CN112593012A - 二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和j亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组 - Google Patents
二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和j亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112593012A CN112593012A CN202011596277.7A CN202011596277A CN112593012A CN 112593012 A CN112593012 A CN 112593012A CN 202011596277 A CN202011596277 A CN 202011596277A CN 112593012 A CN112593012 A CN 112593012A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- alv
- mol
- mdv
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 title claims abstract description 53
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 title claims abstract description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 41
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 7
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 7
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 6
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229960003390 magnesium sulfate Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000323253 Avian leukosis virus ev/J Species 0.000 abstract description 38
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 6
- 241001516406 Avian orthoreovirus Species 0.000 description 6
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 6
- 241000712909 Reticuloendotheliosis virus Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 2
- 241001428887 Avian leukosis virus - RSA Species 0.000 description 1
- 101500009257 Avian leukosis virus RSA Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000658 coextraction Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列，其中引物7与引物1互补的探针、引物14为与引物8互补的探针，它们使扩增反应具有很高的特异性，能分别与MDV meq基因和ALV‑J gp85基因结合，反应后在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光，从而实现快速敏感特异的鉴别MDV和ALV‑J。据此，还研制了相应试剂盒并建立相应LAMP方法。总之，本发明具有特异性强、灵敏度高、快速简便的特点，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中快速检测，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组。
背景技术
马立克氏病(Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's diseasevirus,MDV)引起的以感染鸡、火鸡为主的一种致肿瘤的传染病。禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的感染禽类的致肿瘤的传染病，外源性ALV包含ALV-A、ALV-B、ALV-J等亚群，禽感染后可发生肿瘤，E亚群是内源性ALV不引起肿瘤。目前ALV-J的感染最广泛，造成的危害最严重。这两种病毒不仅可以感染鸡、火鸡等导致肿瘤产生，还能导致后期免疫抑制，其产生的肿瘤凭肉眼难以辨别，并且常常发生混合感染，需要通过实验室手段进行鉴别诊断。目前可以通过检测这两种病毒的基因对MDV和ALV-J进行鉴别诊断。ALV不同亚群之间的囊膜蛋白基因差异较大，且为逆转录病毒，在感染过程中将自身RNA逆转录为cDNA插入宿主DNA中，因此检测ALV可跳过反转录步骤直接检测其插入到宿主中的DNA。
传统的检测方法需要使用昂贵的仪器和试剂等。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplimeqication，LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点，在一些病原微生物的检测中已被广泛运用。在传统的LAMP检测方法中，创新性地加入一条Fd探针与F1C反向互补，分别在两条引物上标记荧光基团和淬灭基团，反应时随着LAMP扩增时的链置换作用被置换下来，探针发出荧光。
经查，国内外均未见有建立二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒可视化检测试剂盒和方法的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、快速简便的二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列。
引物7和引物14为探针，引物7与引物1反向互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团,引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。
引物1至引物14的摩尔比为8:8:1:1:4:4:4:8:8:1:1:4:4:4。
上述检测引物组在环介导等温扩增中的应用。
环介导等温扩增的条件为66℃反应60min，80℃作用5min灭活。
二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列。
引物7和引物14为探针，引物7与引物1互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团,引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。
上述检测试剂盒，还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl2。
引物1至引物14在环介导等温扩增反应体系中的终浓度分别为1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L、1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L和0.8μmol/L。
针对目前MDV和ALV-J检测存在的问题，发明人分别根据MDV meq基因和ALV gp85基因的保守序列的6个特异区域设计了二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列，其中引物7和引物14为探针，引物7与引物1反向互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团,引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。反应过程中，由于LAMP反应的链置换作用，引物7与引物1，引物14与引物8随着反应进行分开，引物7和引物14被置换下来，荧光基团和淬灭基团分开，在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光(引物7发出绿色荧光；引物14发出红色荧光)，从而实现快速敏感特异的鉴别MDV和ALV-J。
据此，通过优化反应体系和条件，发明人还研制了相应试剂盒并建立相应二重荧光LAMP方法。该法只需要在66℃的水浴锅中反应60分钟即可完成，能特异的检测MDV和ALV-J，反应后，发出绿色荧光的为MDV，发出红色荧光的为ALV-J，若样品中同时存在MDV和ALV-J，则为黄色荧光。试验证实，本发明检测灵敏度非常高，每个反应体系能检测到100拷贝的MDV和ALV-J DNA样品。
本发明需要用2套引物，即可扩增MDV meq基因和ALV-J gp85基因，并通过Fd探针与F1C引物反向互补，反应过程中，由于LAMP反应的链置换作用，引物7与引物1，引物14与引物8随着反应进行分开，引物7和引物14被置换下来，荧光基团和淬灭基团分开，在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光。反应只需要在一个反应管中进行反应，就可以根据反应后在荧光核酸成像仪下的颜色进行读取结果。且通过探针杂合的方法，特异性更高，不受非特异性扩增的影响，也不受引物二聚体扩增的影响。
总之，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅和荧光成像仪，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。
附图说明
图1是本发明LAMP方法检测MDV和ALV-J的特异性结果图，图中：A为浊度仪观测的LAMP特异性试验扩增曲线，B为荧光成像仪观测的LAMP特异性试验扩增结果；其中，1为MDV，2为ALV-J，3为MDV和ALV-J混合，4为网状内皮增生症病毒，5为禽呼肠孤病毒，6为传染性法氏囊炎病毒，7为鸡传染性贫血病毒，8为阴性对照(水)。
图2是本发明LAMP方法检测MDV和ALV-J的敏感性结果图，图中：A为浊度仪观测的LAMP扩增敏感性试验扩增曲线，MDV和ALV-J的模板1:1等量加入反应(浓度为总浓度)，其中1为各107拷贝，2为各106拷贝，3为各105拷贝，4为各104拷贝，5为各103拷贝，6为各102拷贝，7为各10拷贝，8为阴性对照(水)。B为荧光成像仪观测的LAMP扩增敏感性试验扩增结果，第一排为MDV，第二排为ALV-J，其中1为107拷贝，2为106拷贝，3为105拷贝，4为104拷贝，5为103拷贝，6为102拷贝，7为10拷贝，8为阴性对照(水)；第三排为MDV和ALV-J 1:1等量(浓度为总浓度),其中1为各107拷贝，2为各106拷贝，3为各105拷贝，4为各104拷贝，5为各103拷贝，6为各102拷贝，7为各10拷贝，8为阴性对照(水)。
图3是本发明LAMP方法随机检测临床分离MDV和ALV-J的结果图，图中：1-7为随机检测的7份样品，8为阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中：
Bst DNA聚合酶(全长)购自New England Biolabs公司。
Viral DNA/RNAKit购自北京全式金生物。
MDV，ALV-J,网状内皮增生症病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒等均为已知病毒，这些病毒为自留存，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、引物的设计
根据GenBank中MDV的meq基因序列和ALV-J的gp85基因序列，使用在线软件PrimerExplorer V4(http：//primerexplorer.jp/e/v4-manual/index.html)设计LAMP引物。引物由广州Invitrogen公司合成，其具体序列见表1。
表1 LAMP引物序列
实施例2、引物在二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒的应用
一、核酸的提取
参照
Viral DNA/RNA Kit DNA/RNA共提试剂盒说明书，提取MDV，ALV-J,网状内皮增生症病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒基因组DNA和RNA。
二、优化LAMP反应体系、反应条件和试剂盒的构建
25μL LAMP反应体系：1-4μL dNTPs(10mmol/L，终浓度为0.4mmol/L-1.6mmol/L)、2.5μL 10×Bst bumeqmeqer、1μl Bst DNA聚合酶8U(终浓度为320U/L)、4-7μL甜菜碱Betaine(5mmol/L，终浓度为0.8mmol/L-1.4mmol/L)、2-9μL MgSO4(25mmol/L，终浓度为2mmol/L-9mmol/L)、1μL引物(MDV-FIP 40μmol/L、MDV-BIP 40μmol/L、MDV-F3 5μmol/L、MDV-B3 5μmol/L、MDV-LF 20μmol/L、MDV-LB20μmol/L、MDV-Fd 20μmol/L、ALV-J-FIP 40μmol/L、ALV-J-BIP 40μmol/L、ALV-J-F3 5μmol/L、ALV-J-B3 5μmol/L、ALV-J-LF 20μmol/L、ALV-J-LB20μmol/L、ALV-J-Fd 20μmol/L)；终浓度为MDV-FIP 1.6μmol/L、MDV-BIP 1.6μmol/L、MDV-F3 0.2μmol/L、MDV-B3 0.2μmol/L、MDV-LF 0.8μmol/L、MDV-LB 0.8μmol/L、MDV-Fd 0.8μmol/L、ALV-J-FIP 1.6μmol/L、ALV-J-BIP 1.6μmol/L、ALV-J-F3 0.2μmol/L、ALV-J-B3 0.2μmol/L、ALV-J-LF 0.8μmol/L、ALV-J-LB 0.8μmol/L、ALV-J-Fd 0.8μmol/L和1μL模板(MDV的基因组DNA)，加水至25μL。MDV-FIP和MDV-Fd，ALV-J-FIP和ALV-J-Fd反应前先按上述比例混合加热到85℃5min然后缓慢降到室温。
反应条件：温度按60℃、62℃、64℃、66℃、68℃依次递增反应60min，80℃作用5min灭活。
分别按照上述的反应体系和反应条件进行摸索，获得下述的最佳反应体系和条件：
最佳反应体系如下：25μL LAMP反应体系：2μL dNTPs(10mmol/L，终浓度为0.4mmol/L)、2.5μL 10×Bst bumeqmeqer、1μL Bst DNA聚合酶8U(终浓度为320U/L)、5μL甜菜碱Betaine(5mmol/L，终浓度为1mmol/L)、3μL MgSO4(25mmol/L，终浓度为3mmol/L)、1μL引物(MDV-FIP 40μmol/L、MDV-BIP 40μmol/L、MDV-F3 5μmol/L、MDV-B3 5μmol/L、MDV-LF20μmol/L、MDV-LB20μmol/L、MDV-Fd 20μmol/L、ALV-J-FIP 40μmol/L、ALV-J-BIP 40μmol/L、ALV-J-F3 5μmol/L、ALV-J-B3 5μmol/L、ALV-J-LF 20μmol/L、ALV-J-LB20μmol/L、ALV-J-Fd 20μmol/L)；终浓度为MDV-FIP 1.6μmol/L、MDV-BIP 1.6μmol/L、MDV-F3 0.2μmol/L、MDV-B3 0.2μmol/L、MDV-LF 0.8μmol/L、MDV-LB 0.8μmol/L、MDV-Fd 0.8μmol/L、ALV-J-FIP1.6μmol/L、ALV-J-BIP 1.6μmol/L、ALV-J-F3 0.2μmol/L、ALV-J-B3 0.2μmol/L、ALV-J-LF0.8μmol/L、ALV-J-LB 0.8μmol/L、ALV-J-Fd 0.8μmol/L和1μL模板(MDV的基因组DNA)，加水至25μL。
最佳反应条件：66℃反应60min，80℃作用5min灭活。
为便于基层快速检测，可参照上述最佳反应体系装配检测试剂盒，试剂盒包括有关引物和以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl2。
三、特异性检测
分别以上述一得到MDV，ALV-J,网状内皮增生症病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒DNA或cDNA为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。
LAMP反应结果的判断：
1)使用荧光核酸成像仪：分别使用FAM通道和CY5通道成像，若反应产物颜色变为绿色，则说明样品中含有MDV，若反应产物颜色变为红色，则说明样品中含有ALV-J，若反应产物颜色变为黄色，则说明样品中含有MDV和ALV-J，若没荧光显色则说明样品中不含有MDV和ALV-J。
结果如图1所示，A图为浊度仪扩增结果，B图为荧光核酸成像仪观察结果。可以看出，A中的1-3有扩增曲线，而网状内皮增生症病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒，和水没有扩增。B中的1呈绿色荧光，MDV为阳性结果，2呈红色荧光，为ALV-J阳性结果，3呈黄色荧光，MDV和ALV-J混合的阳性结果；网状内皮增生症病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒，和水没有荧光，呈阴性结果。
四、灵敏度检测
将MDV和ALV-J的DNA按10倍倍比稀释至107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、10copies/μL和阴性对照(水)为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。
结果如图2所示，A图为MDV和ALV-J的浊度仪扩增结果，可以看出1-6有扩增曲线，7-8无扩增曲线。LAMP对MDV和ALV-J混合的DNA的最小检测限为102copies。B图为荧光成像仪的检测结果，其中第一排为MDV的敏感性检测结果，可以看出1-6呈绿色荧光，7-8无荧光，对MDV的最低检测量为102copies。第二排为ALV-J的敏感性检测结果，可以看出1-6呈红色荧光，7-8无荧光，对ALV-J的最低检测量为102copies。第三排为MDV和ALV-J混合的敏感性检测结果，可以看出1-6呈黄色荧光，7-8无荧光，对MDV和ALV-J的最低检测量为102copies。
五、对MD临床病料的随机检测
将临床送检的疑似MDV和ALV-J感染的病料，抽提基因组DNA为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。
结果如图3所示，1为MDV，3为ALV-J，2、5为MDV和ALV-J混合感染，4、6、7为阴性，8为阴性对照(水)。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagatggga ggtggtgggg tatctgtacc ccccgtcct 39
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atctacgctc cggggccttc caaagctcct ccgcatcg 38
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccacattgct ccggttcc 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtacagatg ggaggtggtg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaaagttcc tccgtatcgg g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccctccaac ctcctatctg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccccaccacc tcccatctct 20
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcctatcaag caggtgcgga atcgggccaa acagattttt gc 42
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcctctgagc gcctttaagg gaatgctgtt tggctggcta a 41
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caggaaacgt gtgggtcac 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccaagggag ggtcgtatt 19
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggtcgctga ctgtagacta ag 22
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tatgtcacta atgttactgc ttgcc 25
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
attccgcacc tgcttgatag gc 22
Claims (9)
1.二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，其特征在于包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于：所述引物7和引物14为探针，引物7与引物1反向互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团，引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。
3.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于：所述引物1至引物14的摩尔比为8:8:1:1:4:4:4:8:8:1:1:4:4:4。
4.权利要求1所述的检测引物组在环介导等温扩增中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述环介导等温扩增的条件为66℃反应60min，80℃作用5min灭活。
6.二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒，其特征在于包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列。
7.根据权利要求1所述的二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒，其特征在于：所述引物7和引物14为探针，引物7与引物1互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团,引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl2。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于：所述引物1至引物14在环介导等温扩增反应体系中的终浓度分别为1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L、1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L和0.8μmol/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011596277.7A CN112593012A (zh) | 2020-12-29 | 2020-12-29 | 二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和j亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011596277.7A CN112593012A (zh) | 2020-12-29 | 2020-12-29 | 二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和j亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112593012A true CN112593012A (zh) | 2021-04-02 |
Family
ID=75203800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011596277.7A Pending CN112593012A (zh) | 2020-12-29 | 2020-12-29 | 二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和j亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112593012A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111321250A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-06-23 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测csfv和pcv的引物组合物、试剂盒及方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104087686A (zh) * | 2014-07-14 | 2014-10-08 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试剂盒和检测方法 |
| CN108085416A (zh) * | 2017-12-21 | 2018-05-29 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种禽肿瘤病三重荧光pcr检测试剂盒及其检测方法 |
| CN110578019A (zh) * | 2019-10-30 | 2019-12-17 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组 |
-
2020
- 2020-12-29 CN CN202011596277.7A patent/CN112593012A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104087686A (zh) * | 2014-07-14 | 2014-10-08 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种鉴别8种鸡免疫抑制病病原体的GeXP快速检测试剂盒和检测方法 |
| CN108085416A (zh) * | 2017-12-21 | 2018-05-29 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种禽肿瘤病三重荧光pcr检测试剂盒及其检测方法 |
| CN110578019A (zh) * | 2019-10-30 | 2019-12-17 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NATHAN A TANNER等: "Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification", BIOTECHNIQUES, vol. 53, no. 2, pages 1 - 2 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111321250A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-06-23 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测csfv和pcv的引物组合物、试剂盒及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107299155B (zh) | 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 | |
| CN110578019B (zh) | 二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组 | |
| JP2005500856A (ja) | 多重フルオロフォアを使用する蛍光多重ｈｐｖｐｃｒアッセイ | |
| EP2978862A1 (en) | Dual probe:antiprobe compositions for dna and rna detection | |
| CN110643744A (zh) | 一种同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法及其引物探针组合 | |
| CN110904272A (zh) | 一种同时检测多种病原微生物的引物探针组合、试剂盒以及方法 | |
| CN110699485B (zh) | 一种快速检测马立克氏病病毒的rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法 | |
| CN110408727B (zh) | 一种检测j亚群禽白血病病毒的cpa引物组、cpa核酸试纸条试剂盒及其应用 | |
| CN105821163B (zh) | 一种快速鉴定鹅细小病毒与樱桃谷鸭源细小病毒的双重pcr方法 | |
| CN112593012A (zh) | 二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和j亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组 | |
| JP4913042B2 (ja) | Ｈｉｖタイプおよびサブタイプの検出 | |
| CN113025610B (zh) | 可视化二重lamp鉴别禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒的方法 | |
| CN111363842B (zh) | 用于快速检测烟曲霉的序列、试剂盒、方法及应用 | |
| CN111961756A (zh) | 用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒 | |
| CN112553377A (zh) | 二重荧光lamp区分马立克氏病病毒疫苗株和强毒株检测试剂盒及其引物组 | |
| CN112680548A (zh) | 二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒检测试剂盒及其引物组 | |
| CN112522448A (zh) | 二重荧光lamp区分网状内皮增生症病毒和j亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组 | |
| CN113293237A (zh) | FAdV-4变异株和非变异株二重荧光LAMP引物组、试剂盒及应用 | |
| CN109762941B (zh) | 一种检测致禽类死亡病原的液态芯片 | |
| CN112795701A (zh) | 一种基于荧光rma法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法 | |
| CN112899406A (zh) | 一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法 | |
| KR20190122635A (ko) | Lamp를 이용한 닭 전염성f낭병 바이러스 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| KR20190122633A (ko) | Lamp를 이용한 마렉병 바이러스 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| CN111235317A (zh) | 一种检测prrsv和pcv的引物组合物、试剂盒及方法 | |
| CN117757987A (zh) | 一种检测真鲷虹彩病毒和大口黑鲈虹彩病毒的荧光定量pcr检测引物探针组和试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |