产物的积累，荧光信号会逐渐降低至设定的阈值。

2.基于权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于适用于转基因水稻检测的定量PCR方法：

①收集序列

收集水稻内标准基因PLD和转基因水稻TT51-1转化事件所含Cry1Ac基因的序列；

②利用上述序列特征设计引物

设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合：

PLDF2714F/PLDR2755T和BtTT51F1140F/BtTT51R1180T；

引物序列分别为：

PLDF2714F：gctgggaggacgtgtTcg，

PLDR2755T：ggtgcttggcgttgcTga，

BtTT51F1140F：aacagagttcgcctaTgga，

BtTT51R1180T：cggatggcaagtTagaagagg；

并在上述引物PLDF2714F和BtTT51F1140F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物PLDR2755T和BtTT51R1180T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；

该引物组合PLDF2714F/PLDR2755T在水稻内标准基因PLD序列中的位置如图1所示；引物组合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T在转基因水稻TT51-1转化事件所含Cry1Ac基因的序列中的位置如图2所示；

③PCR扩增

以含有水稻内标准基因PLD和水稻外源TT51-1转化事件的转基因水稻TT51-1为研究模板，分别利用上述引物组合PLDF2714F/PLDR2755T和BtTT51F1140F/BtTT51R1180T进行荧光定量PCR扩增；转基因水稻TT51-1基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。

3.基于权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于适用于转基因油菜检测的定量PCR方法：

①收集序列

收集油菜内标准基因CruA的序列；

②利用上述序列特征设计引物

设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合：

BnCruAF1635F/BnCruAR1679T；

引物序列分别为：

BnCruAF1635F：gatgacccatctaatgcTgacg，

BnCruAR1679T：gtaaccgagctgtggcttgTa，

并在上述引物BnCruAF1635F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物BnCruAR1679T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；

该引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T在油菜内标准基因CruA序列中的位置如图3所示；

③PCR扩增

以含有油菜内标准基因CruA的转基因油菜OXY235为研究模板，分别利用上述引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T进行荧光定量PCR扩增；转基因油菜OXY235基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。

4.基于权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于适用于转基因玉米检

测的定量PCR方法： 

①收集序列

收集玉米内标准基因hmga的序列；

②利用上述序列特征设计引物

设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合：

ZmHMGF101F/ZmHMGR144T；

引物序列分别为：

ZmHMGF101F：cgtggcgtccgaagcaTt，

ZmHMGR144T：ggcggatgtcataaTaacagaaa，

并在上述引物ZmHMGF101F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物ZmHMGR144T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；

该引物组合ZmHMGF101F/ZmHMGR144T在玉米内标准基因hmga序列中的位置如图4所示；

    ③PCR扩增

以含有玉米内标准基因hmga的转基因玉米MIR604为研究模板，分别利用上述引物组合ZmHMGF101F/ZmHMGR144T进行荧光定量PCR扩增；转基因玉米MIR604基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。

5.基于权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于适用于转基因大豆检

测的定量PCR方法： 

    ①收集序列

    收集大豆内标准基因Lectin和外源基因修饰过的CP4 EPSPS的序列；

②利用上述序列特征设计引物

设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合：

GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T；

引物序列分别为：

GmLeF530F：ctatcagatccaTcaaaacgacg，

GmLeR568T：tggccaaaTcccaagacg，

MoCEF732F：tccatcctctactgcttTccc，

MoCER770T：agcaaggcagcaaccaaTg；

并在上述引物GmLeF530F和MoCEF732F靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物GmLeR568T和MoCER770T靠近3'端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；

该引物组合GmLeF530F/GmLeR568T在大豆内标准基因Lectin序列中的位置如图5所示；引物组合MoCEF732F/MoCER770T在大豆外源基因修饰过的CP4 EPSPS序列中的位置如图6所示；

③PCR扩增

以含有大大豆内标准基因Lectin和外源基因修饰过的CP4 EPSPS的转基因大豆Mon89788为研究模板，分别利用上述引物组合GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T进行荧光定量PCR扩增；转基因大豆Mon89788基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。

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