CN112852975A - 一种基于荧光rma法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种基于荧光rma法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112852975A
CN112852975A CN202110229035.2A CN202110229035A CN112852975A CN 112852975 A CN112852975 A CN 112852975A CN 202110229035 A CN202110229035 A CN 202110229035A CN 112852975 A CN112852975 A CN 112852975A
Authority
CN
China
Prior art keywords
schistosoma japonicum
detection
nucleic acid
probe
rma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202110229035.2A
Other languages
English (en)
Inventor
陈大为
陈龙
张瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan Guoyi Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Jinan Guoyi Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan Guoyi Biological Technology Co ltd filed Critical Jinan Guoyi Biological Technology Co ltd
Priority to CN202110229035.2A priority Critical patent/CN112852975A/zh
Publication of CN112852975A publication Critical patent/CN112852975A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法；包括检测日本血吸虫的引物对及对应的探针，所述日本血吸虫的检测探针上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；该试剂盒中包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水；所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

Description

一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂 盒及其检测方法
技术领域
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
血吸虫病是一种具有严重危害的人兽共患寄生虫病，广泛分布于亚洲、非洲、南美洲和中东国家。现主要存在6种寄生于人体的血吸虫：日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、间插血吸虫、湄公血吸虫和马来血吸虫。在我国血吸虫病的病原是日本血吸虫(Schistosoma japonicum)，日本血吸虫病主要在中国长江流域和长江以南十三个省、直辖市、自治区流行。日本血吸虫属于扁形动物门、吸虫纲、复殖目、裂体科、血吸虫属、日本裂体吸虫种，雌雄异体。日本血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击，在宿主的血管中存活长达十几年甚至更长时间，血吸虫感染能引起人和家畜的消瘦，重度感染可以造成人和家畜极高的发病率和死亡率。血吸虫病的诊断是血吸虫病防治的中心环节，对化疗目标人群的确定及化疗效果评价、有效控制传染源和降低虫卵对环境的污染具有重要意义。
目前日本血吸虫的检测主要有病原学诊断、免疫学诊断、分子生物学方法。传统的病原学诊断方法如毛蚴孵化法阳性率极低，漏检以及误诊较为常见；免疫学诊断如环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等由于检测的是血吸虫感染后宿主体内产生的抗体，抗体检测窗口期长，不能区分现症感染和既往感染；分子生物学方法主要是荧光定量PCR和LAMP恒温扩增法，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，一定程度上限制了其推广应用，而LAMP方法对引物的要求较高，且特别容易形成气溶胶污染，造成假阳性影响检测结果。
重组酶介导扩增(Recombinase MediatedAmplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现日本血吸虫的快速检测。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组，包括检测日本血吸虫的引物对及对应的探针，其中，
正向引物：5’-GGACCATGAGTGTTACTAACCGGCTGTAGTGGA-3’；
反向引物：5’-AGCTCACATACGCAACTGCCAACGTGACATAAA-3’；
探针：
5’-TGTCGGAGATGGCGGCTTCACGTGCGTGC(VIC-dT)(THF)(BHQ1-dT)GTCCTTCGGGCATTA(C3-spacer)-3’。
优选的，所述日本血吸虫的检测探针上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1。
一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。
优选的，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。
优选的，所述标准阳性质粒为含有日本血吸虫基因片段的重组质粒，用于日本血吸虫核酸检测的阳性对照。
优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)设计用于日本血吸虫核酸检测的引物对及探针；
(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述日本血吸虫核酸检测用的引物对和探针进行荧光RMA扩增反应。扩增反应在温度设定为42℃的实时荧光检测仪中进行，反应时间为20min；
(4)结果分析：在荧光RMA扩增反应过程中，通过实时荧光采集，在扩增结束后，根据是否产生荧光信号判断日本血吸虫核酸的阴、阳性。若待检样本包含日本血吸虫核酸，则标记VIC的探针产生荧光信号。
有益效果：RMA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行，不需要温控设备，30分钟内即可出诊断结果，可以真正实现便携式的快速核酸检测；整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法气溶胶污染造成的假阳性结果；采用冻干工艺，提高试剂稳定性，只需一次加样、一步操作，节省检测时间，降低检测成本。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的灵敏度实验；
图2荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的特异性实验。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1、阳性标准质粒的制备
提取日本血吸虫核酸为模板，对日本血吸虫的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒；
2、荧光RMA引物与探针的设计
根据日本血吸虫的28S rRNA基因区域设计了特异性荧光RMA引物与探针，具体如表1所示：
表1引物与探针序列
Figure BDA0002958177320000041
注：日本血吸虫核酸检测探针的荧光基团用VIC修饰、淬灭基团用BHQ1修饰，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰。
3、荧光RMA反应体系的建立
将42.5μL缓冲液和5μL提取的日本血吸虫核酸模板加入到含有扩增反应试剂的检测管中并混匀，后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于实时荧光检测仪中，在42℃反应20min。每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照；
其中，所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；
所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL；
所述标准阳性质粒为含有日本血吸虫基因片段的重组质粒，用于日本血吸虫核酸检测的阳性对照；
所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应；
所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态；
4、结果判读
根据是否产生相应的荧光信号，分析待测样本中是否含有日本血吸虫核酸。产生标记VIC的荧光信号表示为日本血吸虫核酸阳性；
5、荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的灵敏度分析
将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释(包括105、104、103、102、101和1拷贝/反应)，以无菌双蒸水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行荧光RMA反应，每个浓度重复3次试验。根据图1可知，105-101结果均为阳性。即，荧光RMA法检测试剂盒的灵敏度达到101个拷贝/反应；
6、荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的特异性分析
用建立的荧光RMA方法分别检测日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、华支睾吸虫、布氏姜片吸虫、卫氏并殖吸虫等病原体核酸样本，评价方法的特异性，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图2可知，仅标记VIC的探针产生荧光信号，则检测为日本血吸虫核酸阳性，而对其他病原体检测为阴性。说明该荧光RMA法具有良好的检出效果和特异性。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 济南国益生物科技有限公司
<120> 一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400> 1
ggaccatgag tgttactaac cggctgtagt gga 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400> 2
agctcacata cgcaactgcc aacgtgacat aaa 33
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400> 3
tgtcggagat ggcggcttca cgtgcgtgct ttgtccttcg ggcatta 47

Claims (2)

1.一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组，其特征在于，包括检测日本血吸虫的引物对及对应的探针，其中，
正向引物：5’-GGACCATGAGTGTTACTAACCGGCTGTAGTGGA-3’；
反向引物：5’-AGCTCACATACGCAACTGCCAACGTGACATAAA-3’；
探针：
5’-TGTCGGAGATGGCGGCTTCACGTGCGTGC(VIC-dT)(THF)(BHQ1-dT)GTCCTTCGGGCATTA(C3-spacer)-3’。
2.如权利要求1所述的一种基于荧光RMA法检测日本血吸虫核酸的引物探针组，其特征在于，所述日本血吸虫的检测探针上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1。
CN202110229035.2A 2021-03-02 2021-03-02 一种基于荧光rma法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法 Withdrawn CN112852975A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110229035.2A CN112852975A (zh) 2021-03-02 2021-03-02 一种基于荧光rma法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110229035.2A CN112852975A (zh) 2021-03-02 2021-03-02 一种基于荧光rma法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112852975A true CN112852975A (zh) 2021-05-28

Family

ID=75990917

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110229035.2A Withdrawn CN112852975A (zh) 2021-03-02 2021-03-02 一种基于荧光rma法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112852975A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116904616A (zh) * 2023-09-13 2023-10-20 北京纳百生物科技有限公司 一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测引物、探针及其检测方法和应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116904616A (zh) * 2023-09-13 2023-10-20 北京纳百生物科技有限公司 一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测引物、探针及其检测方法和应用
CN116904616B (zh) * 2023-09-13 2023-12-01 北京纳百生物科技有限公司 一种阔盘吸虫的实时荧光pcr检测引物、探针及其检测方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111074000B (zh) 一种区分asfv野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量pcr检测材料及试剂盒
CN110551853A (zh) 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒
CN106957927A (zh) 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN113322338B (zh) 一种检测志贺氏菌的cda引物组、试剂盒及其应用
CN112322705A (zh) 一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光rma方法
CN112301157B (zh) 一种快速检测猫细小病毒(fpv)的rda方法及试剂盒
CN108754026A (zh) 检测百合南芥菜花叶病毒的试剂盒及检测方法
CN112852975A (zh) 一种基于荧光rma法检测日本血吸虫核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN112831601A (zh) 一种基于荧光rma法多重检测呼吸道合胞病毒亚型的引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN112592992A (zh) 一种基于荧光rma法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒
CN110804677B (zh) 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重pcr检测引物及试剂盒
CN101871016B (zh) 基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒及方法
CN117004774A (zh) 超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒
CN1165862A (zh) 使用扩增后培养步骤扩增和检测靶核酸
CN112795701A (zh) 一种基于荧光rma法多重检测诺如病毒和轮状病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN112760395A (zh) 一种基于荧光rma法多重检测肠道致病菌的引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN106521038B (zh) 一种高灵敏度的bhv‑2实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
AU2020104066A4 (en) Double fluorescent quantitative RT-PCR detection method for Classical swine fever virus and Bovine viral diarrhea virus
CN101871015B (zh) 基于环介导等温扩增技术的鹅细小病毒检测试剂盒及方法
CN112280832A (zh) 一种免抽提的核酸检测方法及试剂盒
CN112852985A (zh) 一种基于荧光rma法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN114164296B (zh) 一种用于检测寡雄腐霉菌的引物探针组合物、试剂盒及应用和检测方法
CN112301151B (zh) 一种快速检测犬瘟热病毒（cdv）的rda方法及试剂盒
CN108754025A (zh) 一种特异性检测百合隐症病毒的试剂盒及其检测方法
CN112301158B (zh) 一种快速检测猪瘟病毒（csfv）的rda方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20210528