CN101343672B - 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括三对引物，即与猪繁殖与呼吸综合征病毒Gen Bank Accession NumberU87392中MN基因结合的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对。试剂盒还包括环介导等温扩增试剂、阳性对照、阴性对照、和荧光显色剂，阳性对照为猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA。本发明还提供了一种应用本发明的试剂盒检测死亡动物中是否携带猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法。本发明的试剂盒，检测灵敏度高，6-10个拷贝即可检测出目的RNA，操作简单方便，特别适于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖呼吸与综合征病毒引起的，以怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍及仔猪和育肥猪的呼吸道疾病为主要症状的传染病。该病1987年首次在美国报道，此后在加拿大、德国、西班牙、英国也相继报道了该病的发生。1995年，我国大陆发现了此病，且在多个省份开始流行。随后在1996年和1997年相继从疑似的病例中分离到了该病病源。猪繁殖与呼吸综合征病毒现已成为我国危害养猪生产的重要原因之一。另外，动物产品中猪繁殖与呼吸综合征病毒的污染也会带来食品卫生问题。因此，猪繁殖与呼吸综合征病毒的防治、净化需要敏感、特异的检测、诊断技术。
猪繁殖与呼吸综合征病毒的现有检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法包括组织学诊断、动物接种试验和细胞培养法，需要一定数量实验动物，而且实验周期较长。血清学诊断方法包括间接荧光抗体试验(IFAT)、凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。分子生物学诊断方法主要包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)与荧光核酸探针。分子生物学诊断方法比前两种方法快速、灵敏，但需要使用特殊的仪器，如PCR仪，而荧光探针的制备比较昂贵，不适于基层应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测试剂盒。
本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒，包括三对引物，一对引物是与猪繁殖与呼吸综合征病毒Gen Bank Accession Number U87392中MN基因结合的内侧引物对，一对引物是与猪繁殖与呼吸综合征病毒Gen Bank Accession NumberU87392中MN基因结合的外侧引物对，一对引物是与猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank Accession Number U87392中MN基因结合的环形引物对。
上述三对引物针对的MN基因，为国际公认的猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株-VR-2332型毒株的保守基因。猪繁殖与呼吸综合征病毒分为欧洲株与美洲株，我国流行的是美洲株。VR-2332型毒株是美洲株的经典毒株，为鉴定美洲株的国际公认标准株。所以本发明的试剂盒可以检测所有猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株。
上述猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒在使用过程中，所述的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对作为一个整体组使用，使用时应该尽量避免引物二聚体的形成。
所述内侧引物对包括上游引物(FIP)和下游引物(BIP)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物(F3)和下游引物(B3)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物(LF)和下游引物(LB)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。
所述试剂盒还包括环介导等温扩增试剂、阳性对照、阴性对照；所述阳性对照为猪繁殖与呼吸综合征病毒Gen Bank Accession Number U87392的RNA。
所述环介导等温扩增试剂具体可为含有如下溶质的水溶液：Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween20、MgSO4、甜菜碱、脱氧核苷酸、Bst DNA聚合酶和AMV反转录酶。
在所述环介导等温扩增试剂中加入所述内侧引物对、所述外侧引物对及所述环形引物对，形成环介导等温扩增反应液；每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量如下：
Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH4)2SO4 0.25μmol、Tween20 0.025μL、MgSO4 0.2-20μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02-0.04μmol；
每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量优选如下：
Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH4)2SO4 0.25μmol、Tween20 0.025μL、MgSO4 0.2μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02μmol。
所述试剂盒还包括荧光显色剂，任何常规荧光显示剂均可，如荧光染料SYBRGREEN I。
所述环介导等温扩增反应液与所述荧光显色剂的体积比为23∶(1-3)，优选23∶1。
本发明还提供了一种检测死亡动物中是否携带猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，是用所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒对来自死亡动物的样品的总RNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定死亡动物中是否携带猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、20-90分钟。
所述检测死亡动物中是否携带猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法中还包括将进行完所述环介导等温扩增反应的样本80-90℃反应2-10分钟的步骤。
应用本发明提供的试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，可以通过直接检视判断样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒，也可以通过显色检测判断样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒。直接检视时，LAMP反应液∶阳性对照∶阴性对照的体积配比为23∶2∶2。显色检测时，LAMP反应液∶阳性对照∶阴性对照∶荧光显色剂的体积配比为23∶2∶2(1-3)；LAMP反应液∶阳性对照∶阴性对照∶荧光显色剂的体积配比优选为23∶2∶2∶1。
可以通过直接检视判断样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒，也可以通过显色检测判断样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒。
①直接检视
装有阳性对照的反应管有白色沉淀，装有阴性对照的反应管仍为澄清液体。如果装有待检测样品的反应管仍为澄清液体，则说明待检样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。如果装有待检测样品的反应管有白色沉淀，则说明样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阳性。
②显色检测
在反应管中加入荧光显色剂，在紫外灯照射下观察颜色变化。装有阳性对照的反应管颜色为绿色，装有阴性对照的反应管仍为黄色。如果装有待检样品的反应管颜色为黄色，则说明猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。如果装有待检样品的反应管颜色为绿色，则说明样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阳性。
本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的检测原理如下：
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒MN基因序列(序列表的序列1)保守区的特定区域设计了一组用于环介导等温扩增的引物，即内侧引物对(内侧上游引物FIP和内侧下游引物BIP)、外侧引物对(外侧上游引物F3和外侧下游引物B3)和环形引物对(环形上游引物LF和环形下游引物LB)。三对引物和猪繁殖与呼吸综合征病毒MN基因序列保守区的八个特定区域的序列完全配对，确保反应的彻底进行，也保证了猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法的特异性。
F3：SEQ ID NO 2：GGGGGTGTACTCAGCCATAG(序列表的序列2)；
B3：SEQ ID NO 3：ACGAGGCTTTTTAACCCG(序列表的序列3)；
FIP：SEQ ID NO 4：CACTTTCAACGTGGTGGGCATTTTCCTCCAGATGCCGTTTGTG(序列表的序列4)；
BIP：SEQ ID NO 5：GGTTTCATCCGATTGCGGCAAATTTTAATGTGCCGTTGACCGTAG(序列表的序列5)；
LF：SEQ ID NO6：CCAGAATGTACTTGCGGCCTAG(序列表的序列6)；
LB：SEQ ID NO7：ATTTGTCGTCCGGCGTCCC(序列表的序列7)。
所述的引物组与所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒U87392序列中MN基因上8个特定区域结合，见表1
表1 引物组与所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒U87392序列中MN基因的结合区域
上述引物组在AMV反转录酶和具有高度链置换催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成对模板RNA的扩增。扩增过程分为三个阶段，具体如下：
(1)反转录阶段
在AMV反转录酶的作用下，样本RNA被反转录为cDNA。
(2)循环起始阶段
一端内侧引物先与模板结合并启动DNA合成。相同一端的外侧引物随后与模板结合启动DNA合成，并发生链置换释放出含有内侧引物序列的DNA单链。该单链DNA作为模板先后与另一端的内侧引物和外侧引物结合，启动DNA合成并发生链置换，最后形成一个初始的茎环DNA。
(3)反应循环阶段
内侧引物与初始茎环DNA结合，启动链置换DNA合成，可产生另一个初始茎环DNA和一个新的两倍长度的茎环DNA。这些茎环DNA可作为模板继续与内侧引物结合启动链置换DNA合成，并且每次合成均可使茎环DNA的茎长度成倍增长。
进入循环阶段后，会产生许多分子大小不同的茎环DNA，这些茎环DNA还可作为模版与环形引物结合，启动更多的DNA合成并发生链置换。最后经过一个小时的等温扩增，目的DNA可累积109拷贝。
应用本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒进行检测，特异性高且灵敏度高，可检测出6-10个拷贝的目的RNA。与PCR检测方法相比，应用本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒检测，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属或水浴锅即可，并且检测结果使用荧光染料来观察即可，操作简单方便。本发明的试剂盒可应用于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
具体实施方式
本发明提供的试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒可包括如下步骤：
(1)RNA的提取
本发明提供的试剂盒可用于检测各种分泌物中的猪繁殖与呼吸综合征病毒，如血液，肺脏，精液等。不同来源的总RNA提取可参考相应资料，或使用相应RNA提取试剂盒。
(2)环介导的等温扩增
①在装有23μl的LAMP反应液的反应管中加入2μl模板RNA；
②于水浴锅或金属恒温加热器上60-65℃放置20-90分钟，取出。
在步骤②完成后，取出前，还可以再调水浴锅温度到80-90℃反应2-10分钟，目的是能够终止反应，以便长期保存反应结果。
(3)结果判定
可以通过直接检视判断样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒，也可以通过显色检测判断样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒。
①直接检视
装有阳性对照的反应管有白色沉淀，装有阴性对照的反应管仍为澄清液体。如果装有待检测样品的反应管仍为澄清液体，则说明待检样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。如果装有待检测样品的反应管有白色沉淀，则说明样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阳性。
②显色检测
在反应管中加入荧光显色剂，在紫外灯照射下观察颜色变化。装有阳性对照的反应管颜色为绿色，装有阴性对照的反应管仍为黄色。如果装有待检样品的反应管颜色为黄色，则说明猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。如果装有待检样品的反应管颜色为绿色，则说明样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阳性。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
人工合成以下3对引物：
F3：GTGAATTGGAATATGGTAACTGC；
B3：CCATTCCCTGCCATCCTC；
FIP：CGATGGTGAGAGGGTGGATGTTTTCAAACTCCAATAGGGGCG；
BIP：CTTGCGACTGGGCTCAGAAATTTTCTGCTATAGCTCCAAATAGTCC；
LF：TGTGGAATGGCATACTAGAGTT；
LB：AGCCCTCAAGGAGAGAGA。
二、配制LAMP反应液
每23μL LAMP反应液，含有以下组分：0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、Tween20 0.025μL、0.2μmolMgSO4、20μmol甜菜碱(Betaine)、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.04μmol上游内侧引物(FIP)、0.04μmol下游内侧引物(BIP)、0.004μmol上游外侧引物(F3)、0.004μmol下游外侧引物(B3)、0.02μmol上游环形引物(LF)、0.02μmol下游环形引物(LB)、16U的Bst DNA聚合酶、0.2U的AMV反转录酶、灭菌双蒸水。
三、试剂盒的组装
该试剂盒由以下物质组成：步骤二配制的LAMP反应液、猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332型毒株RNA(阳性对照)(美国ATCC菌种库)、灭菌双蒸水(阴性对照)、荧光染料SYBR GREEN I。
实施例2、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
同实施例1的步骤一。
二、配制LAMP反应液
每23μL LAMP反应液，含有以下组分：0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、Tween20 0.025μL、20μmol MgSO4、20μmol甜菜碱(Betaine)、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.06μmol上游内侧引物(FIP)、0.06μmol下游内侧引物(BIP)、0.008μmol上游外侧引物(F3)、0.008μmol下游外侧引物(B3)、0.04μmol上游环形引物(LF)、0.04μmol下游环形引物(LB)、16U的Bst DNA聚合酶、0.2U的AMV反转录酶、灭菌双蒸水。
三、试剂盒的组装
同实施例1的步骤三。
实施例3、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
同实施例1的步骤一。
二、配制LAMP反应液
每23μL LAMP反应液，含有以下组分：0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、Tween20 0.025μL、10μmol MgSO4、20μmol甜菜碱(Betaine)、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.05μmol上游内侧引物(FIP)、0.05μmol下游内侧引物(BIP)、0.006μmol上游外侧引物(F3)、0.006μmol下游外侧引物(B3)、0.03μmol上游环形引物(LF)、0.03μmol下游环形引物(LB)、16U的Bst DNA聚合酶、0.2U的AMV反转录酶、灭菌双蒸水。
三、试剂盒的组装
同实施例1的步骤三。
实施例4、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1只确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。
一、提取总RNA
收集血液，按血液∶抗凝剂＝5∶1的比例加入抗凝剂柠檬酸葡萄糖溶液。用0.25mL全血加0.75mL TRIzol LS Reagent，剧烈振荡，室温放置5min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置10min后，4℃下12000g离心15min，将上层水相转入新离心管；在水相中加入等体积异丙醇，室温沉淀10min后，4℃下12000g离心10min，吸弃上清，加入75％乙醇1mL轻轻振摇后，4℃下7500g离心5min；将沉淀自然风干后，溶于20μL无核酸酶的蒸馏水中，并加0.5μL RNase抑制剂(30U/μL)，所制备RNA应立即进行检测或贮存于-80℃备检。
二、猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测
分别对上述2只猪的RNA样本的进行检测，检测步骤如下：
(1)环介导等温扩增
在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到病猪的RNA样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到健康猪的RNA样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。
上述反应管同时在水浴锅上60℃放置90分钟，取出。
(2)直接检视
结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。健康猪检测组的三个反应管均为澄清液体，病猪检测组的三个反应管均有白色沉淀。
(3)显色检测：
在每个反应管中加入1μL荧光显色剂。
结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。健康猪检测组的三个反应管均为黄色，病猪检测组的三个反应管均变为绿色。
实施例5、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1只确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例2制备的试剂盒对样本进行检测。
一、提取总RNA
同实施例4的步骤一。
二、猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测
分别对上述2只猪的RNA样本的进行检测，每个样本的检测步骤如下：
(1)环介导等温扩增
在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到病猪的RNA样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到健康猪的RNA样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。
上述反应管同时在金属浴锅上65℃放置70分钟，取出。
(2)直接检视
结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。健康猪检测组的三个反应管均为澄清液体，病猪检测组的三个反应管均有白色沉淀。
(3)显色检测：
在每个反应管中加入2μL荧光显色剂。
结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。健康猪检测组的三个反应管均为黄色，病猪检测组的三个反应管均变为绿色。
实施例6、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1只确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例3制备的试剂盒对样本进行检测。
一、提取RNA
同实施例4的步骤一。
二、猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测
分别对上述2只猪的RNA样本的进行检测，每个样本的检测步骤如下：
(1)环介导等温扩增
在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到病猪的RNA样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到健康猪的RNA样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。
上述反应管同时在水浴锅上60℃放置50分钟，取出。
(2)直接检视
结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。健康猪检测组的三个反应管均为澄清液体，病猪检测组的三个反应管均有白色沉淀。
(3)显色检测：
在每个反应管中加入3μL荧光显色剂。
结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。健康猪检测组的三个反应管均为黄色，病猪检测组的三个反应管均变为绿色。
实施例7、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1只确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的死猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。
一、提取总RNA
同实施例4的步骤一。
二、猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测
分别对上述2只猪的RNA样本的进行检测，检测步骤如下：
(1)环介导等温扩增
在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到病猪的RNA样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到健康猪的RNA样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。
上述反应管同时在水浴锅上65℃放置30分钟，调水浴锅温度到80℃反应10min，取出。
(2)直接检视
结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。健康猪检测组的三个反应管均为澄清液体，病猪检测组的三个反应管均有白色沉淀。
(3)显色检测：
在每个反应管中加入3μL荧光显色剂。
结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。健康猪检测组的三个反应管均为黄色，病猪检测组的三个反应管均变为绿色。
实施例8、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1只确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的死猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。
一、提取RNA
同实施例4的步骤一。
二、猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测
分别对上述2只猪的RNA样本的进行检测，检测步骤如下：
(1)环介导等温扩增
在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到病猪的RNA样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到健康猪的RNA样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。
上述反应管同时在水浴锅上60℃放置20分钟，调水浴锅温度到90℃反应2min，取出。
(2)直接检视
结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。健康猪检测组的三个反应管均为澄清液体，病猪检测组的三个反应管均有白色沉淀。
(3)显色检测：
在每个反应管中加入3μL荧光显色剂。
结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。健康猪检测组的三个反应管均为黄色，病猪检测组的三个反应管均变为绿色。
实施例9、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒灵敏度的检测
制备0.5×104拷贝/μL、0.5×103拷贝/μL、0.5×102拷贝/μL、5拷贝/μL和0.5拷贝/μL MN基因的质粒样本。采用实施例3制备的试剂盒对质粒样本进行检测。
一、质粒的制备
使用猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332型毒株RNA制备质粒。根据PCR方法扩增得到VR-2332型毒株MN基因片段，再与T载体连接后即形成所需要的MN基因的质粒，一个质粒分子对应一个拷贝的MN基因。将质粒转入感受态细胞，在合适的条件下培养感受态细胞，质粒可随着感受态细胞的繁殖而复制。最后从感受态细胞中提取纯化MN基因质粒。得到的质粒可通过分光光度计法测定并计算拷贝数浓度。用双蒸水将质粒稀释到所需要的浓度，即0.5×104拷贝/μL、0.5×103拷贝/μL、0.5×102拷贝/μL、5拷贝/μL和0.5拷贝/μL。检测时加入各浓度质粒2μL，每个反应中对应含有104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、10拷贝/μL、1拷贝/μL的质粒样本。
二、猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测
分别对上述各浓度的质粒样本进行检测，检测步骤如下：
(1)环介导等温扩增
在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到0.5×104拷贝/μL的质粒样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到0.5×103拷贝/μL质粒样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到0.5×102拷贝/μL质粒样本，做为检测组3；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到5拷贝/μL质粒样本，做为检测组4；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到0.5拷贝/μL质粒样本，做为检测组5；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。
上述反应管同时在水浴锅上65℃放置50分钟，调水浴锅温度到80℃反应10min，取出。
(2)直接检视
结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。检测组1的三个反应管均有白色沉淀，检测组2的三个反应管均有白色沉淀，检测组3的三个反应管均有白色沉淀，检测组4的三个反应管均有白色沉淀，检测组5的三个反应管均为澄清液体。
(3)显色检测：
在每个反应管中加入3μL荧光显色剂。
结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。检测组1的三个反应管均变为绿色，检测组2的三个反应管均变为绿色，检测组3的三个反应管均变为绿色，检测组4的三个反应管均变为绿色，检测组5的三个反应管均为黄色。
以上结果表明，本发明的试剂盒灵敏度高，可检测出6-10个拷贝的目的DNA。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用
<130>CGGNARY81462
<160>7
<210>1
<211>886
<212>DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus)
<400>1
atggggtcgt ccttagatga cttctgtcat gatagcacgg ctccacaaaa ggtgcttttg 60
gcgttttcta ttacctacac gccagtgatg atatatgccc taaaggtgag tcgcggccga 120
ctgctagggc ttctgcacct tttgatcttc ctgaattgtg ctttcacctt cgggtacatg 180
actttcgcgc actttcagag tacaaataag gtcgcgctca ctatgggagc agtagttgca 240
ctcctttggg gggtgtactc agccatagaa acctggaaat tcatcacctc cagatgccgt 300
ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgttga aagtgccgca 360
cggtttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggctcc 420
actacggtca acggcacatt ggtgcccggg ttaaaaagcc tcgtgttggg tggcagaaaa 480
gctgttaaac agggagtggt aaaccttgtc aaatatgcca aataacaacg gcaagcagca 540
gaagagaaag aagggggatg gccagccagt caatcagctg tgccagatgc tgggtaagat 600
catcgctcag caaaaccagt ccagaggcaa gggaccggga aagaaaaata agaagaaaaa 660
cccggagaag ccccattttc ctctagcgac tgaagatgat gtcagacatc actttacccc 720
tagtgagcgg caattgtgtc tgtcgtcaat ccagaccgcc tttaatcaag gcgctgggac 780
ttgcaccctg tcagattcag ggaggataag ttacactgtg gagtttagtt tgcctacgca 840
tcatactgtg cgcctgatcc gcgtcacagc atcaccctca gcatga 886
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gggggtgtac tcagccatag 20
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
acgaggcttt ttaacccg 18
<210>4
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cactttcaac gtggtgggca ttttcctcca gatgccgttt gtg 43
<210>5
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ggtttcatcc gattgcggca aattttaatg tgccgttgac cgtag 45
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ccagaatgta cttgcggcct ag 22
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
atttgtcgtc cggcgtccc 19
Claims (11)
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒，包括三对引物，一对引物是与猪繁殖与呼吸综合征病毒Gen Bank Accession Number U87392中MN基因结合的内侧引物对，一对引物是与猪繁殖与呼吸综合征病毒Gen Bank Accession Number U87392中MN基因结合的外侧引物对，一对引物是与猪繁殖与呼吸综合征病毒Gen BankAccession Number U87392中MN基因结合的环形引物对；所述内侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括环介导等温扩增试剂、阳性对照、阴性对照；所述阳性对照为猪繁殖与呼吸综合征病毒Gen BankAccession Number U87392的RNA。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增试剂为含有如下溶质的水溶液：Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween20、MgSO4、甜菜碱、脱氧核苷酸、Bst DNA聚合酶和AMV反转录酶。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：在所述环介导等温扩增试剂中加入所述内侧引物对、所述外侧引物对及所述环形引物对，形成环介导等温扩增反应液；每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量如下：
Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH4)2SO4 0.25μmol、Tween20 0.025μL、MgSO4 0.2-20μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02-0.04μmol。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述MgSO4 0.2μmol，所述内侧引物对的上游引物和下游引物0.04μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物0.004μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物0.02μmol。
6.如权利要求1至5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光显色剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光显色剂为荧光染料SYBRGREEN I。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增反应液与所述荧光显色剂的体积比为23∶(1-3)。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增反应液与所述荧光显色剂的体积比为23∶1。
10.一种检测死亡动物中是否携带猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，是用权利要求1至9中任一所述的试剂盒对来自死亡动物的样品的总RNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定死亡动物中是否携带猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、20-90分钟。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述检测死亡动物中是否携带猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法中还包括将进行完所述环介导等温扩增反应的样本80-90℃反应2-10分钟的步骤。
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