CN102344974A

CN102344974A - 鸡传染性贫血病毒lamp检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN102344974A
Application number: CN2011103723916A
Authority: CN
Inventors: 王旋; 张训海; 龚争; 赵磊; 王军; 汪小红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-11-22
Filing date: 2011-11-22
Publication date: 2012-02-08

Abstract

本发明公开一种鸡传染性贫血病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法，涉及生物技术领域。选取鸡传染性贫血病毒基因序列532bp～729bp位的198个高度保守的核苷酸序列为靶区域，设计特异性LAMP引物组，包括正反向外引物F3、B3，正反向内引物FIP、BIP，正反向环引物LF、LB，其核苷酸序列为SEQNO1～6所示。用上述引物组在1小时内可完成所述靶区域的高效扩增，并根据条件通过产物染色琼脂糖电泳/检测副产物焦磷酸镁沉淀浊度/加入显色剂后观察颜色反应进行结果的判定。本发明形成的试剂盒具有方便、快速、价廉，特异性强的优点，适用于鸡传染性贫血的临床诊断与监测。

Description

鸡传染性贫血病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及鸡传染性贫血病毒的生物学鉴定方法，特别涉及对鸡传染性贫血病毒特定基因片段具有特异性的引物组，还涉及将所述引物组用环介导等温扩增法快速检测鸡传染性贫血病毒的试剂盒。

背景技术

鸡传染性贫血病毒( Chicken anemia virus，CAV) 是鸡传染性贫血病( Chicken infectious anemia，CIA) 的病原。CAV 感染可引起雏鸡骨髓造血组织和胸腺等淋巴组织萎缩, 从而导致严重贫血和免疫抑制，引起继发感染和疫苗免疫失败。我国于1992 年首次在黑龙江省分离到CAV，目前该病在我国流行范围不断扩大、感染率增高的趋势。

鸡贫血病毒是目前已知最小的动物病毒之一, 为单股环状DNA, 基因组长度为2.3 kb。CAV基因组单链有3个部分或完全重叠的开放阅读框( ORF)，分别编码核衣壳蛋白VP1、相关蛋白VP2、细胞凋亡因子VP3 3 种蛋白。至今发现的所有CAV 毒株的抗原性都相同, 均属于同一个血清型。

环介导等温扩增法(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi 等于2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶序列的6 个特异性区域设计两对引物，利用一种具有链置换活性的DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件下(65 ℃左右) 保温30～60 min ，即可实现核酸的大量扩增，并且伴有肉眼可见的副产物白色焦磷酸酶沉淀产生。此外，还可以向产物中加入DNA荧光染料的方法进行判定。该项技术已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等病原检测和胚胎性别的鉴定。

对CAV的诊断有血清学和分子生物学等多种方法，其中LAMP法具有特异性高、操作简便、不需特殊设备等优点在临诊应用上优势明显。目前，已公开的与本专利相关的针对CAV检测的LAMP引物组如：“一种快速检测鸡传染性贫血病毒的方法及试剂盒”（专利申请号为200810223382.9），其引物组位于CAV基因序列的491bp～732bp位点之间。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鸡传染性贫血病毒的检测方法，要求具有特异性高、操作简便、不需特殊设备，在兽医临床诊断或检疫中应用强的特点。

为解决上述技术问题，本发明公开一种通过环介导的核酸等温扩增技术快速检测鸡传染性贫血病毒基因的特异性引物组，并提供利用上述引物组快速、高效、特异性地检测鸡传染性贫血病毒的方法，以及利用上述方法制备的快速检测试剂盒。

本发明的上述内容是通过以下方案实现：

一、本发明的鸡传染性贫血病毒基因检测用引物组，是基于基于环介导的核酸等温扩增技术，根据Genebank上已公开的鸡传染性贫血病毒基因组序列，经比对后选取高度同源的基因组序列，以65个国内外CAV毒株100％同源的基因序列532bp～729bp位的198个核苷酸序列为靶区域，设计特异性LAMP引物组，通过LAMP法特异性扩增来鉴定鸡传染性贫血病毒基因。

所述65个国内外CAV毒株Genebank登录号如附录表2所示。

所述特异性LAMP引物组包括以下6条引物：

正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；

反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；

正向内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；

反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；

正向环引物LF，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；

反向环引物LB，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。

二、本发明的鸡传染性贫血病毒快速检测方法，是采用上述引物组对待测样品的DNA进行环等温扩增，反应体系与条件为范围值内的变量；反应产物是通过产物琼脂糖凝胶电泳，阳性反应呈现梯状带；或加入Mg²⁺，检测副产物焦磷酸镁沉淀物的浊度；或加入显色剂，根据颜色变化来判断反应结果。

具体检测方法为：

（1）样品处理和模板提取，样品范围适用于组织病料、细胞培养上清、血清等病毒待检样品。取适量样品（可适量加入碱液稀释，使pH 8.3～9.3）煮沸裂解后，离心取上清作为LAMP模板。

（2）鸡传染性贫血病毒的环介导等温扩增

取模板、扩增反应液和酶，最后加入双蒸水至25μL，60℃～66℃保温30min～70min，反应结束后置于90℃下5min灭活酶。反应体系如下：

所述25μL的LAMP扩增体系中各组分的含量为：

待检测核酸模板（DNA） 1.0～5.0μL

正向外引物F3 0.1～0.8 μM

反向外引物B3 0.1～0.8 μM

正向内引物FIP 0.2～1.4 μM

反向内引物BIP 0.2～1.4 μM

正向环引物LF 0.0～0.5μM

反向环引物LB 0.0～0.5μM

甜菜碱betaine 0.2～1.4μM

dNTP 0.4～1.6mM

MgCl₂ 1.0～3.5mM

反应缓冲液Buffer 10× 1/10总反应体积

Bst DNA Polymerase 0.08～1.0μL

ddH₂O 加至25μL

三、依据上述检测方法，本发明还提供一种鸡传染性贫血病毒基因的快速检测试剂盒，该试剂盒包括：

a．反应液：含鸡传染性贫血病毒基因检测用引物组的混合液，同时包含除聚合酶以外的LAMP反应体系中所有需要试剂及缓冲液；

引物组包括：正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；正向内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；正向环引物LF，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；反向环引物LB，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。

反应液的试剂及缓冲液包括：甜菜碱Betaine、dNTP 、MgCl₂、反应缓冲液Buffer 10×。

b．阴阳性对照品：阳性对照品为携带鸡传染性贫血病毒靶基因克隆的质粒DNA，阴性对照品为ddH₂O。

c．Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。

d．显色剂：SYBR Green I或EvaGreen，优选SYBR Green I。

所述试剂盒25μL的LAMP扩增反应体系为：

反应液 15μL

Bst DNA Polymerase 1.0μL

待检测模板（DNA） 1.0 μL～5.0μL

ddH₂O 补至25μL

所述试剂盒LAMP优选扩增条件为：反应温度为65℃，反应时间为60min。

本发明采用环介导等温扩增技术，与其它检测技术相比，本发明具有以下特点：

1．本发明设计的LAMP引物组的设计是其技术的关键，通过选择目前GeneBank已公布的CAV基因序列进行比对，选择高度保守区域进行引物设计，同时只有在前4 种特异引物完全识别靶基因的6个区域情况下才能顺利扩增，从而保证了其对传染性贫血病毒基因扩增的特异性和检测的全面性；此外，还设计了一对环引物，以提高其扩增效率；

2. 本发明的快速检测方法，其检测灵酶度较普通PCR高，扩增模板浓度仅需10个考贝或更小，检测效率可达10⁹～10¹⁰ 个数量级；

3. 本发明采用LAMP技术，采用等温扩增，不需特殊仪器或设备，只需放在一个60～66℃恒温环境中，30～70min即可完成靶基因的高效扩增；扩增产物进行显色反应，阴阳性结果差异显著，肉眼可直接进行结果的判定；

4. 本发明的鸡传染性贫血病毒基因快速检测试剂盒具有操作简单、特异性高、不需特殊设备，成本低廉，结果易判定，适用于现场快速检测、基层兽医临床诊断或疫病的监测。

附图说明：

图1：CAV的LAMP引物设计示意图

斜体加粗内容分别为PstI和BgⅢ限制性酶切位点。

图2：重组质粒酶切鉴定结果

M：DNA Maker DL2000；1：pMD18-CAV-2重组质粒；2：pMD18-CAV-2酶切鉴定结果。

图3：鸡传染性贫血病毒分离毒株LAMP检测结果

M：DNA Maker DL2000；1： AH10-1 CAV分离株；2：重组质粒pMD18-CAV LAMP检测结果；3：阴性对照结果。

图4：鸡传染性贫血病毒分离毒株LAMP扩增产物SuperGreen I荧光试剂染色白光观察结果

1：有环引物的CAV LAMP扩增；2：无环引物的CAV LAMP扩增；3：阴性对照。

图5：鸡传染性贫血病毒LAMP反应酶切鉴定结果

M：DNA Maker DL2000；1：PstI酶切鉴定结果（233bp和169bp）；BgⅢ酶切鉴定结果（147bp和61bp）。

图6：鸡传染性贫血病毒不同Tm值LAMP反应的结果

M：DNA Maker DL2000；1～7：Tm值分别为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃ LAMP反应结果。

图7：鸡传染性贫血病毒不同反应时间LAMP反应的结果

M：DNA Maker DL2000；1～7：Tm值分别为10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min LAMP反应结果。

图8：鸡传染性贫血病毒不同Betaine浓度LAMP反应的结果

M：DNA Maker DL2000；1～7：分别为1.0μL、2.0μL、3.0μL、4.0μL、5.0μL、6.0μL、7.0μL Betaine LAMP反应结果。

图9：鸡传染性贫血病毒不同正反向外引物浓度LAMP反应的结果

M：DNA Maker DL2000；1～7：分别为0.25μL、0.5μL 、0.75μL、1.0μL、1.25μL、1.5μL、2.0μL正反向外引物LAMP反应结果。

图10：鸡传染性贫血病毒不同正反向内引物浓度LAMP反应的结果

M：DNA Maker DL2000；1～7：分别为0.5μL、1.0μL、1.5μL、2.0μl、2.5μL、3.0μl、3.5μL正反向外引物LAMP反应结果。

图11：鸡传染性贫血病毒不同正反向环引物浓度LAMP反应的结果

M：DNA Maker DL2000；1～7：分别为0μL、0.25μL、0.5μL、0.75μL、1.0μL、1.25μL、1.5μL 正反向外引物LAMP反应结果。

图12：鸡传染性贫血病毒不同Mg^2＋浓度LAMP反应的结果

M：DNA Maker DL2000；1～7：分别为0.5μL、1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL、3.5μL 25mM的MgCl₂ LAMP反应结果。

图13：鸡传染性贫血病毒不同dNTP浓度LAMP反应的结果

M：DNA Maker DL2000；1～7：分别为1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL、3.5μL、4.0μL 10mM dNTP的LAMP反应结果。

图14：鸡传染性贫血病毒不同浓度DNA聚合酶LAMP反应的结果

M：DNA Maker DL2000；1～7：Bst DNAPolymerase酶(8U/μL)分别为0.25μL、0.5μL、1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL的 LAMP反应结果。

图15：鸡传染性贫血病毒LAMP反应常见致病菌鉴别诊断的结果

M：DNA Maker DL2000；1：阳性对照反应结果；2：阴性对照反应结果；3～6：分别大肠杆菌、葡萄球菌、粪肠球菌、巴氏杆菌的LAMP反应结果。

图16：鸡传染性贫血病毒LAMP反应常见动物病毒鉴别诊断的结果

M：DNA Maker DL2000；1：阳性对照反应结果；2：阴性对照反应结果；3～7：分别为NDV、AIV、IBDV、MDV、ALV-J LAMP检测结果。

图17：感染鸡传染性贫血病毒病临床样品LAMP反应的结果

M：DNA Maker DL2000；1～6：感染CAV阳性鸡血液、脾脏、骨髓、心脏、肝脏、肾脏病料样品LAMP反应结果：7：阴性对照反应结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，但所述具体实施例不以任何形式限定本发明。

实施例一：鸡传染性病毒（CAV）LAMP方法的建立与反应条件的优化

1. pMD18-CAV克隆及质粒模板的构建

1.1实验材料

1.1.1病毒毒株：

CAV分离株AH10-1，由家禽疫病防控监测安徽省重点实验室保存。

1.1.2质粒载体和受体菌株

质粒载体：pMD18-T Vector Kit购自TaKaRa公司。

受体菌株：感受态大肠杆菌DH5a购自南京天为时代生物科技有限公司。

1.1.3培养基

LB液体培养基：称取胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠10g，置于1L烧杯中，加入800mL去离子水，充拌溶解；滴加5mol/L NaOH(约0.2mL)，调pH至7.0；加去离子水定容至1L，高压灭菌后，4℃冰箱保存备用。

LB固体培养基：LB液体培养基的基础上加入1.5%的优质琼脂粉，高压灭菌后，冷至约60℃时加入终浓度为160U/ml的氨苄青酶素钠，混匀后倒入平皿中，4℃冰箱保存备用。

1.1.4聚合酶及其它工具酶

pfμ DNA 聚合酶、普通Taq DNA 聚合酶购自Invitrogen公司。

1.1.5试剂盒

Gel Extraction Kit（50）及Pasmid Mini Kit I（100）购自OMEGA Bio-tek公司；pMD18-T Vector Kit（20）购自TaKaRa公司。

1.1.6缓冲液及其它试剂

50×TAE（Tris-乙酸）：24.2 g Tris碱，5.71 g冰乙酸，10 mL 500 mmol/L EDTA(pH8.0),离子水定容至100 mL，工作液为1×TAE。

6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。

1.0%琼脂糖凝胶：称取1.0 g琼脂糖溶于100 mL 1×TAE电泳缓冲液，熔化稍冷加入1μL 10000x EB染色剂，混匀后制胶。

TE Buffer：10 mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)，121℃高压灭菌20 min。

ITPG：IPTG(20%，m/V，0.8mol/L)，称取10g异丙基硫代-B-D半乳糖苷（IPTG），加入40mL灭菌水，用蒸馏水定容至50mL，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装成1mL小份，贮存于-20℃冰箱备用。

X-gal：X-Gal(20mg/mL)，称取1g X-gal置于50mL容量瓶中，加入40mL DMF(二甲基酰胺)，充分混匀溶解后定容至50mL，用0.22μm过滤器过滤除菌，小瓶分装后于-20℃冰箱备用。

氨苄青霉素： Amp（100mg/mL）称取5g Amp置于50 mL容量瓶中，加入40 mL灭菌水，充分混合溶解后，定容至50mL，22μm过滤器过滤除菌，分装成1mL小份，贮存于-20℃冰箱备用。

其它试剂均为国产分析纯。

1.2实验方法

1.2.1病毒DNA的提取

将含毒组织剪碎、匀浆，－20℃充分反复冻融三次，5000×g离心5min，取上清；

②取上清300μL加入等体积的Tris平衡酚，充分混匀， 12000rpm离心10min，取上清；加入等体积的Tris平衡酚和氯仿（1:1），充分混匀， 12000rpm离心10min，取上清；加入等体积的氯仿，充分混匀， 12000rpm离心10min，取上清；

③加入两倍体积的冰冻无水乙醇，轻轻混匀，于-20⁰C沉淀30min,然后12000rpm离心5min,

倒液体，70%乙醇润洗两次，倾去，自然凉干；

④用50μL TE溶解沉淀于4℃保存备用。

1.2.2 LAMP检测用阳性CAV模板的引物设计与PCR扩增

引物序列如下：

上游引物：5'-GTA GCG CAA GGC ACA AAT AAG-3'

下游引物：5'-CAG CCA CAC AGC GAT AGA G-3'，预计扩增片段长度为1106bp。

1.2.3目的基因的PCR扩增

按常规20μL体系进行PCR扩增，扩增体系如下：

模板DNA 5.0μL

10×Buffer 2.0μL

10μM的上游引物 1.0μL

10μM的下游引物 1.0μL

10mM的dNTP 0.8μL

5μ/μL的Taq酶 0.5μL

ddH₂O加至 20μL

反应条件如下：

95℃ 5min

94℃ 50ｓ

57℃ 50ｓ

72℃ 1min， 30 cycles，

72℃ 10min，4℃保存。

1.2.4 pMD18-CAV重组载体的构建

将扩增产物纯化后克隆到pMD18-T上，构建重组载体。

1.2.4.1 PCR产物的纯化与回收

按OMEGA Bio-tek公司胶回收试剂盒说明书方法回收胶中的DNA，暂放4℃保存，步骤（略）。

1.2.4.2 PCR产物连入T载体

将上述胶回收产物连接T载体pMD-18T中，连接的反应体系（10μL）如下：

T-Vector 0.5μL

胶回收产物 1.0μL

Solution I 5.0μL

ddH₂O 3.5μL

混匀后放置16℃保温瓶中水浴30min。

1.2.4.3 转化

从-70℃冰箱中取出1支100μL的DH5a感受态细胞，于冰水浴中4℃冰箱放置10min，将上述连接产物10μL加入100μL感受态细胞中，轻轻混匀后冰水浴30min，42℃热休克90s，立即放于冰浴中3min，加入800μL LB液体培养基，于37℃振荡培养箱孵育45min至1h，5000rpm/min离心5min，弃去大部分上清，留100μL重悬培养物，均匀地涂布于含Amp+ 、X-gal和ITPG的LB琼脂平板（LB平板预先于37℃温育10min）上。待吸收完全，置37℃培养箱培养12～16h（内置湿盒），根据蓝白斑挑选重组子。

1.2.4.4 阳性克隆菌的筛选与鉴定

从平板上随机挑取白色单个菌落，分别接种到含5ml的LB液体培基（含Amp 160U/ml）的灭菌试管中，37℃振摇培养12～16h，对摇菌样品进行菌液PCR的鉴定，选择鉴定阳性菌液进行测序，质粒命名为pMD18-CAV-2。

1.2.5 重组质粒pMD18-CAV-2的提取及酶切鉴定

对测序正确的菌液进行扩增，37℃振摇培养12～16h后，按OMEGA Bio-tek公司质粒小量提取试剂盒说明书方法提取质粒DNA，－20℃保存，步骤（略）。重组质粒进行EcorI和SalI双酶切，其鉴定结果如图2所示。

2. 鸡传染性病毒（CAV）LAMP检测方法的建立

2.1材料与试剂

2.1.1菌毒株

CAV分离株AH10-2和pMD18-CAV-2菌毒株由家禽疫病防控监测安徽省重点实验室保存。

2.1.2聚合酶及其它工具酶

Bst DNA 聚合酶大片段，购自New England Biolabs公司；限制性内切酶PstI和BgⅢ购自MBI Fermaters公司。

2.2 方法

2.2.1鸡传染性贫血病毒LAMP引物的设计

对已登录的GeneBank的CAV分离株，从中选择同源较高的区域进行LAMP引物组的设计。通过同源性比对最终确定以目前GeneBank中65个分离株100％同源的

基因序列532bp～729bp位198bp核苷酸序列设计引物。引物设计是通过Primer Explorer V4软件进行在线设计的。

首先设计四条LAMP引物，即一条正向正向外引物F3、一条反向外引物B3、一条正向内引物FIP、一条反向内引物BIP，其中FIP由F1和F2组成，BIP由B1c和B2c组成；然后设计环引物（Loop Primer），利用上一步生成的Primer Information File，再次输入环引物所需参数，选择合适的环引物，即一条正向环引物LF和一条反向环引物LB。（注：F1是F1c的互补序列；B1是B1c的互补序列；B3是B3c的互补序列；）

CAV的 LAMP组引物序列和位置如图1所示。用于设计引物的核苷酸序列及酶切位点已用实线和黑体标出。引物合成由生物工程（上海）生物科技有限公司。

2.2.2鸡传染性贫血病毒LAMP的反应体系及条件

以构建的pMD18-CAV为模板，设计总体积为25μL的反应体系，具体内容包括：

待检测核酸模板（DNA） 0.2μL

正向外引物F3 （10μM） 2.0 μL

反向外引物B3（10μM） 2.0 μL

正向内引物FIP（100μM） 0.4 μL

反向内引物BIP（100μM） 0.4μL

正向环引物LF（10μM） 1.0μL

反向环引物LB（10μM） 1.0μL

甜菜碱betaine（10μM） 5.0μL

dNTP（10mM） 4.0μL

MgCl₂ （25mM） 2.5μL

反应缓冲液Buffer 10× 2.5μL

Bst DNA Polymerase （8U/μL） 2.0μL

ddH₂O 2.0μL

反应条件为：65℃保温30min，90℃保温5min终止反应。

反应结束后，通过2%凝胶100V电泳40min，观察结果，如图3所示；反应液中加入SYBR Green I，紫外灯下观察并拍照，如图4所示。

2.2.3鸡传染性贫血病毒LAMP产物的酶切鉴定

通过LAMP反应产物的酶切鉴定可以进一步确实所扩增的靶基因。根据在正反向

内引物FIP和BIP上分别存在PstI和BgⅢ酶切位点，预测PstI酶切产物分别为169bp和233bp两种片段，BgⅢ酶切产物分别为61bp和147bp两种片段。结果如图5所示，与预期结果一致。

限制性内切酶PstI 、BgⅢ 反应体系（10μL）如下：

LAMP产物 5.0μL

BgⅢ或PstI 1.0μL

10×Buffer R 1.0μL

ddH2O 3.0μL

37℃水浴2h，1%琼脂糖凝胶电泳40min，观察并记录结果。

2.2.4鸡传染性贫血病毒LAMP反应条件的优化

只选择反应体系中的一个/组条件进行梯度变化，其它条件不变，进行鸡传染性贫血病毒LAMP反应条件的优化。

①鸡传染性贫血病毒LAMP不同Tm值条件的优化

反应混合液分别在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃的温度条件下保温60min，然后迅速加热至90℃，反应5min终止。反应结束后取10μL反应产物与2μL的6倍溴酚蓝上样缓冲液混合，加入含EB的1％凝胶电泳40min，通过凝胶成像系统观察并拍照，结果如图6所示，根据电泳结果决定优化条件；

②鸡传染性贫血病毒LAMP不同反应时间的优化

反应混合液在65℃温度条件下分别保温10min、 20min、30min、40min、50min、60min、70min，然后迅速加热至90℃，反应5min终止。电泳及观察操作同2.2.3中的①，结果如图7所示，根据电泳结果决定优化条件；

③ 感染鸡传染性贫血病毒LAMP不同Betaine的浓度优化

25μL反应混合液中分别加入1.0μL、2.0μL、3.0μL、4.0μL、5.0μL、6.0μL、7.0μL 5μΜ的Betaine，在65℃温度条件下分别保温60min，然后迅速加热至90℃，反应5min终止。电泳及观察操作同2.2.3中的①，结果如图8所示，根据电泳结果决定优化条件；

④ 鸡传染性贫血病毒LAMP不同正反向外引物浓度的优化

25μL反应混合液中分别加入0.25μL、0.5μL 、0.75μL、1.0μL、1.25μL、1.5μL、2.0μL 10μΜ的正反向外引物，在65℃温度条件下分别保温60min，然后迅速加热至90℃，反应5min终止。电泳及观察操作同2.2.3中的①，结果如图9所示，根据电泳结果决定优化条件；

⑤ 鸡传染性贫血病毒LAMP不同正反向内引物浓度的优化

25μL反应混合液中分别加入0.5μL、1.0μL、1.5μL、2.0μl、2.5μL、3.0μl、3.5μL 10μΜ的正反向内引物，在65℃温度条件下分别保温60min，然后迅速加热至90℃，反应5min终止。电泳及观察操作同2.2.3中的①，结果如图10所示，根据电泳结果决定优化条件；

⑥ 鸡传染性贫血病毒LAMP不同正反向环引物浓度的优化

25μL反应混合液中分别加入0μL、0.25μL、0.5μL、0.75μL、1.0μL、1.25μL、1.5μL 10μΜ的正反向外引物，在65℃温度条件下分别保温60min，然后迅速加热至90℃，反应5min终止。电泳及观察操作同2.2.3中的①，结果如图11所示，根据电泳结果决定优化条件；

⑦ 鸡传染性贫血病毒LAMP不同不同的Mg²⁺浓度的浓度优化

25μL反应混合液中分别加入0.5μL、1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL、3.5μL 25mM的MgCl₂，在65℃温度条件下分别保温60min，然后迅速加热至90℃，反应5min终止。电泳及观察操作同2.2.3中的①，结果如图12所示，根据电泳结果决定优化条件。

⑧ 鸡传染性贫血病毒LAMP不同dNTP浓度的优化

25μL反应混合液中分别加入1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL、3.5μL、4.0μL 10mM的dNTP，在65℃温度条件下分别保温60min，然后迅速加热至90℃，反应5min终止。电泳及观察操作同2.2.3中的①，结果如图13所示，根据电泳结果决定优化条件。

⑨ 鸡传染性贫血病毒LAMP不同DNA聚合酶的浓度优化

25μL反应混合液中分别加入0.25μL、0.5μL、1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL 8U/μL的Bst DNAPolymerase酶，在65℃温度条件下分别保温60min，然后迅速加热至90℃，反应5min终止。电泳及观察操作同2.2.3中的①，结果如图14所示，根据电泳结果决定优化条件。

实施例2 鸡传染性贫血病毒LAMP在鉴别诊断中的应用

1.材料与试剂

1.1病毒（菌）株

CAV分离株及含目的基因的CAV克隆菌株pMD18-CAV-2均由本实验室保存。

1.2对照（菌）毒株

细菌对照组：大肠杆菌、葡萄球菌、粪肠球菌、多杀性巴氏杆菌。

病毒对照组：鸡新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡马立克氏病病毒（MDV-1）、J亚型禽白血病病毒（ALV-J）。

1.3试剂

pfu DNA 聚合酶、普通Taq DNA 聚合酶购自Invitrogen公司。Trizol、AMV反转录试剂盒购自TaKaRa公司。

2. 实验方法

2.1 DNA病毒样品、细菌样品DNA的制备

DNA病毒样品、细菌样品按实施例1中的1.2.1项进行病毒DNA的提取。

2.2 RNA病毒样品DNA的制备

参照TaKaRa公司Trizol说明书进行RNA的提取，用clease-free water溶解RNA，置-70℃保存。再参照TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0的说明书进行RNA转录为cDNA，置-20℃保存。

2.3 使用优化后的CAV的LAMP检测反应体系（25μL）

待检测模板核酸模板（DNA） 1.0μL

反应混合液正向外引物F3 （10μΜ） 1.0 μL

反向外引物B3（10μΜ） 1.0 μL

正向内引物FIP（10μΜ） 3.0 μL

反向内引物BIP（10μΜ） 3.0μL

正向环引物LF（10μΜ） 1.0μL

反向环引物LB（10μΜ） 1.0μL

甜菜碱betaine（8μΜ） 3.0μL

dNTP（10.0mM） 3.0μL

MgCl₂ （25.0mM） 2.5μL

反应缓冲液Buffer 10× 2.5μL

链置换DNA聚合酶 Bst DNA Polymerase （8U/μL） 1.0μL

双蒸水 ddH₂O 2.0μL

反应条件为：65℃保温60min，90℃保温5min终止反应。

反应结束后，在2%凝胶100V电泳40min，通过凝胶成像系统中观察和记录结果，如图15、16所示。

实施例3 鸡传染性贫血病毒LAMP在临床诊断中的应用与验证

1.材料与试剂

1.1病毒及样本

CAV分离株AH10-1及其感染组织病料及血液等检测阳性样品均由家禽疫病防控监测安徽省重点实验室保存。

1.2试剂

Bst DNA 聚合酶大片段，购自New England Biolabs公司；SYBR Green I染料购自北京泛博生物化学有限公司。

1.3其它溶液

实验中所用的缓冲液同实施例1中的1.2.2

2.试验方法

2.1临床样品的处理

样品处理和模板提取，样品范围适用于组织病料、细胞培养上清、血清等病毒待检样品。取适量样品（加入适量碱液稀释，使pH 8.3～9.3）煮沸裂解后，离心取上清作为LAMP模板。

2.2 临床样品的LAMP反应

临床PCR检测阳性样品有淋巴、脾脏、骨髓、心脏、肝脏、肾脏；LAMP反应体系及条件，同实施例2中的2.3项，并以组成的试剂盒形式进行反应，具体内容如下：

待检测模板（DNA） 1.0～5.0μL

反应混合液 15μL

链置换 DNA 聚合酶 2.0μL

双蒸水（ddH₂O）补至25μL

LAMP扩增条件为：反应温度为63℃，反应时间为60min。

LAMP反应结果的判定：同实施例1中的2.2.2项，结果如图17所示。

附录1：序列表

SEQ ID NO 1

正向外引物F3：5′-TCAGGCCACCAACAAGTTC-3′；

SEQ ID NO 2

反向外引物B3：5′-TGGGTTGATCGGTCCTCA-3′；

SEQ ID NO 3

正向内引物FIP：5′-CGCAGCCACACAGCGATAGAAACCCCTCACTGCAGAGAG-3′；

SEQ ID NO 4

反向内引物BIP：5′-GCTCCCACGCTAAGATCTGCAGTCCGGCACATTCTTGAAAC-3′；

SEQ ID NO 5

正向环引物LF：5′-TTGTAATTCCAGCGATACCAATCCG-3′；

SEQ ID NO 6

反向环引物LB：5′-ACTGCGGACAATTCAGAAAGCAC-3′。

附录2：CAV毒株Genebank登录号

CAU65414、AY040632、M55918、D31965、L14767、AF199501、AB031296、AF242190、AJ297682、AJ297686、AB046587、AB046588、AB046589、AB046590、AF313470、AF372658、AY171617、AY999018、AF475908、AF520788、AF527037、AY150576、AY843527、AY839944、DQ124936、AF311892、DQ141670、DQ141671、DQ141672、DQ141673、AF390038、AF390102、AF285882、AY583755、AY583756、AY583758、DQ217400、DQ217401、AB248708、AB248709、AB248710、AF311900、DQ991394、EF176599、EF189154、EF159944、EF159945、EF194840、EF599955、EF673045、EF673046、EF683158、AM904730、Eμ424059、55FJ172347、FJ210680、498868、FJ498869、FJ883784、FJ883786、FJ883790、GQ168483、GQ168482、GQ168484、GQ421599、GQ253579、GQ253581、GQ253582、HM134240。

Claims

1.鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法，其特征在于，包含特异性LAMP引物组，所述的引物组由一对外引物、一对内引物组成，所述引物的核苷酸序列如下：：

正向外引物F3，其核苷酸序列为：5′-TCAGGCCACCAACAAGTTC-3′；

反向外引物B3，其核苷酸序列为：5′-TGGGTTGATCGGTCCTCA-3′；

正向内引物FIP，其核苷酸序列为：5′-CGCAGCCACACAGCGATAGAAACCCCTCACTGCAGAGAG-3′；

反向内引物BIP，其核苷酸序列为：5′-GCTCCCACGCTAAGATCTGCAGTCCGGCACATTCTTGAAAC-3′。

2.如权利要求1所述的鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法，其特征在于还包括一对环引物，所述环引物的核苷酸序列如下：

正向环引物LF，其核苷酸序列为5′-TTGTAATTCCAGCGATACCAATCCG-3′；

反向环引物LB，其核苷酸序列为5′-ACTGCGGACAATTCAGAAAGCAC-3′。

3.如权利要求1或2所述鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法，其特征在于，所述引物组是以Genebank登录的69个国内外CAV毒株100％同源的基因序列532bp～729bp位的198个核苷酸序列为靶区域设计特异性的LAMP引物组。

4.如权利要求3所述的鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法，其特征在于所述的69个国内外CAV毒株Genebank登录号如附录表2所示。

5.如权利要求1或2所述的鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法，其特征在于，所述引物组通过等温环介导扩增反应扩增所述靶区域，确认待测样品中是否含有鸡传染性贫血病毒特定的基因。

6.根据权利要求5所述的鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法，其特征在于，25μL的LAMP扩增反应体系为：

待检测核酸模板（DNA） 1.0～5.0μL

正向外引物F3 0.1～0.8 μM

反向外引物B3 0.1～0.8 μM

正向内引物FIP 0.2～1.4 μM

反向内引物BIP 0.2～1.4 μM

正向环引物LF 0.0～0.5μM

反向环引物LB 0.0～0.5μM

甜菜碱betaine 0.2～1.4μM

dNTP 0.4～1.6mM

MgCl₂ 1.0～3.5mM

反应缓冲液Buffer 10× 1/10总反应体积

Bst DNA Polymerase 0.08～1.0μM

ddH₂O 加至25μL。

7. 根据权利要求5所述的鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法，其LAMP扩增条件为：反应温度为60℃～66℃，反应时间为30～70min。

8.根据权利要求5所述的鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法，其特征在于靶基因扩增产物是通过产物染色琼脂糖电泳，进行判定来实现。

9. 根据权利要求5所述的鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法，其特征在于靶基因扩增产物是通过或加入Mg²⁺，检测副产物焦磷酸镁沉淀的浊度，进行判定来实现。

10. 根据权利要求5或6所述的鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法，其特征在于靶基因扩增产物是通过或加入SYBR Green I，肉眼或紫外光线下观察颜色变化的方法进行判定来实现。

11. 如权利要求1-10任一所述鸡传染性贫血病毒LAMP检测方法设计的快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含所述特异性LAMP引物组。

12. 如权利要求11所述的鸡传染性贫血病毒快速检测试剂盒，其特征在于包含：

a．反应液：含权利要求1所述鸡传染性贫血病毒基因检测用引物组的混合液，包含除聚合酶以外的权利要求4所述LAMP反应体系中所有需要试剂及缓冲液；

b．阴阳性对照品：阳性对照品为携带鸡传染性贫血病毒靶基因克隆的质粒DNA，阴性对照品为ddH₂O；

c．Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段；

d．显色剂：SYBR Green I或EvaGreen，优选SYBR Green I。

13.根据权利要求12所述试剂盒，其特征在于，25μL的LAMP扩增反应体系为：

反应混合液 15μL

链置换 DNA 聚合酶 2.0μL

待检测模板（DNA） 1.0～5.0μL

双蒸水（ddH₂O） 3.0～7.0μL。