CN102021246B - 一种快速鉴别和检测肝片吸虫和大片吸虫的lamp检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别和检测肝片吸虫和大片吸虫的LAMP检测方法和试剂盒。本发明采用具有SEQIDNO：1～SEQIDNO：12所示序列的特异性引物分别对肝片吸虫和大片吸虫的待测模板DNA进行LAMP扩增，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳或者SYBRgreenI显色，并在紫外光下实现观察和鉴别。本发明建立了用于肝片吸虫和大片吸虫鉴别的快速、特异、敏感的LAMP方法，可准确地鉴定肝片吸虫和大片吸虫成虫、尾蚴、虫卵。本发明的试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观，可用于肝片吸虫和大片吸虫的快速鉴别。

Description

一种快速鉴别和检测肝片吸虫和大片吸虫的LAMP检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及采用LAMP方法快速区分肝片吸虫和大片吸虫的鉴别技术。

背景技术

 片形吸虫病是牛、羊最主要的寄生虫病之一。它是由寄生于黄牛、水牛、山羊、绵羊等各种反刍动物肝脏胆管中的肝片形吸虫和大片形吸虫所引起的，猪、马属动物及野生动物也可寄生，并且可寄生于人。该病能引起急性或慢性的肝炎和胆管炎，并继发全身性的中毒和营养障碍，常引起犊牛和绵羊的大批死亡。本病呈地方性流行，多发生在低洼、潮湿的放牧地区。

 肝片吸虫和大片吸虫形态极其相似。长期以来，两者的分类鉴定主要依据成虫的形态、生活史、流行病学等特征来进行，但由于片形吸虫种类个体差异较大，同一虫种又因宿主的种类、宿主的反应的不同而有一定差异，导致虫体的形态不很规则，用传统的形态学分类方法有时就有局限性，对于这两种吸虫的尾蚴和虫卵的鉴定就更加困难。近年来，一些学者分析了片形吸虫染色体的核型和同工酶的多态性，但染色体核型的研究结果存在一些矛盾，有人认为肝片吸虫染色体组成为3n=30，大片吸虫染色体组成2n=20，但也有相反的结果。

分子遗传学分析为片形吸虫分类的研究提供了新的途径。黄维义等应用PCR-RFLP对来自广西、四川、黑龙江、法国等地的片形吸虫进行分析，用限制性内切酶Hsp92Ⅱ、RcaⅠ酶切核糖体DNA第二内转录间隔区(ITS-2)的完整的PCR产物，结果显示，两种酶的酶切带型在种内无差异，但在种间却均有一定的差异。胥全彬等应用RAPD技术鉴别南京市的片形吸虫非典型形态虫体，鉴定为形态不典型的大片吸虫。但以上技术操作起来需要PCR仪等比较昂贵的仪器，所以在大批量样本检测和虫卵及尾蚴样本分型时比较费时费力。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification , LAMP)是Notomi 等在2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件（65 ℃左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。

但是，由于现有的环介导等温扩增技术对操作环境要求很高，实验耗费也较高，尤其是其中使用的SYBR green I染料较贵，现有片形吸虫的虫种鉴定通常是通过获取成虫样本观察其形态来确定，目前还未见环介导等温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification , LAMP)应用于片形吸虫虫种的鉴定，也未见环介导等温扩增技术应用于片形吸虫病的快速检测和防控检测的技术报道。

发明内容

本发明的目的是填补环介导等温扩增技术应用于片形吸虫病的快速检测和防控检测的技术空白，提供一种快速区分肝片吸虫和大片吸虫的LAMP检测方法，突破现有技术在片行吸虫研究方面存在的技术限制。

本发明的另一个目的是提供实现上述检测方法的LAMP试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种快速区分肝片吸虫和大片吸虫的LAMP检测方法，包括以下步骤：

  （1）肝片吸虫和大片吸虫成虫、尾蚴或虫卵DNA的提取；

    成虫样本取自牛或羊；尾蚴样本取自椎实螺；虫卵样本取自羊或牛的粪便； 

（2）采用特异性检测引物应用恒温加热器技术（LAMP）进行扩增；

  （3）将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察。

  本发明步骤（3）也可以将产物经SYBR green I 显色液显色后，在凝胶成像系统下观察。

步骤（1）所述DNA的提取：虫体材料置于1.5mL的离心管中，用双蒸水反复吹打冲洗3次，移去离心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白质释放基因组DNA，56℃过夜消化15～18h；消化好的虫体悬液按Promega试剂盒Wizard^? SV Genomic DNA purification system使用说明提取虫体DNA，直接使用或于-20℃冰箱保存备用。

尾蚴DNA的提取方法为将宿主螺用灭菌双蒸水反复洗5次，用两个载玻片将其压碎，去掉外面的螺壳，螺肉内尾蚴的提取方法参照虫体的提取方法。

虫卵DNA的提取方法参照Müller（2007）提纯虫卵的方法并加以改良，取0.1克阳性粪便于1.5ml Eppendorf 管中，加入含有2%的Triton X-100和0.1M的氢氧化钾的溶液1ml室温下作用10 min，其间不断摇匀。然后10000rpm离心2min，去上清，重复前面的步骤清洗两次。离心去上清后加入1.2 ml饱和硫代硫化钠溶液，混匀，14000rpm离心5min。此时虫卵主要分布于液面，小部分分布于液体中。分别吸取200μl 上清到另一个1.5ml Eppendorf 管中，加入1.2 ml双蒸水，12000rpm离心2min。去上清，保留100μl 左右液体，用移液器吹打使沉淀与液体混匀。然后把各管的液体都移到同一管中，离心管内加满双蒸水，12000rpm离心2min。去上清，再加入1.2 ml双蒸水，如此重复3～5次。最后离心去上清，保留30μl液体。

在显微镜下操作，用移液器从纯化的虫卵中分别吸取1个、3个、5个虫卵到含有30μl 的1.5ml Eppendorf 管中，做好标记，以检测虫卵特异PCR检测方法的敏感性。

加入液体体积一半的玻璃珠，旋涡震荡1 min后瞬时离心，沸水中煮5min，最后10000rpm离心1min，取3μl 上清PCR扩增。

步骤（2）所述特异性检测引物分别如SEQ IDNO：1～SEQ IDNO：12所示，或如表1所示：

表1

步骤（2）所述LAMP扩增：按照扩增样品数n（n=样品数+2）取LAMP反应液、Bst酶混合于一离心管中，混匀，分装；将阳、阴性对照液分别加入一个分装管中，取各样品的DNA加入对应反应管中；各反应管标记后离心混匀，置于恒温加热器上反应；

步骤（2）所述Bst酶按每个PCR反应含1.25U加入。

步骤（2）所述LAMP扩增条件为：肝片吸虫 LAMP检测为61℃，大片吸虫 LAMP检测为62℃，各反应 45分钟。

步骤（3）所述LAMP扩增产物观察：取扩增后的产物加样于2.0%琼脂糖凝胶上，电泳后置于紫外透射仪下观察结果并拍照分析；

LAMP显色反应：将上述LAMP扩增产物各加入1 μL SYBR green I在室温放置5 min，进行显色 。

显色反应观察：肉眼观察阳性反应呈绿色，阴性不变色；在紫外灯下，阳性反应发出荧光，阴性反应无荧光。

本发明同时提供一种实现上述方法的LAMP试剂盒，包括以下组分： 

（1） DNA裂解液：Nuclei lysis solution、EDTA、蛋白酶 K 和RNase A solution的混合溶液；

（2）LAMP反应液：dATP、dTTP、dGTP、dCTP、betaine、引物FIP、BIP、F3、B3、环引物Loop F、LoopB和MgSO₄的混合溶液；

（3）SYBR green I 显色液：1:10倍稀释液；

（4）肝片吸虫DNA阳性对照和大片吸虫DNA阳性对照。

在上述试剂盒中，还可以添加Bst 大片段聚合酶。

在上述试剂盒中，各物质的优选量为：

（1） DNA裂解液，27.5mL: 为100个反应的200μL Nuclei lysis solution、50μL pH 8.0的0.5M的EDTA、20μL 蛋白酶 K （20mg/mL）和5μL RNase A solution (4mg/mL)的混合溶液；

（2）LAMP反应液，2.5mL：为终浓度200μM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，终浓度0.2mM 的引物FIP、BIP、F3、B3，0.8 μM 环引物Loop F、LoopB，10 μM的betaine，10mM的MgSO₄的混合溶液；

（3）SYBR green I 显色液：1:10倍稀释液；

（4）肝片吸虫和大片吸虫DNA阳性对照100μL和其他吸虫DNA阳性对照100μL；

（5）Bst DNA聚合酶，8U/μL，25μL。

本发明试剂盒LAMP反应条件的优化过程为：

    本申请人通过对来自于全球不同流行区（中国、尼日尔、法国、美国和西班牙）的肝片吸虫和大片吸虫成虫分离株、尾蚴、虫卵进行快速检测，采用环介导等温扩增技术（LAMP）技术扩增了核糖体基因间隔区（the ribosomal intergenic spacer (IGS)），发现了该段基因（已上传至NCBI：肝片吸虫的序列号为GU903890，大片吸虫的序列号为 GU903891） DNA裂解液能特异的区分肝片吸虫和大片吸虫。本申请人根据肝片吸虫和大片吸虫IGS基因的特性并结合LAMP技术的检测特点，设计本发明方法快速区分肝片吸虫和大片吸虫。

根据反应体系优化策略，对MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP、引物浓度等分别进行了优化，包括根据引物Tm值，将温度按59 ℃、60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃依次递增，从多次试验和创造性地分析总结中确定最佳退火温度；反应时间按30 min、45 min、60 min、90 min、120 min优化，从多次试验和创造性地分析总结中确定最佳反应时间。最后确定优选的技术方案是，肝片吸虫LAMP反应最佳反应温度为61℃；大片吸虫LAMP反应最佳反应温度为62℃；添加环引物后反应最快可在45min内完成。

本发明的有益效果是：

（1）本发明通过对来自于不同流行区的肝片吸虫和大片吸虫成虫分离株、尾蚴、虫卵进行LAMP反应，成功实现应用LAMP技术在短时间内区分鉴别肝片吸虫和大片吸虫，设计一种快速鉴定肝片吸虫和大片吸虫的检测方法；

（2）本发明通过优化反应体系和反应条件，研制出一种快速鉴别肝片吸虫和大片吸虫的LAMP检测试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观，不仅可用于肝片吸虫和大片吸虫的区分，还可用于人和动物片形吸虫病的诊断与流行病学调查，为片形吸虫病诊断和防治技术等进一步研究奠定基础。

附图说明

图1为肝片吸虫的LAMP特异性电泳图谱；

图2为大片吸虫的LAMP特异性电泳图谱；

图3为肝片吸虫的LAMP特异性显色图谱；

图4为大片吸虫的LAMP特异性显色图谱；

图5为肝片吸虫的LAMP敏感性显色图谱；

图6为大片吸虫的LAMP敏感性显色图谱；

图7为肝片吸虫样本LAMP检测的显色图谱；

图8为大片吸虫样本LAMP检测的显色图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1   试剂盒的组成

试剂盒内含DNA裂解液，其中含Nuclei lysis solution、EDTA、蛋白酶 K（20mg/mL）和RNase A solution的混合溶液(4mg/mL)；LAMP反应液100个反应（25μL/个反应）为终浓度200μM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，终浓度0.2mM 的引物FIP、BIP、F3、B3，0.8 μM环引物Loop F、LoopB，10 μM的betaine（甜菜碱），10mM的MgSO₄的混合溶液；1:10倍SYBR green I 显色液；25μL Bst DNA聚合酶（8U/μL）；肝片吸虫DNA阳性对照和大片吸虫DNA阳性对照。

实施例2  试剂盒LAMP试验

    用经过DNA有效性验证（采用引物JB3和JB4.5对样本的cox1部分序列进行扩增，详细步骤参照董世娟等文章《我国片形吸虫(Fasciola)线粒体细胞色素c氧化酶亚基基因(cox1)部分序列的多态性》）的肝片吸虫和大片吸虫分离对照样品DNA各1μL为模板，按照试剂盒的反应条件进行LAMP扩增，同时设空白对照和试剂盒阴、阳性对照。

鉴定的操作步骤如下：

  （1）肝片吸虫和大片吸虫成虫、尾蚴或虫卵DNA的提取；（成虫样本来自于中国、美国、西班牙、尼日尔、法国的牛或羊；尾蚴样本来自于中国广西的椎实螺；虫卵样本来自于中国广西感染水牛的粪便。）

所述DNA的提取：虫体材料置于1.5mL的离心管中，用双蒸水反复吹打冲洗3次，移去离心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白质释放基因组DNA，56℃过夜消化15～18h；消化好的虫体悬液按Promega试剂盒Wizard^? SV Genomic DNA purification system使用说明提取虫体DNA，直接使用或于-20℃冰箱保存备用。

尾蚴DNA的提取方法为将宿主螺用灭菌双蒸水反复洗5次，用两个载玻片将其压碎，去掉外面的螺壳，螺肉内尾蚴的提取方法参照虫体的提取方法。

虫卵DNA的提取方法参照Müller（2007）提纯虫卵的方法并加以改良，取0.1克阳性粪便于1.5ml Eppendorf 管中，加入含有2%的Triton X-100和0.1M的氢氧化钾的溶液1ml室温下作用10 min，其间不断摇匀。然后10000rpm离心2min，去上清，重复前面的步骤清洗两次。离心去上清后加入1.2 ml饱和硫代硫化钠溶液，混匀，14000rpm离心5min。此时虫卵主要分布于液面，小部分分布于液体中。分别吸取200μl 上清到另一个1.5ml Eppendorf 管中，加入1.2 ml双蒸水，12000rpm离心2min。去上清，保留100μl 左右液体，用移液器吹打使沉淀与液体混匀。然后把各管的液体都移到同一管中，离心管内加满双蒸水，12000rpm离心2min。去上清，再加入1.2 ml双蒸水，如此重复3～5次。最后离心去上清，保留30μl液体。

在显微镜下操作，用移液器从纯化的虫卵中分别吸取1个、3个、5个虫卵到含有30μl 的1.5ml Eppendorf 管中，做好标记，以检测虫卵特异PCR检测方法的敏感性。

加入液体体积一半的玻璃珠，旋涡震荡1 min后瞬时离心，沸水中煮5min，最后10000rpm离心1min，取3μl 上清进行下述PCR扩增；

（2）采用特异性检测引物应用恒温加热器技术（LAMP）进行扩增；所述特异性检测引物如下表1所示：

表1

按照扩增样品数n（n=样品数+2）取LAMP反应液、Bst酶混合于一离心管中，混匀，分装；将阳、阴性对照液分别加入一个分装管中，取各样品的DNA加入对应反应管中；各反应管标记后离心混匀，置于恒温加热器上反应；

步骤（2）所述Bst酶按每个PCR反应含1.25U加入。

表2   LAMP扩增体系

 

LAMP扩增条件为： 肝片吸虫LAMP检测为61℃，大片吸虫LAMP检测为62℃，各反应45min。

（3）PCR产物在2.0%TBE琼脂糖凝胶中电泳后，紫外透射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像；显色反应也置于凝胶系统成像。

试验结果可知，本发明试剂盒能够从全部肝片吸虫和大片吸虫DNA中将两者准确区分，见附图1～附图4所示，附图1中，附图1为肝片吸虫的电泳图谱，可见只有肝片吸虫DNA可扩增出特异条带；附图2为大片吸虫的电泳图谱，可见只有大片吸虫DNA可扩增出特异条带；附图3为肝片吸虫的显色图谱，只有肝片吸虫DNA扩增后可呈现显色；附图4为大片吸虫的显色图谱，只有大片吸虫DNA扩增后可呈现显色。M, DL2000 marker; 1～6分别为：肝片吸虫成虫 (FhCM1)，大片吸虫成虫 (FgCM1)，中华分支睾吸虫，麝猫后睾吸虫，土耳其斯坦东毕吸虫和日本血吸虫，空白对照。

实施例3  试剂盒的LAMP敏感性试验

首先将肝片吸虫和大片吸虫成虫提取DNA后进行稀释，旋涡振荡混匀，按Eppendorf Biophotometer核酸蛋白测定仪的操作规程，检测其总DNA含量。按10^-1～10^-6 ng/μl 稀释DNA，LAMP扩增条件同实施例2，同时设空白对照（宿主DNA）。LAMP产物经1:10倍SYBR green I 显色液显色，于凝胶成像系统下观察，以确定其敏感性。试验结果表明该LAMP检测方法敏感性高，最低能检测到10^-5ng DNA的肝片吸虫和大片吸虫，见附图5～附图6所示，附图5为肝片吸虫检测显色图谱，附图6为大片吸虫检测显色图谱。管1～6模板DNA的稀释浓度依次为10^-1～10^-6 ng/μl，管7为阴性对照。

实施例4 试剂盒的保存期试验

将在4℃和-20℃保存1个月、3个月、6个月、9个月的试剂盒对已知样品进行检测，扩增条件同前述。结果表明试剂盒可在4℃（Bst酶除外，须-20℃保存）和-20℃保存长期保存，在试验周期的9个月内，在合适保存条件下阳性样品均能扩增出目的亮带和荧光显色，而阴性对照无目的亮带和荧光显色出现。

实施例5  试剂盒在不同流行地区肝片吸虫和大片吸虫成虫分离株、尾蚴、虫卵样品诊断中的应用

1． DNA样品

肝片吸虫和大片吸虫的成虫分离株、尾蚴、虫卵样品来自中国、美国、西班牙、尼日尔、法国共28个样品，70%酒精保存备用。

2． DNA的提取

虫体材料置于1.5mL的离心管中，用双蒸水反复吹打冲洗3次，移去离心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白质释放基因组DNA，56℃过夜消化16h；消化好的虫体悬液按Promega试剂盒Wizard^? SV Genomic DNA purification system使用说明提取虫体DNA，直接使用或于-20℃冰箱保存备用。

尾蚴DNA的提取方法为将宿主螺用灭菌双蒸水反复洗5次，用两个载玻片将其压碎，去掉外面的螺壳，螺肉内尾蚴的提取方法参照虫体的提取方法。

虫卵DNA的提取方法参照Müller（2007）提纯虫卵的方法并加以改良，取0.1克阳性粪便于1.5ml Eppendorf 管中，加入含有2%的Triton X-100和0.1M的氢氧化钾的溶液1ml室温下作用10min，其间不断摇匀。然后10000rpm离心2min，去上清，重复前面的步骤清洗两次。离心去上清后加入1.2 ml饱和硫代硫化钠溶液，混匀，14000rpm离心5min。此时虫卵主要分布于液面，小部分分布于液体中。分别吸取200μl 上清到另一个1.5ml Eppendorf 管中，加入1.2 ml双蒸水，12000rpm离心2min。去上清，保留100μl 左右液体，用移液器吹打使沉淀与液体混匀。然后把各管的液体都移到同一管中，离心管内加满双蒸水，12000rpm离心2min。去上清，再加入1.2 ml双蒸水，如此重复3～5次。最后离心去上清，保留30μl液体。

在显微镜下操作，用移液器从纯化的虫卵中分别吸取1个、3个、5个虫卵到含有30μl 的1.5ml Eppendorf 管中，做好标记，以检测虫卵特异PCR检测方法的敏感性。

加入液体体积一半的玻璃珠，旋涡震荡1 min后瞬时离心，沸水中煮5min，最后10000rpm离心1min，取3μl 上清PCR扩增。

3．LAMP扩增

取经过DNA有效性验证的肝片吸虫和大片吸虫成虫分离株、尾蚴、虫卵样品DNA各1μL为模板以及阴性、阳性对照样本各1μL，按照试剂盒的反应条件进行LAMP反应，方法同实施例2。

4．琼脂糖电泳分析

  实验结果见附图7～附图8所示，附图7表示肝片吸虫样本LAMP检测的显色图谱，其中管1～6分别代表分离株FhCM1（尼日尔）， FhFG5（法国）， FhAM1（美国）， FhGSG17（中国）， FhOS（西班牙）， FhHS(西班牙)，管7表示阴性对照。附图8表示大片吸虫样本LAMP检测的显色图谱，其中管1～9分别代表FgCAY1（尼日尔）， FgGXB2（中国）， FgGZB3（中国），FgGXBegg1（中国，虫卵）， FgGXBegg2（中国，虫卵）， FgGXBegg3（中国，虫卵），FgGXS–1（中国，尾蚴）， FgGXS–2（中国，尾蚴），管10表示阴性对照。由实验结果可知，所有经形态学和特异PCR鉴定过的肝片吸虫和大片吸虫成虫分离株、尾蚴、虫卵都能准确、快速被鉴定和区分，证明了所建立的LAMP方法能有效区分肝片吸虫和大片吸虫，还可用于片形吸虫病的快速检测研究。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  一种快速鉴别和检测肝片吸虫和大片吸虫的LAMP检测方法和试剂盒

 

<130> 

 

<160>  12   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  肝片吸虫引物F3序列

 

<400>  1

cattaccgac tcagcttgca                                                   20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  肝片吸虫引物B3序列

 

<400>  2

accaaacgtt cggttaaggt                                                   20

 

 

<210>  3

<211>  42

<212>  DNA

<213>  肝片吸虫引物FIP序列

 

<400>  3

gccgaatcaa ccagccctga aaatgacggt ccggtatagg tc                          42

 

 

<210>  4

<211>  40

<212>  DNA

<213>  肝片吸虫引物BIP序列

 

<400>  4

agcggattcc aacttccatg gcacgcgacg ctcatgagat                             40

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  肝片吸虫环引物Loop F序列

 

<400>  5

gatggcgctg gagcgtcgga                                                   20

 

 

<210>  6

<211>  18

<212>  DNA

<213>  肝片吸虫环引物Loop B序列

 

<400>  6

caccgtcctg ctgtctgg                                                     18

 

 

<210>  7

<211>  19

<212>  DNA

<213>  大片吸虫引物F3序列

 

<400>  7

cactgcgaga cactgagtc                                                    19

 

 

<210>  8

<211>  20

<212>  DNA

<213>  大片吸虫引物B3序列

 

<400>  8

gcacacaagt cagtcaagca                                                   20

 

 

<210>  9

<211>  40

<212>  DNA

<213>  大片吸虫引物FIP序列

 

<400>  9

acatatatga gtgcgcccgc gatgatttga gggcacgacc                             40

 

 

<210>  10

<211>  41

<212>  DNA

<213>  大片吸虫引物BIP序列

 

<400>  10

tcgttgggta gtgaacatgg ggacacaaat ggacgcagac a                           41

 

 

<210>  11

<211>  18

<212>  DNA

<213>  大片吸虫环引物Loop F序列

 

<400>  11

tggggtggat ttcctcgc                                                     18

 

 

<210>  12

<211>  20

<212>  DNA

<213>  大片吸虫环引物Loop B序列

 

<400>  12

gtctacaaac gatttattgc                                                   20

Claims (5)

1.一种非诊断目的的快速区分成虫样本、尾蚴或虫卵DNA肝片吸虫和大片吸虫的LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：

  （1）肝片吸虫和大片吸虫成虫样本、尾蚴或虫卵DNA的提取；

（2）采用特异性检测引物应用恒温加热器技术进行扩增；所述肝片吸虫特异性检测引物的序列分别如SEQ IDNO：1～SEQ IDNO：6所示；所述大片吸虫特异性检测引物的序列分别如SEQ IDNO：7～SEQ IDNO：12所示；

  （3）将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察；或者将产物经SYBR green I 显色液显色后，在凝胶成像系统下观察。

2.根据权利要求1所述非诊断目的的快速区分肝片吸虫和大片吸虫的LAMP检测方法，其特征在于步骤（2）所述LAMP扩增条件为：肝片吸虫 LAMP检测温度为61℃，大片吸虫 LAMP检测温度为62℃，分别反应 45分钟。

3.一种实现权利要求1所述方法的LAMP试剂盒，其特征在于包括以下组分： 

（1） DNA裂解液：Nuclei lysis solution、EDTA、蛋白酶 K 和RNase A solution的混合溶液；

（2）LAMP反应液：dATP、dTTP、dGTP、dCTP、betaine、引物FIP、BIP、F3、B3、环引物Loop F、LoopB和MgSO₄的混合溶液；

（3）SYBR green I 显色液：1:10倍稀释液；

（4）肝片吸虫DNA阳性对照和大片吸虫DNA阳性对照。

4.根据权利要求3所述的LAMP试剂盒，其特征在于还含有Bst DNA聚合酶组分。

5.根据权利要求4所述的LAMP试剂盒，其特征在于包括以下组分： 

（1） DNA裂解液，27.5mL: 为100个反应的200μL Nuclei lysis solution、50μL pH 8.0的0.5M的EDTA、20μL 浓度为20mg/mL的蛋白酶 K和5μL浓度为4mg/mL的 RNase A solution的混合溶液；

（2）LAMP反应液，2.5mL：为终浓度200μM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，终浓度0.2mM 的引物FIP、BIP、F3、B3，0.8 μM 环引物Loop F、LoopB，10 μM的betaine，10mM的MgSO₄的混合溶液；

（3）SYBR green I 显色液：1:10倍稀释液；

（4）肝片吸虫和大片吸虫DNA阳性对照100μL和其他吸虫DNA阳性对照100μL；

（5）Bst DNA聚合酶，8U/μL，25μL。

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