CN112795701A

CN112795701A - 一种基于荧光rma法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN112795701A
Application number: CN202110224744.1A
Authority: CN
Inventors: 包建民; 陈大为; 陈龙; 张瑶; 刘志方
Original assignee: Jinan Guoyi Biological Technology Co ltd
Current assignee: Jinan Guoyi Biological Technology Co ltd
Priority date: 2021-03-01
Filing date: 2021-03-01
Publication date: 2021-05-14

Abstract

本申请属于生物技术检测领域，具体为一种基于荧光RMA法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法，所述引物探针组包括检测GI型诺如病毒的引物和探针、检测GII型诺如病毒的引物和探针、检测A型轮状病毒的引物和探针；所述试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。

Description

一种基于荧光RMA法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法

技术领域

本申请属于生物技术检测领域，具体为一种基于荧光RMA法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，RV)是一种双链RNA病毒，属于呼肠孤病毒科。它是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，是导致5岁以下婴幼儿腹泻的主要原因。轮状病毒总共有七个种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G。其中，A种是最为常见的一种，而人类轮状病毒感染超过90％的案例也都是该种造成的。

诺如病毒(Noroviruses，NoV)，又称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses)，属于人类杯状病毒科，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。根据VP1序列的同源性，诺如病毒可分为GI、GII、GIII、GIV、GV五个基因群，其中引起人类感染的主要是诺如病毒GI型和诺如病毒GIII型。

目前轮状病毒和诺如病毒的检测主要有以下几种方法：病毒分离、血清学检测、分子生物学方法等。病毒分离技术操作难度大、周期长，容易导致污染，不适合临床使用。常规的血清学方法检测抗体仅是一个反映感染的间接指标，不能替代直接的病原学检测，无法明确诊断感染病毒的种类。实时荧光PCR法需要经历变温过程，扩增反应时间长，且需要昂贵的仪器设备，以及对检测人员的技术要求较高，不适用于现场快速检测及基层普及应用。重组酶介导扩增(Recombinase Mediated Amplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现诺如病毒和轮状病毒的快速检测。

本申请在荧光RMA法的基础上开发了同时检测GI型诺如病毒(NoV-GI)、GII型诺如病毒(NoV-GII)和A型轮状病毒(RV-A)的试剂盒。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于荧光RMA法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组，包括检测GI型诺如病毒的引物和探针、检测GII型诺如病毒的引物和探针、检测A型轮状病毒的引物和探针，其中：

(1)NoV-GI引物和探针DNA序列为：

NoV-GI-F：

5’-GGCACCATACATTATACCACCACTGACACTGA-3’；

NoV-GI-R：

5’-TGCACGGTACACTGAGTCCATTCTTACCATTA-3’；

NoV-GI-P：

5’-ACCCTTGGCAGATACCAACTTATGGATCAAC(VIC-dT)(THF)(BHQ1-dT)AACTGAAGCCGCTCA(C3-spacer)-3’。

(2)NoV-GII引物和探针DNA序列为：

NoV-GII-F：

5’-TGGACAAATTCAAATTGGCACATGGCAAACTG-3’；

NoV-GII-R：

5’-GTGGTAGTAGGCAATCAATGGCTGGGTTTC-3’；

NoV-GII-P：

5’-ACAAACCTTGCCCCTTCTGTTGCTCCAGTA(TET-dT)(THF)(BHQ1-dT)CCAGGAGAGCGCCT(C3-spacer)-3’。

(3)RV-A引物和探针DNA序列为：

RV-A-F：

5’-AGACAGCGCACCGGATTTGTTTTCCATAAACCT-3’；

RV-A-R：

5’-TGGATTAAAGAACCAAGTAGTCGCGCCATCAGC-3’；

RV-A-P：

5’-CTTAGGCGCGCACTGACTACAGCTACTATAAC(ROX-dT)(THF)(BHQ2-dT)ATTACCTGATGCAGA(C3-spacer)-3’。

优选的，所述NoV-GI的检测探针上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；所述NoV-GII的检测探针上标记的荧光报告基团是TET，荧光淬灭基团是BHQ1；所述RV-A的检测探针上标记的荧光报告基团是ROX，荧光淬灭基团是BHQ2。

一种基于荧光RMA法多重检测诺如病毒和轮状病毒的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。

优选的，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态。

优选的，所述扩增反应试剂包括GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和A型轮状病毒的引物探针组、M-MLV逆转录酶、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200ng/μL；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。

优选的，所述标准阳性质粒为含有NoV-GI、NoV-GII、RV-A基因片段的重组质粒，用于NoV-GI、NoV-GII、RV-A核酸检测的阳性对照。

优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。

优选的，所述试剂盒可以检测的样品为患者粪便、肛拭子、呕吐物等。

一种基于荧光RMA法多重检测诺如病毒和轮状病毒的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本的RNA。

(2)设计用于NoV-GI、NoV-GII、RV-A检测的引物对及探针。

(3)以提取的待测样本RNA作为模板，加入上述NoV-GI、NoV-GII、RV-A检测用的引物对和探针进行荧光RMA扩增反应。扩增反应在温度设定为42℃的实时荧光检测仪中进行，反应时间为20min。

(4)结果分析：在荧光RMA扩增反应过程中，通过实时荧光采集，在扩增结束后，根据是否产生荧光信号判断NoV-GI、NoV-GII、RV-A的阴、阳性。若待检样本包含NoV-GI，则标记VIC的探针产生荧光信号；若待检样本包含NoV-GII，则标记TET的探针产生荧光信号；若待检样本包含RV-A，则标记ROX的探针产生荧光信号。这样，同一反应管内可同时确定GI型诺如病毒(NoV-GI)、GII型诺如病毒(NoV-GII)和A型轮状病毒(RV-A)三种病原体。

有益效果：本申请能在同一反应管内同时检测GI型诺如病毒(NoV-GI)、GII型诺如病毒(NoV-GII)和A型轮状病毒(RV-A)，提高了检测效率；整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法气溶胶污染造成的假阳性结果；采用冻干工艺，提高试剂稳定性，只需一次加样、一步操作，节省检测时间，降低检测成本，同时减少患者不便，减轻患者经济负担。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1荧光RMA法检测GI型诺如病毒(NoV-GI)的灵敏度实验；

图2荧光RMA法检测GII型诺如病毒(NoV-GII)的灵敏度实验；

图3荧光RMA法检测A型轮状病毒(RV-A)的灵敏度实验；

图4荧光RMA法检测GI型诺如病毒(NoV-GI)的特异性实验；

图5荧光RMA法检测GII型诺如病毒(NoV-GII)的特异性实验；

图6荧光RMA法检测A型轮状病毒(RV-A)的特异性实验。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

1、阳性标准质粒的制备

提取NoV-GI、NoV-GII、RV-A的RNA为模板，对NoV-GI、NoV-GII、RV-A的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒。

2、荧光RMA引物与探针的设计

根据诺如病毒的序列保守的VP1基因区域、轮状病毒的序列保守的VP6基因区域设计了特异性荧光RMA引物与探针，具体如表1所示：

表1引物与探针序列

注：NoV-GI检测探针的荧光基团用VIC修饰、淬灭基团用BHQ1修饰，NoV-GII检测探针的荧光基团用TET修饰、淬灭基团用BHQ1修饰，RV-A检测探针的荧光基团用ROX修饰、淬灭基团用BHQ2修饰，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰。

3、荧光RMA反应体系的建立

将42.5μL缓冲液和5μL提取的病原体RNA模板加入到含有扩增反应试剂的检测管中并混匀，后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于实时荧光检测仪中，在42℃反应20min，每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照；

所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态；

所述扩增反应试剂包括GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和A型轮状病毒的引物探针组、M-MLV逆转录酶、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；

所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200ng/μL；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL；

所述标准阳性质粒为含有NoV-GI、NoV-GII、RV-A基因片段的重组质粒，用于NoV-GI、NoV-GII、RV-A核酸检测的阳性对照；

所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应；

4、结果判读

根据是否产生相应的荧光信号，分析待测样本中是否含有NoV-GI、NoV-GII、RV-A。仅产生标记VIC的荧光信号表示为NoV-GI阳性；仅产生标记TET的荧光信号表示为NoV-GII阳性；仅产生标记ROX的荧光信号表示为RV-A阳性；

5、荧光RMA法检测NoV-GI、NoV-GII、RV-A的灵敏度分析

将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释(包括5×10⁴、5×10³、5×10²、5×10¹和5拷贝/反应)，以无菌双蒸水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行荧光RMA反应，每个浓度重复3次试验。根据图1-3可知，5×10⁴-5×10¹结果均为阳性。即，荧光RMA法检测试剂盒的灵敏度达到5×10¹个拷贝/反应；

6、荧光RMA法检测NoV-GI、NoV-GII、RV-A的特异性分析

用建立的荧光RMA方法分别检测GI型诺如病毒(NoV-GI)、GII型诺如病毒(NoV-GII)、A型轮状病毒(RV-A)、柯萨奇病毒A16型(CA16)、肠道病毒71型(EV71)、埃可病毒(ECHO)、星状病毒(AstV)等病原体核酸样本，评价方法的特异性，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图4-6可知，若仅标记VIC的探针产生荧光信号，则检测为NoV-GI阳性，而对NoV-GII、RV-A和其他病原体检测为阴性；若仅标记TET的探针产生荧光信号，则检测为NoV-GII阳性，而对NoV-GI、RV-A和其他病原体检测为阴性；若仅标记ROX的探针产生荧光信号，则检测为RV-A阳性，而对NoV-GI、NoV-GII和其他病原体检测为阴性。说明该荧光RMA法具有良好的检出效果和特异性。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 济南国益生物科技有限公司

<120> 一种基于荧光RMA法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 诺如病毒(Noroviruses GI)

<400> 1

ggcaccatac attataccac cactgacact ga 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 诺如病毒(Noroviruses GI)

<400> 2

tgcacggtac actgagtcca ttcttaccat ta 32

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 诺如病毒(Noroviruses GI)

<400> 3

acccttggca gataccaact tatggatcaa ctttaactga agccgctca 49

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 诺如病毒(Noroviruses GII)

<400> 4

tggacaaatt caaattggca catggcaaac tg 32

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 诺如病毒(Noroviruses GII)

<400> 5

gtggtagtag gcaatcaatg gctgggtttc 30

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 诺如病毒(Noroviruses GII)

<400> 6

acaaaccttg ccccttctgt tgctccagta tttccaggag agcgcct 47

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 轮状病毒(Rotavirus A)

<400> 7

agacagcgca ccggatttgt tttccataaa cct 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 轮状病毒(Rotavirus A)

<400> 8

tggattaaag aaccaagtag tcgcgccatc agc 33

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 轮状病毒(Rotavirus A)

<400> 9

cttaggcgcg cactgactac agctactata actttattac ctgatgcaga 50

Claims

1.一种基于荧光RMA法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组，其特征在于，包括检测GI型诺如病毒的引物和探针、检测GII型诺如病毒的引物和探针、检测A型轮状病毒的引物和探针，其中：

(1)NoV-GI引物和探针DNA序列为：

NoV-GI-F：

5’-GGCACCATACATTATACCACCACTGACACTGA-3’；

NoV-GI-R：

5’-TGCACGGTACACTGAGTCCATTCTTACCATTA-3’；

NoV-GI-P：

(2)NoV-GII引物和探针DNA序列为：

NoV-GII-F：

5’-TGGACAAATTCAAATTGGCACATGGCAAACTG-3’；

NoV-GII-R：

5’-GTGGTAGTAGGCAATCAATGGCTGGGTTTC-3’；

NoV-GII-P：

(3)RV-A引物和探针DNA序列为：

RV-A-F：

5’-AGACAGCGCACCGGATTTGTTTTCCATAAACCT-3’；

RV-A-R：

5’-TGGATTAAAGAACCAAGTAGTCGCGCCATCAGC-3’；

RV-A-P：

2.如权利要求1所述的一种基于荧光RMA法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组，其特征在于，所述NoV-GI的检测探针上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；所述NoV-GII的检测探针上标记的荧光报告基团是TET，荧光淬灭基团是BHQ1；所述RV-A的检测探针上标记的荧光报告基团是ROX，荧光淬灭基团是BHQ2。