CN106148548B - 一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和b型诺维氏梭菌的多重pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒及其应用,属于PCR检测试剂盒技术领域。该试剂盒包括以产气荚膜梭菌的α毒素基因为模板设计的引物PrimerF1和PrimerR1,以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)和B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA为模板设计的引物PrimerF2、PrimerR2和PrimerR3。该试剂盒操作方便、省时省力、成本低、特异性高。
Description
技术领域
本发明属于PCR检测试剂盒技术领域,具体涉及一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒及其应用。
背景技术
产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌可引起牛羊痢疾和坏死性肠炎,并可导致动物死亡。这些细菌有时单独感染,有时混合感染,并且在临床上很难鉴别诊断,对及时预防和治疗带来很大的困难。目前对这三种细菌病的诊断方法主要是:分离培养、显微镜观察和PCR检测,但是目前的PCR方法一次只能检测一种细菌,并且没有商品化的试剂盒,费时费力。
如定量检测产气荚膜梭菌的方法,其包括以下步骤:(1)获得患者分泌物并提取其中细菌的基因组DNA;(2)以产气荚膜梭菌α毒素基因为靶基因设计引物和探针,对步骤(1)中获得的DNA 进行荧光定量PCR扩增;(3)制作CT值与所述产气荚膜梭菌的浓度之间的标准曲线,根据步骤(2)的扩增结果,对患者分泌物中的产气荚膜梭菌进行定量。该方法具有高度的特异性、灵敏性和定量准确度,可以检出细菌或病毒 的存在,全部检测过程在2-3小时内可以完成;最低可检出约10个细菌,定量误差小于5%,特异性和试剂稳定性等指标符合有关国家标准。但是该方法只能检测患者分泌物中的产气荚膜梭菌,无法同时检测溶血梭菌和B型诺维氏梭菌,且该方法成本高,需要昂贵的仪器和专业的技术人员才能完成检测。
如一种产气荚膜梭菌检测试剂盒,所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒包括以产气荚膜梭菌的16S rDNA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物:内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。该产气荚膜梭菌检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。但是该试剂盒只能检测产气荚膜梭菌一种细菌,不能同时检测溶血梭菌和B型诺维氏梭菌;而且该方法容易产生气溶胶,造成实验室基因污染,造成假阳性,从而无法判定样品的阴阳性,操作方法繁琐,试剂昂贵,不适合推广应用。
目前还未见有在同一样品中同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的相关报道,也没有商品化的试剂盒。因此对能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒的研究已成为本领域亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足,而提供一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒及其应用,该试剂盒操作方便、省时省力、成本低、特异性高。
本发明采用如下技术方案:
能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒,包括以产气荚膜梭菌的α毒素基因为模板设计的引物PrimerF1和PrimerR1,以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)和B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA为模板设计的引物PrimerF2、PrimerR2和PrimerR3,其中所述引物的序列为:PrimerF1:SEQ ID NO.1,PrimerR1:SEQ IDNO.2,PrimerF2:SEQ ID NO.3,PrimerR2:SEQ ID NO.4,PrimerR3:SEQ ID NO.5。
更进一步地,所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用,包括如下步骤:
步骤一,引物设计:以产气荚膜梭菌α毒素基因为模板,设计引物PrimerF1和PrimerR1;分别以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H),B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA为模板设计引物PrimerF2、PrimerR2、PrimerR3;
步骤二、试剂盒组装:将步骤一设计好的5条引物,分别用灭菌水稀释成10µM,分别标记为F1、F2、F3、F4和F5;将DNA聚合酶预混液标记为试剂T;将DNA分子质量标准DL2000标记为试剂M;将灭菌水标记为试剂W,阳性对照为产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌DNA混合物,标记为P;阴性对照为灭菌水标记为N;将以上试剂全部组装入一个纸盒中,组装好后置于冰箱储存;
步骤三,样品处理:将动物组织样品或肠内容物经研磨或厌氧肉汤培养;
步骤四,样品DNA提取:用细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取;
步骤五,PCR扩增:用设计的5条引物进行PCR扩增,同时设立阴阳性对照,PCR反应体系:12.5µL DNA聚合酶预混液,10µM的5条引物各1µL,模板DNA3µL,加灭菌水至25µL;反应条件为:95℃ 4 min;95℃ 50s,58℃ 45s,72℃ 1min,共35个循环;之后72℃ 7 min;
步骤六,电泳分析:将PCR扩增产物进行电泳:取6 μL PCR扩增产物在质量百分比为1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳,观察结果;
步骤七,结果判定:若扩增产物中存在大小为397 bp的条带则表明样品中存在产气荚膜梭菌;若扩增产物中存在大小为427 bp的条带,则表明样品中存在B型诺维氏梭菌;若扩增产物中有大小为694 bp的条带则表明样品中存在溶血梭菌。
更进一步地,所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用,其中步骤二中所述DNA聚合酶预混液为500µL,所述灭菌水为500µL,所述产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌DNA混合物为100µL;置于冰箱的储存温度为-20℃。
更进一步地,所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用,其中步骤三中样品处理具体为:将动物组织样品或肠内容物经研磨或厌氧肉汤培养12小时。
更进一步地,所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用,其中步骤六中所述琼脂糖凝胶含0.50 μg 的溴化乙锭。
更进一步地,所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用,其中步骤六中所述电泳的条件为以80V电压电泳20min。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
第一,采用本试剂盒可同时对产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌进行检测,同时具有良好的特异性和敏感性;
第二,特异性方面:用本试剂盒检测肉毒梭菌、衣原体、支原体、大肠杆菌、巴氏杆菌和葡萄球菌的基因组扩增结果均为阴性;
第三,敏感性方面:以产气荚膜梭菌为例进行PCR检测,当样品中细菌量为1.2×103 CFU/mL时即可检测出产气荚膜梭菌α毒素基因、溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)以及B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA。
附图说明
图1为用本发明试剂盒中5条引物进行PCR扩增后扩增产物电泳后的示意图,其中,M、DNA分子质量标准;1,2为样品检测结果;3、阳性对照;4、阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。
本试剂盒包含用于检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌的5条引物、PCR扩增预混酶、灭菌水、以及产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌检测的阳性对照和阴性对照DNA。通过DNA分子量标记测定扩增片段的大小,从而确定三种细菌的存在情况。
实施例
1、引物设计:从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/下载产气荚膜梭菌α毒素基因(登录号:L43548),以此基因为模板,采用Primer5.0软件设计一对引物:PrimerF1:5´-GCTAATGTTACTGCCGTTGA-3´,PrimerR1:5´-CCTCTGATACATCGTGTAAG-3´。
依据溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)(基因登录号:AB058931,AB058939),B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA(基因登录号:AB058938)设计3条引物:PrimerF2:5´-AGAATAAACAGAGCTGGAGATG-3´;PrimerR2:5´-TTATGCTAACTTTAGCTG CGTC-3´;PrimerR3:5´- CTGCTGTACCTTCTATGAACC-3´。
2、试剂盒组装:采用引物设计软件(Primer 5.0)设计所需的5条引物,之后送生物公司化学合成,将合成的5条引物分别用灭菌水稀释成10µM,标记为F1、F2、F3、F4和F5;购买商品化的GoTaq DNA聚合酶预混液1支(500µL),标记为试剂T;购买商品化的DNA分子量标记DL2000,标记为试剂M;灭菌水500µL,标记为试剂W,阳性对照(产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌DNA混合物)100µL,标记为P;阴性对照(灭菌水)标记为N;以上试剂全部组装入一个纸盒中,组装好后置于-20℃冰箱储存,可置于冰盒中运输。
3、样品处理:动物组织样品或肠内容物经研磨或厌氧肉汤培养12小时后可直接用于细菌DNA提取。
4、样品DNA提取:采用商品化的细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取。
5、PCR扩增:用设计的5条引物进行PCR扩增,同时设立阴阳性对照。
PCR反应体系:12.5µL GoTaq DNA聚合酶预混液,5条引物各1µL(10µmol/L),模板DNA3µL,加灭菌水至25µL;反应条件为:95℃ 4 min;95℃ 50s,58℃ 45s,72℃ 1min,共35个循环;之后72℃ 7 min。
6.、电泳分析:将PCR扩增产物进行电泳:取6 μL PCR扩增产物在1.5%质量百分比的琼脂糖凝胶(含0.50 μg 的溴化乙锭)中以80V的电压电泳20min,观察结果并拍照。
7、结果判定:若扩增产物中存在大小为397 bp的条带则表明样品中存在产气荚膜梭菌;若扩增产物中存在大小为427 bp的条带,则表明样品中存在B型诺维氏梭菌;若扩增产物中有大小为694 bp的条带则表明样品中存在溶血梭菌。PCR扩增产物电泳后的图片如图1所示,由图1可见在同一块琼脂糖凝胶上电泳后,当DNA分子质量标准、阴阳性对照同时成立时,被检样品1和2电泳道扩增反应出现三条带,大小分别为397bp、427bp和694bp,判定为产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌阳性(+)。
作为本申请的延伸可以用产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的其它基因设计引物,模仿本试剂盒的组分,组建类似的检测试剂盒。
本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
SEQ ID NO.1 GCTAATGTTACTGCCGTTGA
SEQ ID NO.2 CCTCTGATACATCGTGTAAG
SEQ ID NO.3 CCTCTGATACATCGTGTAAG
SEQ ID NO.4 TTATGCTAACTTTAGCTGCGTC
SEQ ID NO.5 CTGCTGTACCTTCTATGAACC
Claims (6)
1.能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒,其特征在于,包括以产气荚膜梭菌的α毒素基因为模板设计的引物PrimerF1和PrimerR1,以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)为模板设计的引物PrimerF2、以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(H)为模板设计的引物PrimerR2、以B型诺维氏梭菌鞭毛蛋白基因FliA为模板设计的引物PrimerR3,其中所述引物的序列为:PrimerF1:SEQ ID NO.1,PrimerR1:SEQ ID NO.2,PrimerF2:SEQ ID NO.3,PrimerR2:SEQ ID NO.4,PrimerR3:SEQ ID NO.5。
2.权利要求1所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一,引物设计:以产气荚膜梭菌α毒素基因为模板,设计引物PrimerF1和PrimerR1;分别以溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)、B型诺维氏梭菌鞭毛蛋白基因FliA为模板设计引物PrimerF2、PrimerR2、PrimerR3;
步骤二、试剂盒组装:将步骤一设计好的5条引物经生化合成后,分别用灭菌水稀释成10μM,分别标记为F1、F2、F3、F4和F5;将DNA聚合酶预混液标记为试剂T;将DNA分子量标准DL2000标记为试剂M;将灭菌水标记为试剂W,阳性对照为产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌DNA混合物,标记为P;阴性对照为灭菌水标记为N;将以上试剂全部组装入一个纸盒中,组装好后置于冰箱储存;
步骤三,样品处理:将动物组织样品或肠内容物经研磨或厌氧肉汤培养;
步骤四,样品DNA提取:用细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取;
步骤五,PCR扩增:用设计的5条引物进行PCR扩增,同时设立阴阳性对照,PCR反应体系为25μL:12.5μL DNA聚合酶预混液,10μM的5条引物各1μL,模板DNA3μL,加灭菌水至25μL;反应条件为:95℃4min;95℃50s,58℃45s,72℃1min,共35个循环;之后72℃7min;
步骤六,电泳分析:将PCR扩增产物进行电泳:取6μL PCR扩增产物在质量百分比为1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳,观察结果;
步骤七,结果判定:若扩增产物中存在大小为397bp的条带则表明样品中存在产气荚膜梭菌;若扩增产物中存在大小为427bp的条带,则表明样品中存在B型诺维氏梭菌;若扩增产物中有大小为694bp的条带则表明样品中存在溶血梭菌。
3.根据权利要求2所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用,其特征在于,步骤二中所述DNA聚合酶预混液为500μL,所述灭菌水为500μL,所述产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌3种细菌DNA混合物为100μL;置于冰箱的储存温度为-20℃。
4.根据权利要求2所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用,其特征在于,步骤三中样品处理具体为:将动物组织样品或肠内容物经研磨或厌氧肉汤培养12小时。
5.根据权利要求2所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用,其特征在于,步骤六中所述琼脂糖凝胶含0.50μg的溴化乙锭。
6.根据权利要求2所述的能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测试剂盒在同时测试产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌中的应用,其特征在于,步骤六中所述电泳的条件为以80V电压电泳20min。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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