CN101182583A - 一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101182583A CN101182583A CNA2007101781906A CN200710178190A CN101182583A CN 101182583 A CN101182583 A CN 101182583A CN A2007101781906 A CNA2007101781906 A CN A2007101781906A CN 200710178190 A CN200710178190 A CN 200710178190A CN 101182583 A CN101182583 A CN 101182583A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- fip
- bip
- primer sets
- mol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种弓形虫的检测试剂盒，其包括如下组分：(1)LAMP反应液；(2)阳性对照；(3)阴性对照；(4)荧光显色剂。本发明还提供了一种应用本发明的弓形虫检测试剂盒检测弓形虫的检测方法。采用本发明的弓形虫检测试剂盒和检测方法，检测灵敏度高，6～10个拷贝即可检测出目的DNA，操作简单方便，特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种基于环介导等温扩增技术的弓形虫的检测试剂盒及其相应的检测方法。
背景技术
弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种人畜共患的原虫病。弓形虫可感染多种动物：45种哺乳动物，70种鸟类和5种冷血动物。猫和猫科动物是弓形虫的终末宿主，在终末宿主体内弓形虫主要侵袭小肠上皮细胞，造成肠道疾病。而在中间宿主体内，如猪、牛、羊等，弓形虫侵入肠壁经血液或淋巴进入单核巨噬细胞系统的细胞内寄生，并扩散到全身各处组织器官，如脑、淋巴结、肝、心、肺、肌肉等，造成全身多器官性的病变，对中间宿主的危害相当大。猪是弓形虫的主要易感动物，据有关报道显示，我国猪场的弓形虫感染率最高，约26.6％，最高可达60％。
弓形虫的现有检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法包括组织学诊断、动物接种试验和细胞培养法。病原学诊断需要一定数量实验动物，而且实验周期较长。血清学诊断方法包括美蓝染色试验(DT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。分子生物学诊断方法主要是聚合酶链式反应(PCR)，该方法比前两种方法快速，灵敏，但需要使用特殊的PCR仪，不适于基层应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)技术的快速检测弓形虫的检测试剂盒及其检测方法。
为了实现本发明的目的，本发明的一种弓形虫检测试剂盒，包括如下组分：
(1)LAMP反应液：23μL LAMP反应液含有0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、0.04μmol的Triton-100、0.1～0.2μmol硫酸镁、5～35μmol甜菜碱、0.02～0.04μmol脱氧核苷酸、0.04～0.06μmol的与弓形虫AF146527基因或B1基因结合的内侧引物对、0.004～0.008μmol的与弓形虫AF146527基因或B1基因结合的外侧引物对、8U的Bst DNA聚合酶和灭菌双蒸水；
(2)阳性对照：弓形虫DNA；
(3)阴性对照：灭菌双蒸水；
(4)荧光显色剂；
其中LAMP反应液∶阳性对照∶阴性对照∶荧光显色剂体积配比为23∶2∶2∶1～3。
所述的内侧引物对为上游内侧引物(FIP)和下游内侧引物(BIP)，所述的外侧引物对为上游外侧引物(F3)和下游外侧引物(B3)。
本发明所述的与弓形虫AF146527基因结合的外侧引物对和与弓形虫AF146527基因结合的内侧引物对为引物组1-7中的一组或两组，其中：
引物组1
F3： SEQ ID NO 3
B3： SEQ ID NO 4
FIP： SEQ ID NO 5
BIP： SEQ ID NO 6；
引物组2：
F3： SEQ ID NO 7
B3： SEQ ID NO 8
FIP： SEQ ID NO 9
BIP： SEQ ID NO 10；
引物组3：
F3： SEQ ID NO 1
B3： SEQ ID NO 11
FIP： SEQ ID NO 12
BIP： SEQ ID NO 13；
引物组4：
F3： SEQ ID NO 14
B3： SEQ ID NO 15
FIP： SEQ ID NO 16
BIP： SEQ ID NO 17；
引物组5：
F3： SEQ ID NO 7
B3： SEQ ID NO 18
FIP： SEQ ID NO 9
BIP： SEQ ID NO 19；
引物组6：
F3： SEQ ID NO 20
B3： SEQ ID NO 21
FIP： SEQ ID NO 22
BIP： SEQ ID NO 23；
引物组7：
F3： SEQ ID NO 24
B3： SEQ ID NO 21
FIP： SEQ ID NO 22
BIP： SEQ ID NO 25。
本发明所述的与弓形虫B1基因结合的外侧引物对和与弓形虫B1基因结合的内侧引物对为引物组8-16中的一组或两组，其中：
引物组8：
F3： SEQ ID NO 26
B3： SEQ ID NO 27
FIP： SEQ ID NO 28
BIP： SEQ ID NO 29；
引物组9：
F3： SEQ ID NO 30
B3： SEQ ID NO 31
FIP： SEQ ID NO 32
BIP： SEQ ID NO 33；
引物组10：
F3： SEQ ID NO 34
B3： SEQ ID NO 35
FIP： SEQ ID NO 36
BIP： SEQ ID NO 37；
引物组11：
F3： SEQ ID NO 38
B3： SEQ ID NO 39
FIP： SEQ ID NO 40
BIP： SEQ ID NO 41；
引物组12：
F3： SEQ ID NO 42
B3： SEQ ID NO 43
FIP： SEQ ID NO 44
BIP： SEQ ID NO 45；
引物组13：
F3： SEQ ID NO 46
B3： SEQ ID NO 47
FIP： SEQ ID NO 48
BIP： SEQ ID NO 49；
引物组14：
F3： SEQ ID NO 50
B3： SEQ ID NO 51
FIP： SEQ ID NO 52
BIP： SEQ ID NO 53；
引物组15：
F3： SEQ ID NO 54
B3： SEQ ID NO 55
FIP： SEQ ID NO 56
BIP： SEQ ID NO 57；
引物组16：
F3： SEQ ID NO 58
B3： SEQ ID NO 59
FIP： SEQ ID NO 60
BIP： SEQ ID NO 61。
其中，所述的内侧引物对和外侧引物对是以上述的引物组所列出的作为为一个整体组使用，而且引物组两组同时使用的时候，应该尽量避免引物二聚体的形成。
本发明所述的脱氧核苷酸包括0.02～0.04μmol脱氧核糖腺嘌呤核苷酸、0.02～0.04μmol脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、0.02～0.04μmol脱氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.02～0.04μmol脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸，其中脱氧核糖腺嘌呤核苷酸∶脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸∶脱氧核糖胞嘧啶核苷酸∶脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸的浓度比为1∶1∶1∶1。
本发明所述的弓形虫AF146527基因序列为SEQ ID NO 1。
所述的引物组1-7与所述的弓形虫AF146527基因上6个特定结合区域分别为：见表1。
表1：引物组1-7与所述的弓形虫AF146527基因的结合区域
| 引物组 | 引物名称 | 6个结合区域 |
| 5′端位置 | 3′端位置 |
| 引物组1： | F3 | 268 | 285 |
| B3 | 457 | 474 | |
| FIP | 299 | 316 | |
| 339 | 358 | ||
| BIP | 437 | 454 | |
| 374 | 394 | ||
| 引物组2： | F3 | 172 | 189 |
| B3 | 353 | 372 | |
| FIP | 190 | 209 | |
| 230 | 251 | ||
| BIP | 330 | 347 | |
| 266 | 287 | ||
| 引物组3： | F3 | 268 | 285 |
| B3 | 462 | 479 | |
| FIP | 300 | 317 | |
| 347 | 368 | ||
| BIP | 438 | 455 | |
| 375 | 395 | ||
| 引物组4： | F3 | 299 | 316 |
| B3 | 503 | 520 | |
| FIP | 317 | 336 | |
| 360 | 381 | ||
| BIP | 470 | 487 | |
| 409 | 428 | ||
| 引物组5： | F3 | 172 | 189 |
| B3 | 370 | 388 | |
| FIP | 190 | 209 | |
| 230 | 251 | ||
| BIP | 347 | 365 | |
| 296 | 315 | ||
| 引物组6： | F3 | 301 | 318 |
| B3 | 492 | 511 | |
| FIP | 329 | 347 | |
| 370 | 391 | ||
| BIP | 474 | 491 | |
| 411 | 431 | ||
| 引物组7： | F3 | 310 | 327 |
| B3 | 492 | 511 | |
| FIP | 329 | 347 | |
| 370 | 391 | ||
| BIP | 458 | 476 | |
| 398 | 418 |
本发明所述的弓形虫B1基因序列SEQ ID NO 2。
所述的引物组8-16与所述的弓形虫B1基因上6个特定结合区域分别为：见表2。
表2：引物组8-16与所述的弓形虫B1基因上的结合区域
| 引物组 | 引物名称 | 结合区域 | |
| 5′端位置 | 3′端位置 | ||
| 引物组8： | F3 | 19 | 38 |
| B3 | 212 | 231 | |
| FIP | 51 | 69 | |
| 102 | 123 | ||
| BIP | 191 | 210 | |
| 140 | 160 | ||
| 引物组9： | F3 | 104 | 123 |
| B3 | 299 | 318 | |
| FIP | 124 | 143 | |
| 165 | 185 | ||
| BIP | 276 | 294 | |
| 220 | 241 | ||
| 引物组10： | F3 | 57 | 75 |
| B3 | 276 | 294 | |
| FIP | 92 | 111 | |
| 141 | 162 | ||
| BIP | 237 | 255 | |
| 178 | 197 | ||
| 引物组11 | F3 | 511 | 530 |
| B3 | 728 | 747 | |
| FIP | 531 | 550 | |
| 572 | 593 | ||
| BIP | 692 | 711 | |
| 650 | 671 | ||
| 引物组12： | F3 | 946 | 963 |
| B3 | 1146 | 1165 | |
| FIP | 965 | 983 | |
| 1005 | 1026 | ||
| BIP | 1120 | 1138 | |
| 1062 | 1082 | ||
| 引物组13： | F3 | 1378 | 1397 |
| B3 | 1547 | 1565 | |
| FIP | 1417 | 1436 | |
| 1459 | 1479 | ||
| BIP | 1526 | 1545 | |
| 1486 | 1505 | ||
| 引物组14： | F3 | 1551 | 1570 |
| B3 | 1746 | 1764 | |
| FIP | 1588 | 1607 | |
| 1633 | 1654 | ||
| BIP | 1718 | 1736 | |
| 1657 | 1677 | ||
| 引物组15： | F3 | 1462 | 1479 |
| B3 | 1673 | 1692 | |
| FIP | 1480 | 1497 | |
| 1525 | 1546 | ||
| BIP | 1641 | 1659 | |
| 1583 | 1604 | ||
| 引物组16： | F3 | 1991 | 2008 |
| B3 | 2190 | 2209 | |
| FIP | 2029 | 2048 | |
| 2069 | 2088 | ||
| BIP | 2161 | 2178 | |
| 2113 | 2134 |
所述的6个特定区域是每组引物相对结合的特定区域。
本发明所述的荧光显色剂为荧光染料SYBR GREEN I。
本发明的一种弓形虫的检测方法，包括下列步骤：
(1)待检样品DNA的提取；
(2)环介导的等温扩增：
在三组装有23μL的LAMP反应液的反应管中分别加入2μL待检样品DNA、2μL已知的弓形虫DNA、2μL灭菌双蒸水，同时在水浴锅上55～65℃放置45～90分钟，取出；
(3)显色检测：
在反应管中加入1～3μL上述的荧光显色剂；优选的在反应管中加入1μL上述的荧光显色剂。装有阳性对照的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照的反应管的颜色为黄色，如果装有待检测样品的反应管颜色为黄色则说明待检样品不含弓形虫，如颜色变为绿色，则说明样品中含有弓形虫。
所述的弓形虫的检测方法，在步骤(2)中，取出前还可以再调水浴锅温度到80～90℃反应2～10分钟，目的是能够终止反应，以便长期保存反应结果。
本发明的反应原理为：
特殊设计一组用于环介导等温扩增的引物，该组引物包括两对引物，即内侧引物对(内侧上游引物和内侧下游引物)和外侧引物对(外侧上游引物和外侧下游引物)。这两对引物可分别与弓形虫基因上不同的6个特定区域结合，在有高度链置换DNA聚合酶的作用下完成对模板DNA的扩增。
扩增过程分为两个阶段：
(1)反应起始阶段
一端内侧引物先与模板结合并启动DNA合成。相同一端的外侧引物随后与模板结合启动DNA合成，并发生链置换释放出含有内侧引物序列的DNA单链。该单链DNA作为模板先后与另一端的内侧引物和外侧引物结合，启动DNA合成并发生链置换，最后形成一个初始的茎环DNA。而后以该茎环DNA为模板进行合成，反应进入循环阶段。
(2)反应循环阶段
内侧引物与初始茎环DNA结合启动链置换DNA合成，最后可产生另一个初始茎环DNA和一个新的两倍茎长度的茎环DNA。这些茎环DNA可作为模板继续与内侧引物结合启动链置换DNA合成，并且每次合成均可使茎环DNA的茎长度成倍增长。经过一个小时的等温扩增，目的DNA可累积109拷贝。
最后通过荧光染料来观察扩增结果。
采用本发明所提供的弓形虫的检测试剂盒检测弓形虫，根据弓形虫基因序列保守区的特定区域设计了两对引物(内侧引物对和外侧引物对)，两对引物和弓形虫基因序列保守区的六个特定区域的序列完全配对，确保反应的彻底进行，也保证了弓形虫检测方法的特异性。
本发明的弓形虫的检测方法检测灵敏度高，可检测出6～10个拷贝的目的DNA。
与PCR检测方法比较，本发明的方法不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属水浴锅即可，并且检测结果使用荧光染料来观察即可，操作简单方便。本发明的弓形虫的检测方法特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
试剂盒的制备：
(1)选用引物组1；
(2)配制LAMP反应液：将0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、0.04μmolTriton x-100、0.1μmolMgSO4、5μmol甜菜碱(Betaine)、0.02umol脱氧核苷酸(dNTPs)、0.04μmol上游内侧引物(FIP)、0.04μmol下游内侧引物(BIP)、0.004μmol上游外侧引物(F3)、0.004μmol下游外侧引物(B3)、8U的Bst DNA聚合酶，其余的为灭菌双蒸水，混合配置23μL LAMP反应液；
(3)阳性对照：2μL弓形虫DNA；
(4)阴性对照：2μL灭菌双蒸水；
(5)1μL荧光染料SYBR GREEN I。
本实施例所用的0.02μmol脱氧核苷酸包括0.02μmol脱氧核糖腺嘌呤核苷酸、0.02μmol脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、0.02μmol脱氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.02μmol脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸。
实施例2
试剂盒的制备：
(1)选用引物组2；
(2)配制LAMP反应液：按照0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、0.04μmol Triton x-100、0.2μmolMgSO4、35μmol甜菜碱(Betaine)、0.04μmol脱氧核苷酸(dNTPs)、0.06μmol上游内侧引物(FIP)、0.06μmol下游内侧引物(BIP)、0.008μmol上游外侧引物(F3)、0.008μmol下游外侧引物(B3)、8U的Bst DNA聚合酶，其余为灭菌双蒸水，配置23μL LAMP反应液；
(3)阳性对照：2μl的弓形虫DNA；
(4)阴性对照：2μl的灭菌双蒸水；
(5)3μl的荧光染料SYBR GREEN I。
本实施例所用的0.04μmol脱氧核苷酸包括0.04μmol脱氧核糖腺嘌呤核苷酸、0.04μmol脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、0.04μmol脱氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.04μmol脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸。
实施例3
试剂盒的制备：
(1)选用引物组3和4；
(2)配制LAMP反应液：按照0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、0.04μmol Tritonx-100、0.2μmol MgSO4、20μmol甜菜碱(Betaine)、0.03μmol脱氧核苷酸(dNTPs)、0.03μmol上游内侧引物(FIP)、0.03μmol下游内侧引物(BIP)、0.006μmol上游外侧引物(F3)、0.006μmol下游外侧引物(B3)和8U的Bst DNA聚合酶；
(3)阳性对照：2μL的弓形虫DNA；
(4)阴性对照：2μL的灭菌双蒸水；
(5)2μL的荧光染料SYBR GREEN I。
本实施例所用的0.03μmol脱氧核苷酸包括0.03μmol脱氧核糖腺嘌呤核苷酸、0.03μmol脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、0.03μmol脱氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.03μmol脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸。
实施例4
除引物序列选用引物组5、引物组6、引物组7、引物组8、引物组9、引物组10、引物组11、引物组12、引物组13、引物组14、引物组15、引物组16中的一组或两组外，其余的步骤同实施例1。
实施例5
选取弓形虫血液为检测对象。
(1)血液DNA的提取：
收集血液，按血液∶抗凝剂＝5∶1的比例加入抗凝剂柠檬酸葡萄糖溶液，4℃下6000r/min离心15min，去除上清液，吸取血细胞约1mL悬浮于15mL裂解液中，并于37℃温育1h，缓慢加入20mg/mL蛋白酶K至100ug/mL，置于50℃水浴中3h，水浴期间间隔5min旋转液体，冷却至室温，加入等体积苯酚，用0.1mol/L Tris-Cl平衡pH8.0，缓慢颠转1h左右使形成乳浊液，室温6500r/min离心15min，收集水相于新离心管。重复苯酚抽提2次。向最后一次抽提的水相中加入0.2倍体积10mol/L醋酸氨以及2倍体积的乙醇，旋转离心管混匀液体，形成沉淀，室温6500r/min离心15min，收集沉淀即为DNA。用70％乙醇洗涤DNA 2次。待乙醇挥发后，加入TE溶解DNA，于4℃保存。
提取的弓形虫DNA含有弓形虫AF146527基因和B1基因上内侧引物对和外侧引物对所结合的6个特定的区域。
(2)环介导的等温扩增
在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL步骤(1)提取得到的弓形虫DNA，做为检测组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL弓形虫DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。上述反应管同时在水浴锅上55℃放置90分钟，取出。
(3)显色检测
在反应管中加入1μL荧光染料SYBR GREEN I。
检测结果：装有阳性对照组的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照组的反应管中的颜色为黄色。装有检测组的反应管的颜色变为绿色，证明样品中含有弓形虫。
其中LAMP反应液、弓形虫DNA、灭菌双蒸水和荧光染料SYBRGREEN I均如实施例1中所述。
本实施例检测的灵敏度：最低可检测到6～10个拷贝的检测DNA。
实施例6
(1)、血液DNA的提取：方法同实施例5。
(2)、环介导的等温扩增：
在3支装有LAMP反应液的反应管中加入2μL步骤(1)提取得到的待检血液DNA，做为检测组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL弓形虫DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。上述反应管同时在水浴锅上65℃放置45min，取出。
(3)、显色检测：
在反应管中加入1μL荧光染料SYBR GREEN I。
检测结果：装有阳性对照组的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照组的反应管中的颜色为黄色，装有检测组的反应管的颜色变为绿色，说明样品中含有弓形虫。
其中LAMP反应液、弓形虫DNA、灭菌双蒸水和荧光染料SYBRGREEN I均如实施例1中所述。
本实施例检测的灵敏度：最低可检测到6～10个拷贝的检测DNA。
实施例7
1、血液DNA的提取：同实施例5。
2、环介导的等温扩增：
在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL步骤(1)提取得到的待检血液DNA，做为检测组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL弓形虫DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。上述反应管同时在水浴锅上60℃放置70min，取出。
3、显色检测：
在反应管中加入3μL荧光染料SYBR GREEN I。
检测结果：装有阳性对照组的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照组的反应管中的颜色为黄色。装有检测组的反应管的颜色变为绿色，说明样品中含有弓形虫。
其中LAMP反应液、弓形虫DNA、灭菌双蒸水和荧光染料SYBRGREEN I均如实施例2中所述。
本实施例检测的灵敏度：最低可检测到6～10个拷贝的检测DNA。
实施例8
1、血液DNA的提取：同实施例5。
2、环介导的等温扩增：
在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL步骤(1)提取得到的待检血液DNA，做为检测组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL弓形虫DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。于水浴锅上65℃放置90min，调水浴锅温度到80℃反应10min，取出。
3、显色检测：
在反应管中加入1μL荧光染料SYBR GREEN I。
检测结果：装有阳性对照组的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照组的反应管中的颜色为黄色。装有检测组的反应管的颜色变为绿色，说明检测组的样品中含有弓形虫。
其中LAMP反应液、弓形虫DNA、灭菌双蒸水和荧光染料SYBRGREEN I均如实施例1中所述。
本实施例检测的灵敏度：最低可检测到6～10个拷贝的检测DNA。
实施例9
1、血液DNA的提取：同实施例5。
2、环介导的等温扩增：
在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL步骤(1)提取得到的待检血液DNA，做为检测组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL弓形虫DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。上述反应管同时在水浴锅上60℃放置70min，调水浴锅温度到90℃反应2min，取出。
3、显色检测：
在反应管中加入2μL荧光染料SYBR GREEN I。
检测结果：装有阳性对照组的反应管的颜色变为绿色，装有阴性对照组的反应管中的颜色为黄色。装有检测组的反应管的颜色变为绿色，说明检测组的样品中含有弓形虫。
其中LAMP反应液、弓形虫DNA、灭菌双蒸水和荧光染料SYBRGREEN I均如实施例3中所述。
本实施例检测的灵敏度：最低可检测到6～10个拷贝的检测DNA。
注：其他组织的DNA可按照本领域常用的方法提取。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法
<130>
<160>61
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>529
<212>DNA
<213>弓形虫
<400>1
ctgcagggag gaagacgaaa gttgtttttt tatttttttt tctttttgtt tttctgattt 60
ttgttttttt tgactcgggc ccagctgcgt ctgtcgggat gagaccgcgg agccgaagtg 120
cgttttcttt ttttgacttt tttttgtttt ttcacaggca agctcgcctg tgcttggagc 180
cacagaaggg acagaagtcg aaggggacta cagacgcgat gccgctcctc cagccgtctt 240
ggaggagaga tatcaggact gtagatgaag gcgagggtga ggatgagggg gtggcgtggt 300
tgggaagcga cgagagtcgg agagggagaa gatgtttccg gcttggctgc ttttcctgga 360
gggtggaaaa agagacaccg gaatgcgatc cagacgagac gacgctttcc tcgtggtgat 420
ggcggagaga attgaagagt ggagaagagg gcgagggaga cagagtcgga ggcttggacg 480
aagggaggag gaggggtagg agaggaatcc agatgcactg tgtctgcag 529
<210>2
<211>2214
<212>DNA
<213>弓形虫
<400>2
gaattcgttc gacagaaagg gagcaagagt tgggactaaa tcgaagctga gatgctcaaa 60
gtcgaccgcg agatgcaccc gcagaagaag ggctgactcg aaccagatgt gctaaaggcg 120
tcattgctgt tctgtcctat cgcaacggag ttcttcccag acgtggattt ccgttggttc 180
cgcctccttc gtccgtcgta atatcaggcc ttctgttctg ttcgctgtct gtctagggca 240
cccttactgc aagagaagta tttgaggtca tatcgtccca tgaagtcgac cacctgtttc 300
ctctcttcac tgtcacgtac gacatcgcat tcaagggaag agatccagca gatctcgttc 360
gtgtattcga gacaagagag gtccgccccc acaagacggc tgaagaatgc aacattcttg 420
tgctgcctcc tctcatggca aatgccagaa gaagggtacg tgttgcatca taacaagagc 480
tgtatttccc gctggcaaat acaggtgaaa tgtacctcca gaaaagccac ctagtatcgt 540
gcggcaatgt gccacctcgc ctcttgggag aaaaagagga agagacgctg ccgctgtttt 600
gcaaatgaaa aggattcatt ttcgcagtac accaggagtt ggattttgta gagcgtctct 660
cttcaagcag cgtattgtcg agtagatcag aaaggaactg catccgttca tgagtataag 720
aaaaaaatgt gggaatgaaa gagacgctaa tgtgtttgca taggttgcag tcactgacga 780
gctcccctct gctggcgaaa agtgaaattc atgagtatct gtgcaacttt ggtgtattcg 840
cagattggtc gcctgcaatc gatagttgac cacgaacgct ttaaagaaca ggagaagaag 900
atcgtgaaag aatacgagaa gaggtacaca gagatagaag tcgctgcgga gacagcgaag 960
actgcggatg acttcactcc cgtcgcacca gcagcagagg agtgccgggc aagaaaatga 1020
gatgcctaga ggagacacag cgtgttatga acaaatctat tgaggtttcg cgaagaggag 1080
ggaacatatt atatacagaa gaagaacaag agacgtgccg catgtcgcta agccatcgga 1140
agggatgctc agaaaatggc acagtatcac attacagttc cgttgattcg tctgatggtg 1200
acgaaagggg aagaatagtt gtcgcaccaa aactggctag ttgttatttt gaagaagacg 1260
agagatggag tgaaccacca aaaatcggag aaaatcgatg gtgtcacgtt ttttgtcaga 1320
cttcactttg tgcagaagca ttgcccgtcc aaactgcaac aactgctcta gcgtgttcgt 1380
ctccattccg tacagtcttc aaaaatacaa aagagaacat tccagcaact tctgcctttg 1440
ttcttttagc ctcaatagca ggatgacgcc tccctcctat ctttcagcca acccagcaaa 1500
caccgacgaa ctctctgtag agtaacaaag agaaggcaaa acgcgccatc acgaacactc 1560
gcagagatga tacagagacg tgtcatcagg acaaggttgg tcgcttaatt ttctgtatat 1620 agcattttta gaatgcacct ttcggacctc aacaaccgtg caaaaggatc gccacctggt 1 6 80
gtctcttcaa gcgtcaaaac gaactatctg tatatctctc aaggaggact ggcaacctgg 1740
tgtcgacaac agaacagctg cagtccggaa atagaaagcc atgaggcact ccaacgggcg 1800
agtagcacct gaggagatac aaactgctaa acggtccggg tgaaacaata gagagtactg 1860
gaacgtcgcc gctactgccc agttgtcatg ccatcgacgt agacccagaa atgaggcgag 1920
aaattaatat tgttagtaaa gcattcaaaa agttccggtc gagaggctaa accacaaaag 1980
tgcaaaccat gcgcagccat cagcttaaca aaagcagttg gtgatggttg cctcgagttc 2040
cttctgaaaa tggattactt catcaacgag cccaccacgc agaatcatgc tttcccagtg 2100
ctaaagcgtt tctaaagtag ccgcacaatg cggaatgcta aggggatcgc ctacgtagca 2160
catgttgtgc ctcacccccc agctcgtgcg ctcattctcc tttcgtgcgc ggct 2214
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
aaggcgaggg tgaggatg 18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
agcctccgac tctgtctc 18
<210>5
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
caggaaaagc agccaagccg ttttgttggg aagcgacgag ag 42
<210>6
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gacaccggaa tgcgatccag atttttcgcc ctcttctcca ctc 43
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gcttggagcc acagaagg 18
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ctttttccac cctccaggaa 20
<210>9
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
atctctcctc caagacggct ggttttgaca gaagtcgaag gggact 46
<210>10
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
tgaaggcgag ggtgaggatg agttttgcca agccggaaac atct 44
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gtccaagcct ccgactct 18
<210>12
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ttccaccctc caggaaaagc agttttttgg gaagcgacga gagt 44
<210>13
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
acaccggaat gcgatccaga cttttctcgc cctcttctcc act 43
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
gttgggaagc gacgagag 18
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
cagtgcatct ggattcct 18
<210>16
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
ccggtgtctc tttttccacc cttttttcgg agagggagaa gatgtt 46
<210>17
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
cctcgtggtg atggcggaga ttttctccct tcgtccaagc ct 42
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tcgcattccg gtgtctctt 19
<210>19
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
gtggttgggaagcgacgagattttcaccctccaggaaaagcag 43
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tgggaagcga cgagagtc 18
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
tggattcctc tcctacccct 20
<210>22
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ggatcgcatt ccggtgtctc ttttttaaga tgtttccggc ttggc 45
<210>23
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
tcgtggtgat ggcggagaga attttcctcc tcccttcgtc caa 43
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
acgagagtcg gagaggga 18
<210>25
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
gacgacgctt tcctcgtggt gttttcaagc ctccgactct gtct 44
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
gggagcaaga gttgggacta 20
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
cagacagcga acagaacaga 20
<210>28
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
tgacgccttt agcacatctg gtttttgatg ctcaaagtcg accgc 45
<210>29
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
tcgcaacgga gttcttccca gttttggcct gatattacga cggac 45
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
cagatgtgct aaaggcgtca 20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
acgtgacagt gaagagagga 20
<210>32
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
aggcggaacc aacggaaatc cttttttgct gttctgtcct atcgc 45
<210>33
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
gttcgctgtc tgtctagggc acttttggtg gtcgacttca tggga 45
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
caaagtcgac cgcgagatg 19
<210>35
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
ggtggtcgac ttcatggga 19
<210>36
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
gtctgggaag aactccgttg cgttttgctg actcgaacca gatgtg 46
<210>37
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
ttccgcctcc ttcgtccgtc ttttctcttg cagtaagggt gcc 43
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
tgtacctcca gaaaagccac 20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
gcgtctcttt cattcccaca 20
<210>40
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
cggcagcgtc tcttcctctt ttttttctag tatcgtgcgg caatgt 46
<210>41
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
agagcgtctc tcttcaagca gcttttatga acggatgcag ttcctt 46
<210>42
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
gcggagacag cgaagact 18
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
actgtgccat tttctgagca 20
<210>44
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
ggcatctcat tttcttgccc ggttttcgga tgacttcact cccgt 45
<210>45
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
gaggtttcgc gaagaggagg gttttcgatg gcttagcgac atgc 44
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
cgtctccatt ccgtacagtc 20
<210>47
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
tctgcgagtg ttcgtgatg 19
<210>48
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
taggagggag gcgtcatcct gttttacatt ccagcaactt ctgcc 45
<210>49
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
agccaaccca gcaaacaccg ttttcgcgtt ttgccttctc tttg 44
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
acgaacactc gcagagatga 20
<210>51
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
actgcagctg ttctgttgt 19
<210>52
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
tgttgaggtc cgaaaggtgc atttttagga caaggttggt cgctta 46
<210>53
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
cgtgcaaaag gatcgccacc tttttgttgc cagtcctcct tgag 44
<210>54
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
gatgacgcct ccctccta 18
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
gcttgaagag acaccaggtg 20
<210>56
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
gcgcgttttg ccttctcttt gttttttctt tcagccaacc cagc 44
<210>57
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
tcatcaggac aaggttggtc gcttttacgg ttgttgaggt ccgaa 45
<210>58
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
gcgcagccat cagcttaa 18
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
cgcacgaaag gagaatgagc 20
<210>60
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
atgattctgc gtggtgggct tttttgcctc gagttccttc tgaa 44
<210>61
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
taaagtagcc gcacaatgcg gattttgggg tgaggcacaa catg 44
Claims (8)
1.一种弓形虫检测试剂盒，包括如下组分：
(1)LAMP反应液：23μL LAMP反应液含有0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、0.04μmol Triton-100、0.1～0.2μmol硫酸镁、5～35μmol甜菜碱、0.02～0.04μm脱氧核苷酸、0.04～0.06μmol的与弓形虫AF146527基因或B 1基因结合的内侧引物对、0.004～0.008μmol的与弓形虫AF146527基因或B1基因结合的外侧引物对、8U的Bst DNA聚合酶和灭菌双蒸水；
(2)阳性对照：弓形虫DNA；
(3)阴性对照：灭菌双蒸水；
(4)荧光显色剂；
其中LAMP反应液∶阳性对照∶阴性对照∶荧光显色剂体积配比为23∶2∶2∶1～3。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的与弓形虫AF146527基因结合的外侧引物对和与弓形虫AF146527基因结合的内侧引物对为引物组1-7中的一组或两组，其中：
引物组1
F3： SEQ ID NO 3
B3： SEQ ID NO 4
FIP： SEQ ID NO 5
BIP： SEQ ID NO 6；
引物组2：
F3： SEQ ID NO 7
B3： SEQ ID NO 8
FIP： SEQ ID NO 9
BIP： SEQ ID NO 10；
引物组3：
F3： SEQ ID NO 1
B3： SEQ ID NO 11
FIP： SEQ ID NO 12
BIP： SEQ ID NO 13；
引物组4：
F3： SEQ ID NO 14
B3： SEQ ID NO 15
FIP： SEQ ID NO 16
BIP： SEQ ID NO 17；
引物组5：
F3： SEQ ID NO 7
B3： SEQ ID NO 18
FIP： SEQ ID NO 9
BIP： SEQ ID NO 19；
引物组6：
F3： SEQ ID NO 20
B3： SEQ ID NO 21
FIP： SEQ ID NO 22
BIP： SEQ ID NO 23；
引物组7：
F3： SEQ ID NO 24
B3： SEQ ID NO 21
FIP： SEQ ID NO 22
BIP： SEQ ID NO 25。
3.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的与弓形虫B1基因结合的外侧引物对和与弓形虫B1基因上结合的内侧引物对为引物组8-16中的一组或两组，其中：
引物组8：
F3： SEQ ID NO 26
B3： SEQ ID NO 27
FIP： SEQ ID NO 28
BIP： SEQ ID NO 29；
引物组9：
F3： SEQ ID NO 30
B3： SEQ ID NO 31
FIP： SEQ ID NO 32
BIP： SEQ ID NO 33；
引物组10：
F3： SEQ ID NO 34
B3： SEQ ID NO 35
FIP： SEQ ID NO 36
BIP： SEQ ID NO 37；
引物组11：
F3： SEQ ID NO 38
B3： SEQ ID NO 39
FIP： SEQ ID NO 40
BIP： SEQ ID NO 41；
引物组12：
F3： SEQ ID NO 42
B3： SEQ ID NO 43
FIP： SEQ ID NO 44
BIP： SEQ ID NO 45；
引物组13：
F3： SEQ ID NO 46
B3： SEQ ID NO 47
FIP： SEQ ID NO 48
BIP： SEQ ID NO 49；
引物组14：
F3： SEQ ID NO 50
B3： SEQ ID NO 51
FIP： SEQ ID NO 52
BIP： SEQ ID NO 53；
引物组15：
F3： SEQ ID NO 54
B3： SEQ ID NO 55
FIP： SEQ ID NO 56
BIP： SEQ ID NO 57；
引物组16：
F3： SEQ ID NO 58
B3： SEQ ID NO 59
FIP： SEQ ID NO 60
BIP： SEQ ID NO 61。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的脱氧核苷酸包括如下组分：0.02～0.04μmol脱氧核糖腺嘌呤核苷酸、0.02～0.04μmol脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸、0.02～0.04μmol脱氧核糖胞嘧啶核苷酸及0.02～0.04μmol脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸，其中脱氧核糖腺嘌呤核苷酸∶脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸∶脱氧核糖胞嘧啶核苷酸∶脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸的浓度比为1∶1∶1∶1。
5.如权利要求1-4任一所述的检测试剂盒，其特征在于所述的荧光显色剂为荧光染料SYBR GREENI。
6.一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒检测弓形虫的方法，其包括下列步骤：
(1)待检样品DNA的提取；
(2)环介导的等温扩增：
在三组装有23μL的LAMP反应液的反应管中分别加入2μL待检样品DNA、2μL弓形虫DNA、2μL灭菌双蒸水，在水浴锅上55～65℃放置45～90分钟，取出；
(3)显色检测：在反应管中加入1～3μL的荧光显色剂。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)中在反应管中加入1μL的荧光显色剂。
8.如权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)还包括调水浴锅温度到80～90℃反应2～10分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007101781906A CN101182583A (zh) | 2007-11-27 | 2007-11-27 | 一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007101781906A CN101182583A (zh) | 2007-11-27 | 2007-11-27 | 一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101182583A true CN101182583A (zh) | 2008-05-21 |
Family
ID=39448008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2007101781906A Pending CN101182583A (zh) | 2007-11-27 | 2007-11-27 | 一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101182583A (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101845505A (zh) * | 2010-06-04 | 2010-09-29 | 中国农业大学 | 用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物 |
| CN102002531A (zh) * | 2010-11-23 | 2011-04-06 | 中国农业大学 | 一种弓形虫检测试剂盒及其应用 |
| CN102021246A (zh) * | 2010-12-02 | 2011-04-20 | 华南农业大学 | 一种快速鉴别和检测肝片吸虫和大片吸虫的lamp检测方法和试剂盒 |
| CN105648104A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-06-08 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法 |
| CN107012237A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-08-04 | 张家港蓝苏生物工程有限公司 | 一种特异性检测弓形虫核酸的荧光pcr方法和试剂盒 |
| CN110117591A (zh) * | 2018-02-05 | 2019-08-13 | 北京智德医学检验所有限公司 | 一种用于鉴定弓形虫的lamp引物组合及其应用 |
| CN110438249A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-11-12 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种弓形虫核酸恒温扩增检测试剂盒及应用方法 |
| CN113718048A (zh) * | 2021-09-28 | 2021-11-30 | 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） | 等温扩增检测刚地弓形虫的试剂、试剂盒及其应用 |
-
2007
- 2007-11-27 CN CNA2007101781906A patent/CN101182583A/zh active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101845505A (zh) * | 2010-06-04 | 2010-09-29 | 中国农业大学 | 用于检测弓形虫的环介导等温扩增反应引物 |
| CN102002531A (zh) * | 2010-11-23 | 2011-04-06 | 中国农业大学 | 一种弓形虫检测试剂盒及其应用 |
| CN102002531B (zh) * | 2010-11-23 | 2013-01-16 | 中国农业大学 | 一种弓形虫检测试剂盒及其应用 |
| CN102021246A (zh) * | 2010-12-02 | 2011-04-20 | 华南农业大学 | 一种快速鉴别和检测肝片吸虫和大片吸虫的lamp检测方法和试剂盒 |
| CN102021246B (zh) * | 2010-12-02 | 2012-11-07 | 华南农业大学 | 一种快速鉴别和检测肝片吸虫和大片吸虫的lamp检测方法和试剂盒 |
| CN105648104A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-06-08 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法 |
| CN107012237A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-08-04 | 张家港蓝苏生物工程有限公司 | 一种特异性检测弓形虫核酸的荧光pcr方法和试剂盒 |
| CN110117591A (zh) * | 2018-02-05 | 2019-08-13 | 北京智德医学检验所有限公司 | 一种用于鉴定弓形虫的lamp引物组合及其应用 |
| CN110438249A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-11-12 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种弓形虫核酸恒温扩增检测试剂盒及应用方法 |
| CN113718048A (zh) * | 2021-09-28 | 2021-11-30 | 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） | 等温扩增检测刚地弓形虫的试剂、试剂盒及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101182583A (zh) | 一种弓形虫的检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN102002531B (zh) | 一种弓形虫检测试剂盒及其应用 | |
| CN101343672B (zh) | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用 | |
| CN104350161A (zh) | 用于核酸分子中的敏感突变检测的组合物和方法 | |
| CN104946749B (zh) | 一种用于现场快速检测布鲁氏菌的通用型引物与探针以及试剂盒 | |
| CN106399486B (zh) | 用于多重pcr检测致腹泻寄生虫的引物组及试剂盒 | |
| CN107586862B (zh) | 肠道菌群在儿童反复呼吸道感染诊断中的应用 | |
| CN102586479B (zh) | 环介导等温扩增禽呼肠孤病毒的引物、禽呼肠孤病毒的检测试剂盒及检测方法 | |
| CN112029900A (zh) | 新型冠状病毒的快速核酸检测方法及检测系统 | |
| CN110564880A (zh) | 检测布鲁氏菌减毒活疫苗株和野毒株的方法及应用 | |
| CN107354238B (zh) | 一种用于检测禽腺病毒iv型的特异性引物及应用 | |
| JP2019062745A (ja) | 蜂病の原因菌を検出する方法及びその検出キット | |
| KR101595016B1 (ko) | 닭의 성별을 감별하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물 및 이를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법 | |
| TWI616535B (zh) | Ｉｂｖ、ｃｓｆｖ及ｎｄｖ之高解析度熔解基因型比對 | |
| CN107299145B (zh) | 用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的引物组及试剂盒 | |
| CN110878380B (zh) | 一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物、试剂盒及方法 | |
| CN103060446A (zh) | Cd157 基因的用途 | |
| KR20220034863A (ko) | 조류 무리에서 조류 병원성 이. 콜라이 (apec) 감염의 위험을 결정하는 방법 | |
| CN111349698A (zh) | 与中枢神经系统感染疾病相关的外泌体内核酸标志物及其应用 | |
| CN110894544A (zh) | 鲑鱼甲病毒（sav）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| Cheggag et al. | Diagnosis of clinical cases of infectious bursal disease using a modified rapid taq man-MGB real-time RT-PCR assay | |
| CN110551821A (zh) | 利用荧光定量pcr检测mef2d基因重排的引物和探针及试剂盒 | |
| CN112458186B (zh) | 一种定量检测弓形虫的引物组及试剂盒和应用 | |
| CN102776275B (zh) | 一种用于结核杆菌目视检测引物组及其试剂盒 | |
| Nefedchenko et al. | Detection and genotyping Pasteurella multocida of five capsular groups in real time polymerase chain reaction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20080521 |