CN112522448A - 二重荧光lamp区分网状内皮增生症病毒和j亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列，其中引物7为与引物1互补的探针、引物14为与引物8互补的探针，它们使扩增反应具有很高特异性，能分别与REV gp90基因和ALV‑J gp85基因结合，反应后在不同波长荧光下发出不同颜色荧光，从而实现快速敏感特异地鉴别REV和ALV‑J。据此，还研制了相应试剂盒并建立相应LAMP方法。总之，本发明特异性强、灵敏度高、快速简的特点，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组。
背景技术
网状内皮增生症(reticuloendotheliosis,RE)是由网状内皮增生症病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)感染禽类的致肿瘤的传染病。禽白血病(AvianLeukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的感染禽类的致肿瘤的传染病，外源性ALV包含ALV-A、ALV-B、ALV-J等亚群，禽感染后可发生肿瘤，E亚群是内源性ALV不引起肿瘤。目前ALV-J的感染最广泛，造成的危害最严重。这两种病毒不仅可以感染鸡、火鸡等导致肿瘤产生，还能导致后期免疫抑制，其产生的肿瘤凭肉眼难以辨别，并且常常发生混合感染，需要通过实验室手段进行鉴别诊断。目前可以通过检测这两种病毒的基因对REV和ALV-J进行鉴别诊断。ALV不同亚群之间的囊膜蛋白基因差异较大，且ALV和REV为逆转录病毒，在感染过程中将自身RNA逆转录为cDNA插入宿主DNA中，因此检测ALV可跳过反转录步骤直接检测其插入到宿主中的DNA。
传统的检测方法需要使用昂贵的仪器和试剂等。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplimeqication，LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点，在一些病原微生物的检测中已被广泛运用。在传统的LAMP检测方法中，创新性地加入一条Fd探针与F1C反向互补，分别在两条引物上标记荧光基团和淬灭基团，反应时随着LAMP扩增时的链置换作用被置换下来，探针发出荧光。
经查，国内外均未见有建立二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒可视化检测试剂盒和方法的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、快速简便的二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列。
引物7和引物14为探针，引物7与引物1反向互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团，引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。
引物1至引物14的摩尔比为8:8:1:1:4:4:4:8:8:1:1:4:4:4。
上述检测引物组在环介导等温扩增中的应用。
环介导等温扩增的条件为66℃反应60min，80℃作用5min灭活。
二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列。
引物7和引物14为探针，引物7与引物1互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团,引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。
上述检测试剂盒，还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl2。
引物1至引物14在环介导等温扩增反应体系中的终浓度分别为1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L、1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L和0.8μmol/L。
针对目前REV和ALV-J检测存在的问题，发明人分别根据REV gp90基因和ALV gp85基因的保守序列的6个特异区域设计了二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列，其中引物7和引物14为探针，引物7与引物1反向互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团，引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。反应过程中，由于LAMP反应的链置换作用，引物7与引物1，引物14与引物8随着反应进行分开，引物7和引物14被置换下来，荧光基团和淬灭基团分开，在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光(引物7发出绿色荧光；引物14发出红色荧光)，从而实现快速敏感特异的鉴别REV和ALV-J。
据此，通过优化反应体系和条件，发明人还研制了相应试剂盒并建立相应二重荧光LAMP方法。该法只需要在66℃的水浴锅中反应60分钟即可完成，能特异的检测REV和ALV-J，反应后，发出绿色荧光的为REV，发出红色荧光的为ALV-J，若样品中同时存在REV和ALV-J，则为黄色荧光。试验证实，本发明检测灵敏度非常高，每个反应体系能检测到100拷贝的REV和ALV-J DNA样品。
本发明需要用2套引物，即可扩增REV gp90基因和ALV-J gp85基因，并通过Fd探针与F1C引物反向互补，反应过程中，由于LAMP反应的链置换作用，引物7与引物1，引物14与引物8随着反应进行分开，引物7和引物14被置换下来，荧光基团和淬灭基团分开，在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光。反应只需要在一个反应管中进行反应，就可以根据反应后在荧光核酸成像仪下的颜色进行读取结果。且通过探针杂合的方法，特异性更高，不受非特异性扩增的影响，也不受引物二聚体扩增的影响。
总之，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅和荧光成像仪，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。
附图说明
图1是本发明LAMP方法检测REV和ALV-J的特异性结果图，图中：A为浊度仪观测的LAMP特异性试验扩增曲线，其中，1为REV，2为ALV-J，3为REV和ALV-J混合，4为马立克氏病病毒，5为禽呼肠孤病毒，6为传染性法氏囊炎病毒，7为鸡传染性贫血病毒，8为阴性对照(水)；B为荧光成像仪观测的LAMP特异性试验扩增结果，其中，1为ALV-J，2为REV，3为REV和ALV-J混合，4为马立克氏病病毒，5为禽呼肠孤病毒，6为传染性法氏囊炎病毒，7为鸡传染性贫血病毒，8为阴性对照(水)。
图2是本发明LAMP方法检测REV和ALV-J的敏感性结果图，图中：A为浊度仪观测的LAMP扩增敏感性试验扩增曲线，REV和ALV-J的模板1:1等量加入反应(浓度为总浓度)，其中1为各107拷贝，2为各106拷贝，3为各105拷贝，4为各104拷贝，5为各103拷贝，6为各102拷贝，7为各10拷贝，8为阴性对照(水)。B为荧光成像仪观测的LAMP扩增敏感性试验扩增结果，第一排为REV，第二排为ALV-J，其中，1为107拷贝，2为106拷贝，3为105拷贝，4为104拷贝，5为103拷贝，6为102拷贝，7为10拷贝，8为阴性对照(水)；第三排为REV和ALV-J 1:1等量(浓度为总浓度),其中1为各107拷贝，2为各106拷贝，3为各105拷贝，4为各104拷贝，5为各103拷贝，6为各102拷贝，7为各10拷贝，8为阴性对照(水)。
图3是本发明LAMP方法随机检测临床检测REV和ALV-J的结果图，图中：1-16为随机检测的16份样品，17为阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中：
Bst DNA聚合酶(全长)购自New England Biolabs公司。
Viral DNA/RNAKit购自北京全式金生物。
REV，ALV-J,马立克氏病病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒等均为已知病毒，这些病毒为自留存，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、引物的设计
根据GenBank中REV的gp90基因序列和ALV-J的gp85基因序列，使用在线软件Primer Explorer V4(http：//primerexplorer.jp/e/v4-manual/index.html)设计LAMP引物。引物由广州Invitrogen公司合成，其具体序列见表1。
表1 LAMP引物序列
实施例2、引物在二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒的应用一、核酸的提取
参照
Viral DNA/RNA Kit DNA/RNA共提试剂盒说明书，提取REV，ALV-J,马立克氏病病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒基因组DNA和RNA。
二、优化LAMP反应体系、反应条件和试剂盒的构建
25μL LAMP反应体系：1-4μL dNTPs(10mmol/L，终浓度为0.4mmol/L-1.6mmol/L)、2.5μL 10×Bst bumeqmeqer、1μl Bst DNA聚合酶8U(终浓度为320U/L)、4-7μL甜菜碱Betaine(5mmol/L，终浓度为0.8mmol/L-1.4mmol/L)、2-9μL MgSO4(25mmol/L，终浓度为2mmol/L-9mmol/L)、1μL引物(REV-FIP 40μmol/L、REV-BIP 40μmol/L、REV-F3 5μmol/L、REV-B3 5μmol/L、REV-LF 20μmol/L、REV-LB20μmol/L、REV-Fd 20μmol/L、ALV-J-FIP 40μmol/L、ALV-J-BIP 40μmol/L、ALV-J-F3 5μmol/L、ALV-J-B3 5μmol/L、ALV-J-LF 20μmol/L、ALV-J-LB20μmol/L、ALV-J-Fd 20μmol/L)；终浓度为REV-FIP 1.6μmol/L、REV-BIP 1.6μmol/L、REV-F3 0.2μmol/L、REV-B3 0.2μmol/L、REV-LF 0.8μmol/L、REV-LB 0.8μmol/L、REV-Fd 0.8μmol/L、ALV-J-FIP 1.6μmol/L、ALV-J-BIP 1.6μmol/L、ALV-J-F3 0.2μmol/L、ALV-J-B3 0.2μmol/L、ALV-J-LF 0.8μmol/L、ALV-J-LB 0.8μmol/L、ALV-J-Fd 0.8μmol/L和1μL模板(REV的基因组DNA)，加水至25μL。REV-FIP和REV-Fd，ALV-J-FIP和ALV-J-Fd反应前先按上述比例混合加热到85℃5min然后缓慢降到室温。
反应条件：温度按60℃、62℃、64℃、66℃、68℃依次递增反应60min，80℃作用5min灭活。
分别按照上述的反应体系和反应条件进行摸索，获得下述的最佳反应体系和条件：
最佳反应体系如下：25μL LAMP反应体系：2μL dNTPs(10mmol/L，终浓度为0.4mmol/L)、2.5μL 10×Bst bumeqmeqer、1μL Bst DNA聚合酶8U(终浓度为320U/L)、5μL甜菜碱Betaine(5mmol/L，终浓度为1mmol/L)、3μL MgSO4(25mmol/L，终浓度为3mmol/L)、1μL引物(REV-FIP 40μmol/L、REV-BIP 40μmol/L、REV-F3 5μmol/L、REV-B3 5μmol/L、REV-LF20μmol/L、REV-LB20μmol/L、REV-Fd 20μmol/L、ALV-J-FIP 40μmol/L、ALV-J-BIP 40μmol/L、ALV-J-F3 5μmol/L、ALV-J-B3 5μmol/L、ALV-J-LF 20μmol/L、ALV-J-LB20μmol/L、ALV-J-Fd 20μmol/L)；终浓度为REV-FIP 1.6μmol/L、REV-BIP 1.6μmol/L、REV-F3 0.2μmol/L、REV-B3 0.2μmol/L、REV-LF 0.8μmol/L、REV-LB 0.8μmol/L、REV-Fd 0.8μmol/L、ALV-J-FIP1.6μmol/L、ALV-J-BIP 1.6μmol/L、ALV-J-F3 0.2μmol/L、ALV-J-B3 0.2μmol/L、ALV-J-LF0.8μmol/L、ALV-J-LB 0.8μmol/L、ALV-J-Fd 0.8μmol/L和1μL模板(REV的基因组DNA)，加水至25μL。
最佳反应条件：66℃反应60min，80℃作用5min灭活。
为便于基层快速检测，可参照上述最佳反应体系装配检测试剂盒，试剂盒包括有关引物和以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl2。
三、特异性检测
分别以上述一得到REV，ALV-J,马立克氏病病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒DNA或cDNA为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。
LAMP反应结果的判断：
1)使用荧光核酸成像仪：分别使用FAM通道和CY5通道成像，若反应产物颜色变为绿色，则说明样品中含有REV，若反应产物颜色变为红色，则说明样品中含有ALV-J，若反应产物颜色变为黄色，则说明样品中含有REV和ALV-J，若没荧光显色则说明样品中不含有REV和ALV-J。
结果如图1所示，A图为浊度仪扩增结果，B图为荧光核酸成像仪观察结果。可以看出，A中的1-3有扩增曲线，而马立克氏病病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒，和水没有扩增。B中的1呈红色荧光，为ALV-J阳性结果，2呈绿色荧光，REV为阳性结果，3呈黄色荧光，REV和ALV-J混合的阳性结果；马立克氏病病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒，和水没有荧光，呈阴性结果。
四、灵敏度检测
将REV和ALV-J的DNA按10倍倍比稀释至107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、10copies/μL和阴性对照(水)为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。
结果如图2所示，A图为REV和ALV-J的浊度仪扩增结果，可以看出1-6有扩增曲线，7-8无扩增曲线。LAMP对REV和ALV-J混合的DNA的最小检测限为102copies。B图为荧光成像仪的检测结果，其中第一排为REV的敏感性检测结果，可以看出1-6呈绿色荧光，7-8无荧光，对REV的最低检测量为102copies。第二排为ALV-J的敏感性检测结果，可以看出1-6呈红色荧光，7-8无荧光，对ALV-J的最低检测量为102copies。第三排为REV和ALV-J混合的敏感性检测结果，可以看出1-6呈黄色荧光，7-8无荧光，对REV和ALV-J的最低检测量为102copies。
五、对MD临床病料的随机检测
将临床送检的疑似REV和ALV-J感染的病料，抽提基因组DNA为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。
结果如图3所示，2、3、9、10、12、13为REV，1、4、5、7、8、11、16为ALV-J，6、14、15为REV和ALV-J混合感染，17为阴性对照(水)。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒及其引物组
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actcgatgga tgggagtggg atgcatcaat cgtacccgac a 41
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgggcgtcat aagagggcag tttccaccag caagtgtagc 40
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggcgctccc taataaatgg 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaacggaaac cccaagcc 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcttccccgg atattatgct ca 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcttgtaggt ctagggatta cagg 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcccactcc catccatcga gt 22
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctgtttggc tggctaaatc ggagtatcct ctgagcgcct t 41
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatacgaccc tcccttggga ccacggtttg ttccgttctt ga 42
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcacctgct tgataggc 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaccaaaggt aacgcacgt 19
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcagtaacat tagtgacata tccct 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agaattggat attttagggt cccag 25
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgatttagc cagccaaaca gc 22
Claims (9)
1.二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测引物组，其特征在于包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于：所述引物7和引物14为探针，引物7与引物1反向互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团，引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。
3.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于：所述引物1至引物14的摩尔比为8:8:1:1:4:4:4:8:8:1:1:4:4:4。
4.权利要求1所述的检测引物组在环介导等温扩增中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述环介导等温扩增的条件为66℃反应60min，80℃作用5min灭活。
6.二重荧光LAMP区分网状内皮增生症病毒和J亚群禽白血病病毒检测试剂盒，其特征在于包括引物1至引物14，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.14的碱基序列。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：所述引物7和引物14为探针，引物7与引物1互补，引物7在3’端标记5-FAM荧光基团,引物1在5’端标记淬灭基团BHQ-1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记CY5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团BHQ-3。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、MnCl2。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于：所述引物1至引物14在环介导等温扩增反应体系中的终浓度分别为1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L、1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L和0.8μmol/L。
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-
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