CN110643743A - 鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重lamp检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测引物组，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。据此，通过优化反应体系和条件，发明人还研制了相应试剂盒并建立相应二重LAMP方法。该法只需要在63℃的水浴锅中恒温反应90分钟即可完成，能特异地检测鸡传染性贫血和鸡细小病毒，并且检测的灵敏度非常高，能检测到10个混合模板拷贝/μl的鸡传染性贫血和鸡细小病毒DNA混合样品。试验证实，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，且通过荧光基团的颜色检测阳性结果，有效抑制了假阳性结果，并且减少了气溶胶污染，具有较好的应用前景。

Description

鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测试剂盒
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测试剂盒。
背景技术
鸡传染性贫血和鸡细小在鸡群中普遍存在，均是危害雏鸡的病毒性疾病。鸡传染性贫血病毒(Chichen infectious anemia virus，CIAV)，可使雏鸡骨髓黄化、淋巴组织萎缩，进而导致雏鸡造血功能和免疫抑制障碍。鸡细小病毒(chicken parvovirus，ChPV)主要引起以腹泻、精神沉郁、体温调节障碍、生长迟缓、增加饲料消耗为特征的急性或慢性肠道性疾病、营养不良综合征、发育障碍与矮小综合征。近年来，北美、匈牙利、巴西和韩国等国家地区相继报道该病的暴发。
传统的检测方法，如二温式PCR，PCR和荧光PCR，需要使用昂贵的仪器和试剂，且操作繁琐，耗时耗力等。而环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点。如今，LAMP法已经广泛应用于病原微生物检测。
目前，国内外均未见有建立鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP可视化检测试剂盒和方法的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、污染较少的鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测引物组，包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。
引物5和引物6为探针，引物5在5’端和3’端分别标记CY5和BHQ2，引物6在5’端和3’端分别标记5-FAM和BHQ-1。
引物1至引物4的摩尔比为8:8:1:1。
上述鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测引物组在环介导等温扩增中的应用。
环介导等温扩增的条件为63℃反应80min，80℃作用5min灭活。
鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测试剂盒，包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。
引物5和引物6为探针，引物5在5’端和3’端分别标记CY5和BHQ2，引物6在5’端和3’端分别标记5-FAM和BHQ-1。
上述鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测试剂盒，还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁。
括引物1至引物6在环介导等温扩增试剂中的终浓度分别为40μmol/L、40μmol/L、5μmol/L、5μmol/L、100μmol/L和100μmol/L。
针对目前鸡传染性贫血和鸡细小病毒鉴别检测存在的问题，发明人根据CIAV的VP1基因和ChPV的NS1基因序的保守序列设计了针对6个特异区域的4条引物和2条探针，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列，其中在F3-B3区间设计的两条探针CIAV-P和ChPV-P使扩增反应具有很高的特异性，探针CIAV-P 5′用CY5标记，3′用BHQ2标记，在694nm波长下呈现大红色；探针ChPV-P 5′用FAM标记，3′用BHQ1标记，在520nm下呈现绿色，通过荧光基团的显色来降低了LAMP反应的污染几率。
据此，通过优化反应体系和条件，发明人还研制了相应试剂盒并建立相应二重LAMP方法。该法只需要在63℃的水浴锅中恒温反应90分钟即可完成，能特异地检测鸡传染性贫血和鸡细小病毒，并且检测的灵敏度非常高，能检测到10个混合模板拷贝/μl的鸡传染性贫血和鸡细小病毒DNA混合样品。试验证实，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，且通过荧光基团的颜色检测阳性结果，有效抑制了假阳性结果，并且减少了气溶胶污染，具有较好的应用前景。
附图说明
图1是本发明LAMP方法检测鸡传染性贫血和鸡细小病毒的特异性结果图(浊度曲线)。
图2是本发明LAMP方法检测鸡传染性贫血和鸡细小病毒的特异性结果图(荧光照片)。
图1和图2中，1为CIAV、ChPV混合模板标准品，2-7分别为A H9、NDV、MDV、FAV-4、AILTV、阴性对照。
图3是本发明LAMP方法检测鸡传染性贫血和鸡细小病毒的敏感性结果图(浊度曲线)。
图4是本发明LAMP方法检测鸡传染性贫血和鸡细小病毒的敏感性结果图(荧光照片)。
图3和图4中：1～7分别为105～100拷贝/μl(CIAV和ChPV DNA混合模板标准品)、阴性对照
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中：
LAMP DNA扩增试剂盒、Loopamp LA-320C实时浊度仪均购自日本荣研公司；DNA抽提试剂盒、PCR试剂和质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；NanoDrop2000核酸测定仪购自美国ThermoFisher Scientific公司；多色荧光成像分析系统购自美国BIO-RAD公司。
鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡细小病毒(ChPV)、H9亚型禽流感病毒(A H9)、新城疫病毒(NDV)、马立克病病毒(MDV)、腺病毒(FAV-4)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)等均为已知病毒，这些病毒为自留存，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、引物的设计
根据GenBank中CIAV的VP1基因(登录号：KY486154.1)和ChPV的NS1基因(登录号：KM254174.1)的保守序列，使用在线软件Primer Explorer V5(http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计LAMP引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，其具体序列见表1。
表1 LAMP引物序列
Figure BDA0002254559260000031
实施例2、引物在LAMP检测鸡传染性贫血和鸡细小病毒中的应用
一、DNA标准品的制备
使用PCR分别扩增CAIV VP1基因和ChPV NS1基因的目的片段，回收纯化的产物与pGM-T载体连接，经PCR筛选出阳性克隆菌，其阳性克隆菌的质粒用试剂盒提取。通过核酸检测仪测定DNA浓度，并根据相对分子质量及阿弗加德罗常数将浓度计算为拷贝数。于–70℃保存，备用。
二、优化LAMP反应体系、反应条件和试剂盒的构建
反应体系为20μL分别为2μL DNA模板(含CIAV和ChPV DNA模板各1μL)，10×buffer2.5μL，MgSO4(100mM)1.5μL，dNTP Mix(10mM)3.5μL，Bst 2.0DNA Polymerase(8000U/mL)1μL，内引物各40pmol(CIAV-FIP，CIAV-BIP，ChPV-FIP和ChPV-BIP)，外引物各5pmol(CIAV-F3，CIAV-B3，ChPV-B3和ChPV-F3)，探针各1μL(CIAV-P和ChPV-P)，加水至20μL。各组份混合彻底，63℃(或58-68℃范围内均可反应)反应80min，最后80℃作用5min终止反应。
反应条件：温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次递增反应80min，80℃作用5min灭活。
分别按照上述的反应条件进行摸索，获得下述的最佳反应和条件：
最佳反应体系如下：20μL LAMP反应体系：1μL dNTP Mix(10mmol/L，终浓度为1.4mM)、2.5μL 10×Bst buffer、1μL Bst DNA聚合酶8000U(终浓度为320U/mL)、1.5μLMgSO4(100mM，终浓度为6mM)、1μL探针(终浓度分别为CIAV-P 100μmol/L、ChPV-P 100μmol/L)、1μL引物(FIP 40μmol/L、BIP 40μmol/L、B3 5μmol/L、F3 5μmol/L，其中各条引物的终浓度为FIP 1.6μmol/L、BIP 1.6μmol/L、B3 0.2μmol/L、F3 0.2μmol/L)，模板DNA 2μL(含CIAV和ChPV DNA模板各1μL)，加水至20μL。
最佳反应条件：63℃反应80min，80℃作用5min灭活。
鸡传染性贫血和鸡细小病毒LAMP检测试剂盒包括FIP、BIP、F3、B3的4条引物和CIAV-P、ChPV-P 2条探针或上述最佳反应体系(除去模板)。
三、特异性检测
分别以上述一得到鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡细小病毒(ChPV)、H9亚型禽流感病毒(A H9)、新城疫病毒(NDV)、马立克病病毒(MDV)、腺病毒(FAV-4)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)的DNA模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。
LAMP反应结果判断：
使用多色荧光成像分析系统分析荧光基团颜色变化：若产物显色为黄色(黄绿色)，则说明样品中同时含有鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡细小病毒(ChPV)，若产物显色为大红色，则说明样品中同时含有鸡传染性贫血病毒(CIAV)，若产物显色为绿色，则说明样品中同时含有鸡细小病毒(ChPV)，反之，则说明样品中不同时含有鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡细小病毒(ChPV)或不含有鸡细小病毒(ChPV)或不含有鸡传染性贫血病毒(CIAV)。
结果如图1和图2所示，图1为由时实浊度仪loopam LA-320C生成检测结果，图2为荧光基团显色结果，其中1为鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡细小病毒(ChPV)混合模板、2为H9亚型禽流感病毒(A H9)、3为新城疫病毒(NDV)、4为马立克病病毒(MDV)、5为腺病毒(FAV-4)、6为传染性喉气管炎病毒(AILTV)、7为阴性对照(水)，可以看出，只有鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡细小病毒(ChPV)混合模板(1)检测为阳性结果(荧光基团显色为黄色)，而H9亚型禽流感病毒(A H9)、新城疫病毒(NDV)、马立克病病毒(MDV)、腺病毒(FAV-4)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)的检测均为阴性(结果无颜色变化)。
四、灵敏度检测
将鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡细小病毒(ChPV)混合模板DNA按10倍倍比稀释至9.3ng/μL、93pg/μL、9.3pg/μL、93fg/μL、9.3fg/μL和0.93fg/μL为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。
结果如图3和图4所示，图3为由时实浊度仪loopam LA-320C生成检测结果，图4为荧光基团显色结果，其中1为9.3ng/μL、2为93pg/μL、3为9.3pg/μL、4为93fg/μL、5为9.3fg/μL和6为0.93fg/μL、7为阴性对照(水)；可以看出，LAMP对鸡传染性贫血病毒(CIAV)、鸡细小病毒(ChPV)的混合模板DNA的最小检测限为9.3fg/μL。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgctcttcat taccggctcc ttaagtcgca gcagtacaag tt 42
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtccagtcg gtctggcaac gttggcccag ttgacatcc 39
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacgtagcgc aaggcaca 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgacccccag tacatggt 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggcacagct acatacgcgc t 21
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatggcaat aattttaatt ttgaag 26

Claims (9)

1.鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测引物组，其特征在于包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测引物组，其特征在于：所述引物5和引物6为探针，引物5在5’端和3’端分别标记CY5和BHQ2，引物6在5’端和3’端分别标记5-FAM和BHQ-1。
3.根据权利要求1所述的鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测引物组，其特征在于：所述引物1至引物4的摩尔比为8:8:1:1。
4.权利要求1所述的鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测引物组在环介导等温扩增中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于环介导等温扩增的条件为63℃反应80min，80℃作用5min灭活。
6.鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测试剂盒，其特征在于包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。
7.根据权利要求1所述的鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述引物5和引物6为探针，引物5在5’端和3’端分别标记CY5和BHQ2，引物6在5’端和3’端分别标记5-FAM和BHQ-1。
8.根据权利要求1所述的鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测试剂盒，其特征在于还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁。
9.根据权利要求1所述的鸡传染性贫血和鸡细小病毒二重LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述括引物1至引物6在环介导等温扩增试剂中的终浓度分别为40μmol/L、40μmol/L、5μmol/L、5μmol/L、100μmol/L和100μmol/L。
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