CN112852985A - 一种基于荧光rma法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种基于荧光rma法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法；所述引物探针组包括检测结核分枝杆菌的引物和探针，所述探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1；所述试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水；所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

Description

一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试 剂盒及其检测方法
技术领域
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)简称为结核杆菌(tuberclebacilli)，可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为最多。肺结核的临床表现多种多样，早期症状轻，不典型，容易与其它呼吸系统疾病，如气管炎、肺炎等疾病混淆，经常被忽略而导致就诊延迟。因此快速准确检测结核杆菌感染对结核病的预防和治疗极为重要。
结核病常见的诊断方法有痰涂片镜检法、痰结核菌培养、结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验、分子生物学方法等。痰涂片镜检法简单、快速，但灵敏度和特异度都达不到要求；痰结核菌培养是诊断结核病的金标准，但费时较长，一般为2-8周，临床上少用；PPD试验阳性不能区分是结核分枝杆菌的自然感染还是卡介苗接种的免疫反应；分子生物学方法主要是荧光定量PCR和LAMP恒温扩增法，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，一定程度上限制了其推广应用，而LAMP方法对引物的要求较高，且特别容易形成气溶胶污染，造成假阳性影响检测结果。
重组酶介导扩增(Recombinase MediatedAmplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现结核分枝杆菌的快速检测。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组，包括检测结核分枝杆菌的引物和探针，其中，
正向引物：5’-TTCTCTCGGATTGACGGTAGGTGGAGAAGAAGC-3’；
反向引物：5’-CCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAAT-3’；
探针：
5’-ATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGG(FAM-dT)C(THF)C(BHQ1-dT)GGGCAGTAACTGA(C3-spacer)-3’。
优选的，所述探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1。
一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。
优选的，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态，所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。
优选的，所述标准阳性质粒为含有结核分枝杆菌基因片段的重组质粒，用于结核分枝杆菌核酸检测的阳性对照。
优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测痰液样本的DNA。
(2)设计用于结核分枝杆菌核酸检测的引物对及探针。
(3)以提取的待测痰液样本DNA作为模板，加入上述结核分枝杆菌核酸检测用的引物对和探针进行荧光RMA扩增反应。扩增反应在温度设定为42℃的实时荧光检测仪中进行，反应时间为20min。
(4)结果分析：在荧光RMA扩增反应过程中，通过实时荧光采集，在扩增结束后，根据是否产生荧光信号判断结核分枝杆菌核酸的阴、阳性。若待检样本包含结核分枝杆菌核酸，则标记FAM的探针产生荧光信号。
有益效果：RMA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行，不需要特殊设备，30分钟内即可出诊断结果，可以真正实现便携式的快速核酸检测；整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法气溶胶污染造成的假阳性结果；采用冻干工艺，提高试剂稳定性，可长期保存，运输、携带方便，降低试剂成本。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的灵敏度实验；
图2荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的特异性实验。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1、阳性标准质粒的制备
提取结核分枝杆菌核酸为模板，对结核分枝杆菌的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒；
2、荧光RMA引物与探针的设计
根据结核分枝杆菌的16s rRNA基因序列设计了特异性荧光RMA引物与探针，具体如表1所示：
表1引物与探针序列
Figure BDA0002958177470000041
注：结核分枝杆菌核酸检测探针的荧光基团用FAM修饰、淬灭基团用BHQ1修饰，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰。
3、荧光RMA反应体系的建立
将42.5μL缓冲液和5μL提取的结核分枝杆菌核酸模板加入到含有扩增反应试剂的检测管中并混匀，后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于实时荧光检测仪中，在42℃反应20min，每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照；
所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL；
所述标准阳性质粒为含有结核分枝杆菌基因片段的重组质粒，用于结核分枝杆菌核酸检测的阳性对照；
所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应；
所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态；
4、结果判读
根据是否产生相应的荧光信号，分析待测样本中是否含有结核分枝杆菌核酸。产生标记FAM的荧光信号表示为结核分枝杆菌核酸阳性；
5、荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的灵敏度分析
将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释(包括4×105、4×104、4×103、4×102、4×101和4拷贝/μL)，以无菌双蒸水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行荧光RMA反应，每个浓度重复3次试验。根据图1可知，105-101结果均为阳性。即，荧光RMA法检测试剂盒的灵敏度达到4×101拷贝/μL；
6、荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的特异性分析
用建立的荧光RMA方法分别检测结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、鸟分枝杆菌等病原体核酸样本，评价方法的特异性，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图2可知，仅标记FAM的探针产生荧光信号，则检测为结核分枝杆菌核酸阳性，而对其他病原体检测为阴性。说明该荧光RMA法具有良好的检出效果和特异性。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 济南国益生物科技有限公司
<120> 一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 1
ttctctcgga ttgacggtag gtggagaaga agc 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 2
ccgtttacgg cgtggactac cagggtatct aat 33
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 3
atcaggagga acaccggtgg cgaaggcggg tctctgggca gtaactga 48

Claims (2)

1.一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组，其特征在于，包括检测结核分枝杆菌的引物和探针，其中，
正向引物：5’-TTCTCTCGGATTGACGGTAGGTGGAGAAGAAGC-3’；
反向引物：5’-CCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAAT-3’；
探针：
5’-ATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGG(FAM-dT)C(THF)C(BHQ1-dT)GGGCAGTAACTGA(C3-spacer)-3’。
2.如权利要求1所述的一种基于荧光RMA法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组，其特征在于，所述探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1。
CN202110229053.0A 2021-03-02 2021-03-02 一种基于荧光rma法检测结核分枝杆菌核酸的引物探针组、试剂盒及其检测方法 Withdrawn CN112852985A (zh)

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